巧光报告基团和泽灭基团选择所用的仪器的型号设置可检测的巧光信号范围。本发明 实施例提供的巧光探针巧光报告基团：FAM、肥X、TET和FAM的激发波长为470-65化m，接收波 长为500-700nm;泽灭基团:Eclipse、TAMRA、B册1。引物合成后的纯化方式可W为:HAP、PAGE 和HPLC纯化方式。
[0062] 【实施例2】构建含有FOXOl基因突变型和野生型的DNA片段的重组质粒一、人子宫 内膜癌Ishikawa细胞系培养与传代
[0063] 1)细胞培养
[0064] 所有细胞系使用RPMI-1640培养基（Invitrogen，Carlsbad，CA)，10 % 胎牛血清 (Invit;rogen,(^i;rlsbad,CA)，于37°C、5%C02环境下培养。
[0065] 2)细胞传代
[0066] 首先使用灭菌吸管将细胞培养皿中的培养液吸出，加入PBS缓冲液清洗2遍，往细 胞中慢慢滴加适量膜蛋白酶，待细胞变圆，调整角度细胞能够移动后加入3ml的含10%胎牛 血清的DMEM培养基，反复轻轻吹打后，显微镜下观察细胞形态并计数，根据培养皿中细胞的 含量将适量的细胞传代至其他灭菌的培养皿中，加入5ml的DMEM培养基后放入5%C02培养 箱。
[0067] 细胞计数公式(个/ml): (4大格细胞总数）X IO4X稀释倍数/4 [006引二、总RNA的提取
[0069] 1)倒掉培养基，PBS清洗后，直接将Iml Trizol注入培养瓶（其中细胞5X IO6个/ ml)，反复抽吸均匀；
[0070] 2)在装有裂解物的离屯、管中加入0.2ml的氯仿(为Trizol总体积的1/5)，振荡混均 30秒，室溫下静置5分钟；
[0071] 3)12000巧m 4°C离屯、15分钟，分相为S层。上层:RNA(约为IYizol的60%);中间： DNA;下层:蛋白质(酪-氯仿）；
[0072] 4)小屯、吸取上清液，转移到另一 EP管中。Iml裂解物产生的上清液体积约为0.4~ 0.6ml。有机相和中间层含有DNA和蛋白质，避免触及；
[0073] 5)上清液加入约0.5ml的异丙醇，振荡混均30秒。室溫下静置10分钟；
[0074] 6) 12000巧m 4°C离屯、10分钟；
[0075] 7)RNA沉淀将在离屯、底的侧面形成。小屯、吸弃上清液，注意避免吸弃RNA沉淀；
[0076] 8)离屯、管加入1ml预冷的75%乙醇（Iml化izol至少Iml乙醇清洗DNA)，振荡混均 30秒，使沉淀振荡起来，室溫1200化pm离屯、1~2分钟。尽可能吸弃上清液，防止RNA沉淀丢 失。重复W上清洗步骤一次。在75%乙醇中，RNA在4°C至少保存1周，一20°C至少保存1年；
[0077] 9)室溫选择流动性小，倒置离屯、管于滤纸上，干燥RNA，但不能完全干燥（5~10分 钟）。用DEPC水15化溶解沉淀，55-60°C解育10~15分钟。
[007引 10)RNA纯度检测
[00巧]滴加化L RNA溶液于超微量分光光度计（型号：P330-311)，并读取仪器中0D260/ 0D280比值。
[0080] S、构建重组质粒
[0081 ] 1)将含有FOXOl基因突变型和野生型的DNA片段进行PCR扩增；
[0082] 2)将PCR产物进行双酶切；
[0083] 载体和PCR产物分别用一下条件进行双酶切（反应体系均为30ul，37°C，酶切2小 时)；
[0084] 3)将双酶切产物电泳后割胶回收(按照试剂盒说明书进行操作）；
[0085] 4)将酶切产物与质粒载体进行连接；
[0086] 上述双酶切产物经过纯化(其中载体酶切产物割胶回收，PCR片段酶切后纯化步骤 与上述PCR产物纯化步骤相同），在T4 DNA连接酶作用下16°C连接过夜。连接体系如下：载 体，2ul;PCR片段，6ul;10xT4 buffer，Iul; T4 DNA Iigase，Iulo
[0087] 5)转化大肠杆菌感受态；
[0088] 取上述连接液扣1转化到预先制备的DH5a化学感受态细胞中，冰浴30分钟，42°C热 激2min,置冰上5min，加入1mlLB培养液37°C摇床45min，离屯、5000巧m，l-5min(不要离屯、太 久，W免太实），最后均匀涂布在含有l(K)ng/ml抗生素的LB平板上（100-150U1)。将平板在37 °C倒置培养过夜。挑取阳性克隆菌落转划到另一块含有lOOng/ml抗生素的LB平板上，并对 之进行编号，37°C倒置培养过夜。
[0089] 6)QIAGEN试剂盒抽提质粒(按照说明书进行），制成参考品。
[0090] 【实施例3】实时巧光定量PCR法扩增样本
[0091] 取提取的总RNA 1-扣g，加入PCR反应液，PCR反应液包括:无菌水、具有5 ' 一3 '外切 活性的DNA聚合酶、dNTPs、10 X PCR Buff er、RNASIN、M-MLV逆转录酶、〇1 igo(肌)和含Mg离子 的溶液。其中，浓度为抓/化的具有5 '一3 '外切活性的DNA聚合酶0 .化L，浓度为lOmmol/L的 dNTPs化L，10XPCRBuffe巧化，浓度为40UA^L的RNASIN0.化L，浓度为200UA^L的M-MLV逆 转录酶0.化L，浓度为25mmol/L的MgCl2溶液扣L，添加无菌水至体积为50化。其中，具有5 ' ^ 3 '外切活性的DNA聚合酶可W为化q酶。
[0092] PCR扩增:将各反应管放入巧光定量PCR仪器的反应槽内，设置标记巧光基团种类、 样品名称及类型，选择要用的化qman巧光探针(本产品巧光报告基团为FAM、肥X、TAT，巧光 泽灭基团为Eclipse),定义样品孔，并按下表提供的扩增程序进行PCR扩增：
[0093] 表1为PCR扩增反应扩增程序
[0094]
[00M]在扩增程序的第=步的终了读取巧光值；
[0096] 数据分析判断：
[0097] 同时选定所检样本与该样本检测位点对应的突变型和野生型参考品孔，对比=孔 PCR扩增曲线(CTa表示样本孔CT值，CTw表示野生型CT值，CTm表示突变型CT值）：
[009引当CTm含CTa<CTw时，表明该样本存在突变；
[0099] 当CTw=CTa时，表明该样本为野生型。
[0100] 图1是本发明实施例中所述肤核酸质谱图；
[0101] 图2是本发明实施例中所述R609C突变型和野生型参考品PCR扩增图，图中上、中、 下S条线各表示FOXOl第609位密码子突变型参考品、样本W及野生型参考品的扩增曲线；
[0102] 图3是本发明实施例中所述D624N突变型和野生型参考品PCR扩增图，图中上、中、 下S条线各表示FOXOl第624位密码子突变型参考品、样本W及野生型参考品的扩增曲线；
[0103] W上实施例仅用来说明本发明的技术方案，而非对其进行限制，尽管参照前述实 施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可W对前述实施 例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，而运些修改或者 替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
【主权项】
1. 一种用于叉头转录因子01F0X01基因突变检测的试剂，其特征在于，包括用于阻断野 生型F0X01基因扩增的野生型PNA序列、用于特异性扩增R609C、D624N突变型F0X01基因序列 的一组引物对及突变型PNA荧光探针： 所述检测F0X01基因 R609C突变正向引物如序列表中SEQ ID N0.1; 所述检测F0X01基因 R609C突变反向引物如序列表中SEQ ID N0.2; 所述检测F0X01基因 D624N突变正向引物如序列表中SEQ ID N0.3; 所述检测F0X01基因 D624N突变反向引物如序列表中SEQ ID N0.4; 所述检测F0X01基因 R609C突变PNA荧光探针如序列表中SEQ ID N0.5; 所述检测F0X01基因 D624N突变PNA荧光探针如序列表中SEQ ID N0.6; 所述特异性结合包含F0X01基因609密码子野生型PNA序列如序列表中SEQ ID NO.7; 所述特异性结合包含F0X01基因624密码子野生型PNA序列如序列表中SEQ ID NO.8; 所述PNA荧光探针的5'端的荧光报告基团为:FAM、HEX、TET、J0E、VIC、R0X、Cy3SCy5,3' 端的淬灭基团为：TAMRA、Eclipse、BHQl、BHQ2、BHQ3SDABCYL。2. 根据权利要求1所述的用于叉头转录因子01F0X01基因突变检测的试剂，其特征在 于，所述的检测试剂还包括PCR反应液、609密码子和624密码子突变型参考品、609密码子和 624密码子野生型参考品；其中PCR反应液包括:DEPC水、具有5 ' -3 '外切活性的DNA聚合酶、 dNTPs、10XPCR Buffer、RNASIN、M-MLV逆转录酶、oligo(dT)和含Mg离子的溶液;所述609密 码子突变型参考品为含SEQ NO. 9的重组质粒DNA;所述609密码子野生型参考品为含SEQ NO. 10的重组质粒DNA;所述624密码子突变型参考品为含SEQ NO. 11的重组质粒DNA;所述 624密码子野生型参考品为含SEQ NO. 12的重组质粒DNA。3. 根据权利要求2所述的用于叉头转录因子01F0X01基因突变检测的试剂，其特征在 于，所述具有5 ' -3 '外切活性的DNA聚合酶为Taq酶。4. 根据权利要求3所述的用于叉头转录因子01F0X01基因突变检测的试剂，其特征在 于，所述PCR反应液各组分在PCR扩增反应体系中的终浓度为:Taq酶0.01U/yL~0.05U/yL， dNTPs 0.2~0.6mM，10XPCR Buffer lX，RNASIN40U/yL~60U/yL，M-MLV逆转录酶200UAxL ~320U/yL，MgCl2 1.5~5. OmM，溶剂为DEPC水;所述正向引物的终浓度为0.05~0.9μΜ，所 述反向引物的终浓度为〇. 05~0.9μΜ，所述oligo(dT)终浓度为0.05~0.9μΜ，所述互补ΡΝΑ 序列终浓度为0.05~0.9μΜ，所述荧光探针的终浓度为0.05~0.9μΜ。5. 根据权利要求1-4任一项所述的用于叉头转录因子01F0X01基因突变检测的试剂，其 特征在于，所述的试剂进行实时荧光定量PCR的反应程序为:42°C逆转录20min;94°C预变 性，2min; 95°C变性，30s，58°C，45s，此时收集荧光，进行40个循环。6. 权利要求1-5所述的试剂在制备检测癌细胞的检测试剂中的应用，所述癌细胞为宫 内膜癌、前列腺癌。
【专利摘要】本发明公开了一种用于叉头转录因子O1（FOXO1）基因突变检测的试剂、PCR检测方法及应用，属于基础生物研究及生物检测技术领域。检测试剂包括引物、肽核酸荧光探针及野生型互补的肽核酸序列，正向引物如序列表中SEQ ID NO.1、NO.3；反向引物如序列表中SEQ ID NO.2、NO.4；肽核酸荧光探针如序列表中SEQ ID NO.5、NO.6；野生型互补肽核酸序列如序列表中SEQ ID NO.7、NO.8。本发明从转录水平能快速发现Wnt信号通路中FOXO1基因突变情况，具有特异性强、灵敏度高等显著优点，为抗癌药物筛选，新靶向药物探讨、基础科学研究提供工具。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105713985
【申请号】CN201610257135
【发明人】周策凡, 唐景峰, 陈兴珍, 张毅, 秦文英
【申请人】湖北工业大学
【公开日】2016年6月29日
【申请日】2016年4月22日