专利名称：细菌的[2Fe-2S]二羟酸脱水酶的鉴定和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及工业微生物学领域和二羟酸脱水酶活性的表达。更具体地讲，鉴定了具有[2i^e-2S]簇的细菌二羟酸脱水酶，并使其在细菌和酵母宿主中作为异源蛋白质被表达。
背景技术：
二羟酸脱水酶(DHAD)，也叫乙酰羟酸脱水酶，催化2，3_ 二羟基异戊酸转化为 α -酮异戊酸和2，3- 二羟基甲基戊酸转化为α -异亮氨酸酮酸。被分类为Ε. C. 4. 2. 1. 9的 DHAD酶是天然存在的生产缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和泛酸(维生素Β5)的生物合成途径的部分。对于增强的支链氨基酸或泛酸的微生物生产，活性DHAD的提高的表达是合乎期望的。
2，3- 二羟基异戊酸向α _酮异戊酸的DHAD催化的转化也是共同拥有和共同未决的美国专利申请公布US 20070092957 Al中所公开的多种异丁醇生物合成途径的共同步骤。本文公开的是用于生产异丁醇的重组微生物的改造。异丁醇作燃料添加剂是有用的， 其可用性可减少对石油化学燃料的需求。
为了提高在包括了二羟酸脱水酶的途径中合成的化合物的生产，在所关注的生产宿主中表达提供这种酶活性的异源酶是合乎期望的。由于这种酶需要i^e-S簇，而这种需求涉及i^e-S簇的可获得性和其向DHAD脱辅基蛋白中的正确装载，二羟酸脱水酶在异源宿主中功能性的高表达的获得是复杂的。
需要!^e-S簇的DHAD是本领域已知的，并且被发现以或[2i^e_2S]形式存在。一些细菌的此类酶是已知的，其中被最好地表征的是来自大肠杆菌的(E. coli) (Flint, DH，等人(1993) J.Biol· Chem. 268 14732-14742)。然而，这些细菌的酶均为[4Fe-4S]形式。 迄今报道的惟一 [2iie-2S]形式是一种菠菜酶(Flint 和 Emptage (1988) J. Biol. Chem. 263 3558-3564)。
由于[2i^e-2S]形式在i^e-S簇的合成和/或组装方面造成的负担更小，在宿主细胞中使用[2i^e-2S]形式的这种酶以提高所引入的生物合成途径的生产是合乎期望的。遗憾的是，这种酶仅有一种[2i^e-2S]形式是已知的。
因此，存在对鉴定DHAD的新的[2i^e-2S]形式以用于重组宿主细胞中的需求，其中所述重组宿主细胞中，2，3- 二羟基异戊酸转化为α -酮异戊酸是所期望的生物合成途径中的代谢途径步骤。
发明概述 本文提供了鉴定[2!^e-2S]DHAD酶的方法，所述方法包括 a)用序型隐蔽马尔科夫模型(Profile Hidden Markov Model)查询一种或多种氨基酸序列，所述序型隐蔽马尔科夫模型是使用SEQ ID NO :164、168、230、232、298、310、344 和346的蛋白质制备的，其中具有小于10_5的E值的匹配提供了第一序列子集，从而所述第一序列子集对应于一种或多种DHAD相关蛋白质； b)分析步骤(a)的对应于一种或多种DHAD相关蛋白质的第一序列子集中三个保守的半胱氨酸的存在，从而鉴定出编码[2i^e-2S]DHAD酶的第二序列子集，其中所述三个保守的半胱氨酸对应于变异链球菌(Streptococcus mutans) 二羟酸脱水酶氨基酸序列(SEQ ID NO 168)的 56、129 和 201 位；以及 c)分析步骤(b)的第二序列子集中特征保守氨基酸的存在，从而进一步鉴定出编码[2i^e-2S]DHAD酶的第三序列子集，其中所述特征保守氨基酸的位置对应于变异链球菌 DHAD氨基酸序列(SEQ ID N0 168)中的以下位置88位的天冬氨酸、142位的精氨酸或天冬酰胺、208位的天冬酰胺和4M位的亮氨酸。
在本发明的另一方面，上述方法进一步包括 d)在细胞中表达具有可通过步骤a)、b)和c)中任何一个或全部步骤鉴定的序列的多肽；以及 e)确认所述多肽在细胞中具有DHAD活性。
在本发明的另一方面，上述方法进一步包括 d)纯化由可通过步骤a)、b)和C)中任何一个或全部鉴定的序列编码的蛋白质； 以及 e)通过紫外可见(UV-vis)和电子顺磁共振(EPR)光谱法确认所述蛋白质是 [2Fe-2S]DHAD 酶。
在本发明的另一方面，上述方法进一步包括选择一种或多种序列，所述序列对应于在步骤a)、b)和c)中任何一个或全部中鉴定的细菌[2i^e-2S]DHAD酶序列。所述选择的序列可在细胞中被表达；并且在该细胞中其DHAD活性可被确认。所述选择的序列可进一步被纯化，从而获得纯化的蛋白质并且所述纯化的蛋白质的[2i^e-2S]DHAD酶活性可通过 UV-vis和EI3R光谱得到确认。
本发明的另一方面涉及微生物宿主细胞，所述宿主细胞包含至少一种可通过本文所述方法鉴定的异源[2i^e-2S]DHAD酶。所述细胞可以是细菌细胞或酵母细胞。所述细胞还可以是生产异丁醇的重组细胞。
本发明的另一方面是用于生产异丁醇的方法，所述方法包括 a)提供包含至少一种可通过本文所述方法鉴定的异源[2i^e-2S]DHAD酶的微生物宿主细胞，其中所述宿主细胞进一步包含异丁醇生物合成途径；和 b)使(a)的微生物宿主细胞在使异丁醇产生的条件下生长。
本发明的另一方面是用于使2，3_ 二羟基异戊酸转化为α-酮异戊酸的方法，所述方法包括 a)提供包含通过本文所述方法鉴定的至少一种异源[2i^e-2S]DHAD酶的微生物宿主细胞和2，3- 二羟基异戊酸源；和 b)使(a)的微生物宿主细胞在使2，3- 二羟基异戊酸被转化为α _酮异戊酸的条件下生长。
和序列描述 通过下面的具体实施方式
、附图和随附的序列描述可以更全面地理解本发明，这些详细描述、附图和序列描述形成了本专利申请的一部分。
图1显示在代表性的细菌[2!^-2S]DHAD和Wi^elS]DHAD中的保守的半胱氨酸区域，以粗体的C表示半胱氨酸。采用单字母的氨基酸缩写。
图2显示DHAD相关蛋白的系统发育树。标记了关于Wi^eIS]和[2!^e-2S]DHAD， 以及EDD、醛糖酸脱水酶和未确定的类群(Und)的分枝。标记了选择的个别DHAD。
图3显示用于异丁醇生产的生物合成途径。
图4显示A)变异链球菌DHADdP B)大肠杆菌DHAD在空气中的活性稳定性的图。
图5显示变异链球菌DHAD的紫外-可见光谱的曲线图。
图6显示变异链球菌DHAD在介于20° K和90° K之间的不同温度的电子顺磁共振(EPR)光谱的曲线图。
图7显示对表达乙酰乳酸合酶、KARI和变异链球菌DHAD基因的酵母细胞提取物的HPLC分析，在47. 533分钟有异丁醇峰。
图8显示乳酸乳球菌(L. lactis)DHAD在空气中稳定性的图。
图9显示纯化的乳酸乳球菌DHAD的紫外-可见光谱的曲线图。
表1是基于如实施例1中所述制备的、具有经过检验的功能的酶针对二羟酸脱水酶的序型HMM的表。表1以电子方式附于本文提交，并以引用方式并入本文。
下列序列符合37 C. F. R. 1. 821-1. 825 ( “对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求一序列规则”)并且符合世界知识产权组织(WIPO)标准ST. 25(1998)和 EPO和PCT的序列表要求(规则5. 2和49. 5 (a-bis)，以及行政性指示的208节和附录C)。 用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37 C.F.R. § 1.822中所列出的规定。
表加代表性的细菌「2Fe_2SlDHAD蛋白质和编码序列
权利要求
1.用于鉴定[2i^e-2S]DHAD酶的方法，所述方法包括a)用序型隐蔽马尔科夫模型查询一种或多种氨基酸序列，所述序型隐蔽马尔科夫模型是使用SEQ ID NO :164、168、230、232、298、310、344和346的蛋白质制备的，其中具有小于 ΙΟ"5的E值的匹配提供了第一序列子集，从而所述第一序列子集对应于一种或多种DHAD相关蛋白质；b)分析步骤(a)的对应于一种或多种DHAD相关蛋白质的第一序列子集中三个保守的半胱氨酸的存在，从而鉴定出编码[2!^-2S]DHAD酶的第二序列子集，其中所述三个保守的半胱氨酸对应于变异链球菌(Str印tococcus mutans) 二羟酸脱水酶氨基酸序列(SEQ ID NO 168)的 56、1 和 201 位；以及c)分析步骤(b)的第二序列子集中特征保守氨基酸的存在，从而进一步鉴定出编码[2i^e-2S]DHAD酶的第三序列子集，其中所述特征保守氨基酸的位置对应于变异链球菌 DHAD氨基酸序列(SEQ ID NO 168)中的以下位置88位的天冬氨酸、142位的精氨酸或天冬酰胺、208位的天冬酰胺和4M位的亮氨酸。
2.权利要求1的方法，所述方法还包括d)在细胞中表达具有能够通过步骤a)、b)和c)中任何一个或全部来鉴定的序列的多肽；和e)确认所述多肽在所述细胞中具有DHAD活性。
3.权利要求1的方法，所述方法还包括d)纯化由能够通过步骤a)、b)和c)中任何一个或全部来鉴定的序列编码的蛋白质；和e)通过紫外-可见和电子顺磁共振光谱法确认所述蛋白质是[2i^e-2S]DHAD酶。
4.权利要求1的方法，所述方法还包括选择一种或多种序列，所述序列对应于在步骤 a)、b)和c)中任何一个或全部中鉴定的细菌[2i^e-2S]DHAD酶序列。
5.权利要求2的方法，其中所述细胞缺少内源的DHAD活性。
6.权利要求4的方法，所述方法还包括d)在细胞中表达所述选择的一种或多种对应于细菌[2i^e-2S]DHAD酶序列的序列；以及e)确认所述酶序列在所述细胞中具有DHAD活性。
7.权利要求4的方法，所述方法还包括d)纯化由所述选择的一种或多种对应于细菌[2i^e-2S]DHAD酶序列的序列编码的蛋白质，从而产生纯化的蛋白质；和e)通过紫外-可见和电子顺磁共振光谱法确认所述蛋白质是[2i^e-2S]DHAD酶。
8.包含至少一种异源[2!^-2S]DHAD酶的微生物宿主细胞，其中所述[2i^_2S]DHAD酶可通过权利要求1-7中任一项的方法被鉴定。
9.权利要求8的微生物宿主细胞，其中所述细胞是细菌细胞或酵母细胞。
10.权利要求9的微生物宿主细胞，其中所述细菌宿主细胞是选自梭菌属 (Clostridium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、片球菌属(Pediococcus)、产碱菌属(Alcaligenes)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、类芽胞杆菌属 (Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒杆菌属(Corynebacterium)、禾口短杆菌属(Brevibacterium)、乳球菌属(Lactococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、酒球菌属 (Oenococcus)、片球菌属(Pediococcus)和链球菌属(Streptococcus)的细菌属的成员。
11.权利要求9的微生物宿主细胞，其中所述酵母细胞是选自糖酵母属 (Saccharomyces)、裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)和毕赤酵母属 (Pichia)的酵母属的成员。
12.权利要求8的微生物宿主细胞，其中所述细胞产生异丁醇。
13.用于生产异丁醇的方法，所述方法包括a)提供权利要求8的微生物宿主细胞，其中所述宿主细胞包含异丁醇生物合成途径；以及b)使步骤(a)的宿主细胞在产生异丁醇的条件下生长。
14.用于使2，3-二羟基异戊酸转化为α-酮异戊酸的方法，所述方法包括a)提供权利要求8的微生物宿主细胞和2，3-二羟基异戊酸源；以及b)使(a)的微生物宿主细胞在使2，3-二羟基异戊酸转化为α-酮异戊酸的条件下生长。
全文摘要
发现了具有[2Fe-2S]簇的二羟酸脱水酶的群体。细菌的[2Fe-2S]DHAD被作为异源蛋白质在细菌和酵母细胞中表达，提供了用于使2，3-二羟基异戊酸转化为α-酮异戊酸和2，3-二羟基甲基戊酸转化为α-异亮氨酸酮酸的DHAD活性。异丁醇和其他化合物可以在包括了细菌[2Fe-2S]DHAD活性的途径中得到合成。
文档编号C12P13/08GK102186973SQ200980138542
公开日2011年9月14日 申请日期2009年9月29日 优先权日2008年9月29日
发明者D·弗林特, S·C·罗思曼, W·苏, J-F·汤布, R·W·叶 申请人:布特马斯先进生物燃料有限责任公司