拉沙热病毒样颗粒、其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种拉沙热病毒样颗粒、其制备方法与应用，属于免疫学及基因工程
技术领域。
【背景技术】
[0002] 拉沙热化assafever)是一种急性病毒性疾病，其病原为拉沙热病毒化assa virus,LASV)。在20世纪50年代首次发现拉沙热的发生，但直到1969年才分离出拉沙热 病毒。其临床症状表现差异很大，导致诊断非常困难。拉沙热主要在西非流行，据统计，每 年西非LASV感染者超过20万人，造成3000多人死亡。LASV感染的主要途径是与拉沙热病 人和纳塔尔种多乳房鼠（Mastomysnatalensis)(-种广泛分布、高度共栖的晒齿类动物） 接触。最近报道有旅客经商务飞机将LASV传入德国、荷兰、英国和美国，表明该病原体高危 险、高传染性，有传入我国的可能。LASV被列为A类生物武器制剂，在世界范围内，拉沙热一 直是公共卫生方面受关注的一个焦点，但是目前尚没有批准的拉沙热疫苗。 阳00引 LASV是一种两节段的单股负链RNA病毒，有包膜，表面覆盖长约8~IOnm的方形 树突，属沙粒病毒科（Arenaviridae)的旧世界群（OldWorldgroup)。LASV基因组由两节 段的双义（ambisense)单链RNA组成，编码5个结构蛋白，分别是3. 4化的S链和7. 2化的 L链。S链的两个基因编码核蛋白（NP)、包膜糖蛋白GPl和GP2。L链的两个基因编码病毒 聚合酶蛋白（L)和Z蛋白。GPl与GP2蛋白，是由G基因编码的自U体糖蛋白GPC经翻译后裂 解而来，GPl与GP2W四聚体形式构成横跨病毒囊膜的表面纤突，其上具不同抗原决定簇， 与病毒的中和作用有关。
[0004] 近年来，应用病毒样颗粒作为疫苗逐渐受到重视，特别是生物安全要求高的烈性 病毒。病毒样颗粒是由病毒的结构蛋白自主包装形成，与天然病毒的形态一致，且能够诱导 机体产生细胞免疫和体液免疫。且病毒样颗粒不包裹核酸，不能复制，因此也没有感染性， 是一种安全的抗原。
[0005] 目前尚无利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统制备拉沙热病毒样颗粒方面的报道。 因此，探索拉沙热病毒样颗粒的制备方法，应对日趋严峻的拉沙热疫情防控形势成为亟待 解决的问题。
【发明内容】
[0006] 本发明针对现有技术的不足，提供一种利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统高效制 备拉沙热病毒样颗粒的方法。
[0007] 本发明的另一目的是提供拉沙热病毒样颗粒及其应用。
[0008] 本发明的技术方案如下：
[0009] 一种拉沙热病毒样颗粒的制备方法，包括W下步骤：
[0010] (1)合成拉沙热病毒Z基因、拉沙热病毒N基因和拉沙热病毒GPC基因； W11] 所述拉沙热病毒Z基因的核巧酸序列如SEQIDNO: 1所示；拉沙热病毒N基因的 核巧酸序列如SEQIDNO: 3所示；拉沙热病毒GPC基因的核巧酸序列如SEQIDNO: 5所示；
[0012] (2)将步骤（1)制得的拉沙热病毒Z基因、拉沙热病毒N基因和拉沙热病毒GPC基 因分别插入到昆虫细胞表达载体中，转化含有重组杆状病毒基因组的大肠杆菌DHlOBac感 受态细胞，提取阳性质粒，制得整合了拉沙热病毒Z基因、拉沙热病毒N基因和拉沙热病毒 GPC基因的重组杆状病毒Bacmid质粒；
[001引 做将步骤似制得的重组杆状病毒Bacmid质粒分别转染昆虫细胞，捶救获得整 合了拉沙热病毒Z基因的重组杆状病毒、整合了拉沙热病毒N基因的重组杆状病毒、整合了 拉沙热病毒GPC基因的重组杆状病毒；
[0014] (4)将步骤（3)制得的整合了拉沙热病毒Z基因的重组杆状病毒、整合了拉沙热病 毒N基因的重组杆状病毒、整合了拉沙热病毒GPC基因的重组杆状病毒混合后接种昆虫细 胞，培养后收获上清，上清经纯化，制得拉沙热病毒样颗粒。
[0015] 上述拉沙热病毒Z基因的GenBank登录号为：KM821898,拉沙热病毒N基因的 GenBank登录号为：KM821845,拉沙热病毒GPC基因的GenBank登录号为：KM821845。
[0016] 根据本发明优选的，所述步骤（2)中，昆虫细胞表达载体选自：AcRP23-lacZ、 AcRP6-SC、AcUWl-lacZ、BacPAK6、BactoPac、Bacmid、p2Bac、p2Blue、BlucBacII、p89B310、 pAc360、pAc373、pAcAB3、pAcAB4、PAcAS3、pAcC129、pAcC4、DZI、pAcGP67、pAcIEl、pAcJPl、 pAcMLF2、pAcMLF7、pAcMLF8、pAcMPl、pAcMP2、pAcRP23、pAcRP25、pAcRW4、pAcsMAG、pAcUWl、 pAcUW21、pAcUW2A、pAcUW2B、pAcUW3、pAcUW31、pAcUW41、pAcUW42、pAcUW43、pAcUW51、 pAcVC2、pAcVC3、pAcYMl、pAcJcC5、pBacl、pBac2、pBlueBacIII、pBlueBacHis、pEV55、mXIV、 pIEINeo、pJVEll、pJVNhel、pJVPlO、pJVrsMAG、pMBac、pPlO、pPAKl、pPBac、pSHONEXI. 1、 pSYNXIVVI+、pSYNVI+wp、pSYNXIVVI-、pVL1391、pVL1392、pVL1393、pVL941、p化 945、 P化 985、pVTBac、pBM030、pUAC-5、pFas巧acDual、pFastBacl、pFastBac肌A、pFas巧ac肌 B、pFas巧ac肌C、pFas巧acDual之一或两种W上的纔合；进一步优选的，所述步骤（2)中， 昆虫细胞表达载体为pFas巧acl。
[0017] 根据本发明优选的，所述步骤（2)中，重组杆状病毒为重组首猜银纹夜蛾核型多 角体病毒rAcMNPV。
[0018] 根据本发明优选的，所述步骤（3)中，昆虫细胞选自草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda)Sf21细胞系、昆虫细胞选自草地贪夜蛾（Spodopterafrugiperda)Sf9细 胞系、昆虫细胞选自草地贪夜蛾（Spodoptera化ugiperda)MimicS巧细胞系、甜菜夜蛾 (Spodopteraexigua)Se301 细胞系、BCI化/AMCY-SeE-化Gl细胞系、BCI化/AMCY-SeE-化G4 细胞系、粉纹夜蛾灯richoplusianOBTI-l'n-SBl-A细胞系、BTI-I^-SCl细胞系、 BTI-I^-SFS细胞系，斜纹贪夜蛾（SpodopteraIitura)ZSU-Sl-I细胞系、细胞 系、家蚕卵巢细胞系BmN之一；进一步优选的，昆虫细胞选自昆虫细胞选自草地贪夜蛾 (Spodopteraf;rugiperda)Sf9 细胞系。
[0019] 根据本发明优选的，所述步骤（4)中，昆虫细胞选自草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda)Sf21细胞系、昆虫细胞选自草地贪夜蛾（Spodopterafrugiperda)Sf9细 胞系、昆虫细胞选自草地贪夜蛾（Spodoptera化ugiperda)MimicS巧细胞系、甜菜夜蛾 (Spodopteraexigua)Se301 细胞系、BCI化/AMCY-SeE-化Gl细胞系、BCI化/AMCY-SeE-化G4 细胞系、粉纹夜蛾灯richoplusianOBTI-l'n-SBl-A细胞系、BTI-I^-SCl细胞系、 BTI-I^-SFS细胞系，斜纹贪夜蛾（Spodopteralitura)ZSU-Sl-I细胞系、细 胞系、家蚕卵巢细胞系BmN之一；进一步优选的，昆虫细胞选自草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda)Sf9 细胞系。
[0020] 根据本发明优选的，所述步骤（4)中，整合了拉沙热病毒Z基因的重组杆状病毒 (AcMNPV-Z)、整合了拉沙热病毒N基因的重组杆状病毒（AcMNPV-N)、整合了拉沙热病毒GPC 基因的重组杆状病毒（AcMNPV-GPC)按MOI(感染复数）比例2 :1 :1混合。
[0021] 根据本发明优选的，所述步骤（4)中，纯化为采用薦糖密度梯度离屯、进行纯化，薦 糖质量体积浓度为20 %、30 %和60 %，单位g/mL。质量体积浓度30 %和60 %之间得到纯化 拉沙热病毒样颗粒。 阳022] -种拉沙热病毒样颗粒，包含拉沙热病毒Z蛋白、拉沙热病毒N蛋白、拉沙热病毒 Gl蛋白、拉沙热病毒G