TGCTGT-3’ (SEQ ID NO:5)
引物 P2:RKMDH2R2: 5，-CCGCTCGAGGAGCTTGGAGCCCTGGATGA-3’ (SEQ ID NO:6)
PCR扩增体系(50 μ L)组成如下:
5XFast Pfu Buffer10 μ L
dNTP (2.5 Mmol/L)5 yL
cDNA1 μL
RKMDH2F2 (10 Mmol/L)1 yL
RKMDH2R2 (10ymol/L)1 yL
Fast Pfu DNA polymerase (5U/μ L) 1 μ L 无菌ddH20补足至50 μ L ;
扩增条件:94°C变性4min，再用94°C 45s、59°C 45s、72°C 1.5min进行30个循环，最后72°C lOmin ;取纯化的PCR产物和质粒pET32a分别用BanR I和ZAol酶切过夜，50 μ LPCR 产物双酶切体系:PCR 产物 25 μ 1，10 X Tango Buffer 10ul，BamH I 2ul 和 Xho I 1.5μ L，用灭菌的双蒸水补齐，37°C酶切过夜；50 μ?质粒pET_32a双酶切体系:质粒pET_32a15 μ 1,10XTango Buffer 10 μ 1，BaiM I 2μ?^ΡΖΑο I1.5 μ L，用灭菌的双蒸水补齐，37°C酶切过夜。用凝胶回收试剂盒对酶切产物进行纯化和回收；再将回收片段进行连接，连接体系(10 μ L):纯化的PCR产物和表达载体pET-32a按7:1的比例用0.5 μ L的T4 DNA连接酶，Τ4 Buffer 1 μ L，16°C连接过夜。连接产物转入大肠杆菌DH5 α感受态细胞中。37°C振荡培养lh后，涂布在含氨苄的LB培养基平板，37°C培养箱中培养12h，挑取平板上的转化子进行菌落PCR，筛选阳性克隆，构建获得重组表达质粒命名为pET32aRKMDH2，该质粒图谱如图1所示，进一步酶切分析和测序分析也证明重组质粒的正确性。
[0013]实施例3:苹果酸脱氢酶基因欣在大肠杆菌BL21中的诱导表达 1、苹果酸脱氢酶蛋白RKMDH2的诱导表达及纯化
为了验证该基因编码蛋白的活性，将1 μ g重组质粒pET32aRKMDH2加入50 μ 1大肠杆菌BL21感受态细胞中，，将整个体系冰浴30min之后于42°C热击90s，再次冰浴2min，然后加入950 μ L LB液体培养基于37°C、lOOrpm振荡孵育lh。孵育结束后，5000rpm离心lOmin，留下约80 μ L悬浮沉淀菌体并涂布于含有氨苄青霉素(Amp+)的LB固体平板，37°C倒置培养10h。挑取阳性转化子阳性克隆验证后，再接入100 mL LB (含100 μ g/mL氨苄霉素)的液体培养基中，37 °C振荡培养过夜，将富集的菌液按1%比例接种到1L LB液体培养基中，于37°C，160rpm培养至0D600值约为0.8。取5ml菌液作为空白对照，其余加入IPTG至终浓度为lmmol/L，于15°C恒温摇床80 rpm诱导培养8小时，12000 rpm离心15min收集菌体。SDS-PAGE分析显示，pET32aRKMDH2转化的大肠杆菌中表达出一条分子量约为53kD的蛋白(见图3泳道3)，但在空载体pET32a ( + )转化的大肠杆菌中没有(见图3泳道2)。
[0014]进一步将该菌体悬浮于适量(使菌悬液的0D_?20)30 mM的咪唑缓冲液中，冰上超声破碎细胞，4°C、14000 rpm离心15 min，上清和沉淀分别用SDS-PAGE电泳检测，电泳检测发现目的蛋白pET32aRKMDH2是以包涵体的形式存在。首先对包涵体进行纯化:将破菌后的沉淀用PE缓冲液(20mmol/L磷酸钠，ImM EDTA pH7.2)重悬，用移液枪吹打混匀，于4°C、12000rpm离心15min收集沉淀，再用2mol/L的脲重悬沉淀振荡混勾静置20min后，于4°C，12000rpm 离心 30min 收集沉淀，用 30mL Triton X-100 (0.5%) EDTA(10mmol/L)的溶液重悬沉淀，充分混匀后离心收集沉淀。最后再用PE缓冲液洗涤沉淀2-3次以出去残留的去污剂。对纯化后的包涵体进行变性:将纯化后的包涵体用变性缓冲液(lOOmmol/L Tris-HClpH7.6，8mol/L脲，lOmmol/L DTT)溶解后，置于37°C恒温培养箱中变3_4h。将变性的包涵体溶液直接加入到1L的透析缓冲液中(100mmoL/L Tris-HCl缓冲液ρΗ7.6，5mmol/L β -巯基乙醇)。在4°C透析24h，中间换两次缓冲液以彻底透析复性。
[0015]将复性的蛋白质4°C、12000rpm离心15min，取上清液用0.2 μπι的微型滤膜过滤，滤液上样于已用10mM咪卩坐缓冲液平衡好的His Trap HP柱(1 ml, GE Healthcare)，用200mM咪唑缓冲液进行洗脱，洗脱液用离心管按顺序收集，洗脱样品用SDS-PAGE电泳检测，获得一纯蛋白条带(见图3泳道4)。
[0016]2、苹果酸脱氢酶RKMDH2的酶活测定苹果酸脱氢酶是调控苹果酸代谢的关键酶，可以催化苹果酸进行脱氢氧化，伴随着产生草酰乙酸和NADH。由于MDH的酶活在一定的反应时间内与反应产物NADH的浓度变化呈线性关系，所以MDH的活性可通过检测NADH的浓度变化来测定。以苹果酸和NAD ( + )为底物加入苹果酸脱氢酶进行反应，用紫外分光光度计在340nm处测定酶活，MDH酶活的计算:单位定义:一个酶活力单位是指25°C时每分钟生成lnmol NADH所需的酶量。
[0017]苹果酸脱氢酶酶活计算公式:
E=[(Ae/At) XVtXdf]/( ε XDXVsXC)
=[(0.207-0.194) X 1.9 X 95] / (6.22 X 1 X 0.02 X 0.3445)
=54.748U/mg
Vt-----反应溶液总体积(ml)
ε-----340nm处测定的NADH的吸光度为6.22
D-----光路长(lcm)(比色皿直径)
Vs-----酶液体积(ml)
C-----蛋白质浓度(mg/ml)
A e/ Δ t----lmin内340nm处吸光度的变化 df---稀释因子
结果显示，所纯化的苹果酸脱氢酶RKMDH2的酶活为54.748U/mg，表明基因重组载体在大肠杆菌BL21中诱导表达出来的蛋白RKMDH2具有苹果酸脱氢酶的活性。
【主权项】
1.一种苹果酸脱氢酶基因欣其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。2.一种含有权利要求1所述苹果酸脱氢酶基因欣的重组表达载体。
【专利摘要】本发明公开了一种从红冬孢酵母YM25235中分离的编码苹果酸脱氢酶的核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO：1所示，该基因编码的氨基酸序列如SEQ？ID？NO：2所示，通过构建重组载体并在大肠杆菌中表达，表达产物具有苹果酸脱氢酶功能，能催化苹果酸转化成草酰乙酸。
【IPC分类】C12N15/70, C12N15/53
【公开号】CN105296509
【申请号】CN201510782491
【发明人】张琦, 肖虎, 季秀玲, 魏云林, 林连兵
【申请人】昆明理工大学
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年11月16日