一种基于癫痫患者的丙戊酸血药浓度与基因多态性的分析方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于癫痫患者的丙戊酸血药浓度与基因多态性的分析方法，包括收集癫痫患者的血液样本，采用高效液相色谱检测其血药浓度，并进行基因多态性分析，全面、综合地体现UGT1A3 A17G、C133T和UGT1A6 A552C基因多态性对丙戊酸血药浓度的影响，为丙戊酸的个体化用药提供了理论依据，可为癫痫的治疗提供有利的技术支持。
【专利说明】
-种基于癒滴患者的丙戊酸血药浓度与基因多态性的分析 方法
技术领域
[0001] 本发明设及一种癒痛患者的丙戊酸血药浓度与基因多态性的分析方法，具体设及 一种分析UGT基因多态性与丙戊酸血药浓度的相关性的方法。
【背景技术】
[0002] 癒痛是神经系统的常见疾病之一，人群患病率约为5%，我国患病率为7%。癒痛严 重危害患者的身体健康，同时给患者带来了极大的精神和经济负担。如未得到有效治疗，患 者不能进行正常工作或劳动，一些患者还将因癒痛发作而引发行为异常，对社会造成危害。 因此，有效地控制癒痛发作，改善癒痛患者的生活质量，减轻其家庭和社会的负担是临床医 生的共同目标。癒痛目前W药物治疗为主，虽然各种新型抗癒痛药(AE化)陆续进入临床，使 多数癒痛患者得到有效控制，但仍有约25%的癒痛患者控制不良，导致难治性癒痛的产生。 临床工作中发现，对于发作类型相同的病人即使应用剂量完全相同的抗癒痛药，其治疗效 果和不良反应也可W出现很大差异。近年来抗癒痛药物的个体化使用一直是备受关注的问 题。
[0003] 丙戊酸钢(化lproate，VPA)作为广谱抗癒痛药，是治疗癒痛的一线药物，主要用于 治疗癒痛单纯或复杂性失神发作、肌阵李发作、全身性强直阵李发作等。丙戊酸钢治疗癒痛 的有效血药浓度为g/mL 50-100,由于治疗窗较窄，患者对药物的敏感性也不同导致体内代 谢的个体差异大，而使其应用复杂，难W掌握。在治疗癒痛的过程中发现丙戊酸钢的用药剂 量和血药浓度存在很大的个体差异，部分患者即使应用较小的剂量但是其血药浓度仍超过 有效血药浓度范围。长期服用丙戊酸钢对患者消化系统、神经系统、血液系统均有一定的不 良反应，为了有效控制癒痛发作，减少和避免不良反应的发生，临床上需监测其血药浓度。 丙戊酸钢在体内97%通过肝脏代谢，其中50%通过结合反应被尿巧酸二憐酸葡萄糖醒酸酶 代谢(UGT1A3、UGT1A6、UGT2B7)为无活性的产物。基因多态性可导致药物疗效差异，是影响 给药剂量确定的重要因素之一。
[0004] 本发明建立PCR-LDR方法，探索UGT (UGT1 A3、UGT1A6和UGT2B7)基因在中国癒痛患 者中的分布特点，通过丙戊酸钢血药浓度监测与UGT基因分型，分析UGT基因多态性与癒痛 患者丙戊酸钢血药浓度的相关性，更好的了解丙戊酸钢在癒痛患者体内代谢的个体差异， W期通过基因型预测癒痛患者对丙戊酸钢的代谢情况，为个体化用药提供参考，更好的实 现临床合理用药，为癒痛的临床治疗提供理论依据。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是为了克服现有技术中上述缺陷，提供一种基于癒痛患者的丙戊酸 血药浓度与基因多态性的分析方法，包括:收集癒痛患者的丙戊酸血药浓度与并进行基因 多态性，并采用高效液相色谱检测分析，全面、综合地体现1]61'1434176、(：1331'和 UGT1A6A552C基因多态性对丙戊酸血药浓度具有一定影响，为丙戊酸的个体化用药提供了 理论依据，可为癒痛病的治疗提供有利的技术支持。
[0006] 本发明的解决上述技术问题的方案是:一种基于癒痛患者的丙戊酸血药浓度与基 因多态性的分析方法，包括：
[0007] (1)样品制备：收集服用丙戊酸钢前、血药浓度达到稳态时患者空腹外周静脉血， 分两份，准备进行多态性检测或HPLC检测分析；
[0008] (2)丙戊酸钢血药浓度测定及标准化:血液样本预处理，准备进行HPLC检测分析， 取空白血浆精密加丙戊酸标准溶液配制浓度梯度血浆样品，测定后W标准样品血浆中丙戊 酸浓度对丙戊酸与内标峰面积比回归求标准曲线方程；W标准曲线方程计算各患者血浆样 本中丙戊酸浓度；
[0009] (3)血液基因组DNA提取及UGT1 A3、UGT1A6和UGT2B7基因分型;进行多重PCR-LDR检 测；
[0010] (4)数据分析:Genemapper软件分析数据和基因分型，并进行统计学分型。
[0011] 优选的，所述步骤（1)中收集外周静脉血的方法为:空腹采外周静脉血2mL 2管，置 于无菌无酶的抓TA抗凝试管，4 °C冰箱保存，用于血药浓度检测，另一份于-20°C冰箱保存， 用于多态性检测。
[0012] 优选的，步骤(2)中血液样本预处理为:抗凝全血2mL，4000r/min，4°C离屯、lOmin， 取上层血浆lOOL，加入内标正庚酸l〇L，lmol/L硫酸lOOL，混匀，加入正戊烧2mL，满縱振荡 3min，3800r/min离屯、5min，取上清液1血，加10L漠苯乙酬和10LS乙胺，55°C水浴蒸干，100L 甲醇复溶，转入进样小瓶，进行HPLC检测分析。
[OOU] 优选的，步骤（2)中HPLC色谱条件为：aiimpack C18色谱柱（150mmX6mm，5m)，流速 Iml/min，柱溫为25 °C，流动相乙腊:水=75: 25，检测波长243皿，进样量为20L，自动进样器 溫度4°C。
[0014] 优选的，所述步骤(2)中，为消除给药剂量和体重对个体血药浓度的影响，将血药 浓度标准化，计算方法为患者的稳态血药浓度除W每公斤体重的服药剂量，即每mg/kg药物 引起的血药浓度改变。
[0015] 优选的，步骤(3)血液基因组DNA提取方法为：将抽取患者的静脉抗凝血室溫解冻 后，取25化按AxyPr邱血基因组DNA小量试剂盒说明书提取外周血基因组DNA，紫外分光光度 仪检测DNA浓度及纯度，并置于-20°C保存备用。
[0016] 优选的，所述步骤（3)中PCR条件为，95°C2min，后94°C90s，65°Clmin，72°Clmin循 环 35 次，72°C7min。
[0017] 优选的，所述步骤（3)中LCR条件为，95°C2min，后94。[303,60。[2111111循环35次。
[0018] 优选的，步骤(4)中统计学分析具体为:运用SPSS19.0软件进行数据分析。所有数 据均W平均值±标准差表示，计数资料用频数与百分率表示。基因频率的化rdy-Weinberg 平衡采用X2检验，不同基因型间年龄、体重、丙戊酸剂量、丙戊酸血药浓度及标准化血药浓 度的比较采用方差分析，两组间的比较采用t检验，P<0.05认为有统计学意义。
【附图说明】
[0019]
[0020] 图1为多重PCR琼脂糖电泳结果；
[0021] 图2为UGT1A3中A17G、G81A、T140C各位点基因型图像；
[0022] 图3为UGT1A3中T31C、C133T、A477G各位点基因型图像；
[0023] 图 4 为UGT1A6 中 A552C、UGT2B7 中 C161T、A268G各位点基因型图像；
[0024] 图 5 为UGT1A6 中 A541G、UGT2B7 中 G211T、C802T各位点基因型图像；
[0025] 图6为本发明分析方法的流程图。
【具体实施方式】
[0026]
[0027]下面结合实施例进一步描述本发明。
[00%] -、数据信息及分析内容
[0029] 1.1研究对象：
[0030] 收集本院长期服用丙戊酸钢的口诊及住院癒痛患者及正常对照人群各100例。癒 痛患者入组标准:诊断为癒痛，长期服用丙戊酸钢，无合并用药，无肝肾功能异常。建立患者 的详细档案库，包括患者基本信息、癒痛发作类型、发作时间、用药情况、治疗效果、肝肾功 能及其他情况。正常对照人群入组标准:无内科及神经、精神科疾病，入组前3月内无任何疾 病，未服任何药物，性别、年龄与癒痛患者组匹配。
[0031] 1.2样本收集：
[0032] 癒痛患者组在单一服用丙戊酸钢至少5个半衰期后，于下次服药前，血药浓度达到 稳态时清晨空腹采外周静脉血5mL 2管;不抗凝，4°C冰箱保存，一份用于基因检测，另一份 用于血药浓度检测。正常对照组同法采集。
[0033] 1.3丙戊酸钢血药浓度测定及其标准化
[0034] (1)样本预处理
[OO%] 抗凝全血21111^，400〇1'/111；[]1，4"€离屯、1〇111；[]1，取上层血浆10化，加入内标正庚酸101^， Imol/L硫酸100L，混匀，加入正戊烧2mL，满縱振荡3min，3800;r/min离屯、5min，取上清液1血， 加 1化漠苯乙酬和1化立乙胺，55°C水浴蒸干，10化甲醇复溶，转入进样小瓶，进行HPLC检测 分析。
[0036] (2)色谱条件
[0037] Shimpack C18色谱柱（150mmX6mm，5m)，流速Iml/min，柱溫为25°C，流动相乙腊： 水=75:25，检测波长243nm，进样量为20L，自动进样器溫度4°C。
[0038] (3)血药浓度测定及标准化
[0039] 取空白血浆精密加丙戊酸标准溶液配制一系列浓度梯度血浆样品，依法测定，W 标样血浆中丙戊酸浓度对丙戊酸与内标峰面积比回归，求标准曲线方程。W该标准曲线方 程计算各患者血浆样本中丙戊酸浓度。为了消除给药剂量和体重对个体血药浓度的影响， 将血药浓度标准化。标准化血药浓度计算方法为患者的稳态血药浓度除W每公斤体重的服 药剂量，即每mg/kg药物引起的血药浓度改变(单位为<邑/111。/<1]^/1^〉）。
[0040] 1.4血液基因组DNA提取
[0041 ] 将抽取患者的静脉抗凝血室溫解冻后，取25化按AxyPrep血基因组DNA小量试剂盒 说明书提取外周血基因组DNA，紫外分光光度仪检测DNA浓度及纯度，并置于-20°C保存备 用。
[0042] 1.5 UGT1A3、UGT1A6和UGT2B7基因分型
[0043] (1)引物设计和合成
[0044] UGT1A3、UGT1A6和UGT2B7各位点采用聚合酶链反应-连接酶检测反应(Polymerase chain reaction-ligase detection reaction,PCR-LDR)法检测其基因型，引物序列见表 1〇
[0045] 表 1 UGT1A3、UGT1A6 和 UGT2B7 引物序列表
[0046]
[0047] 注:PCR正向引物R:PCR反向引物
[004引 （2)探针设计
[0049]根据位点附近基因序列，设计各基因 LDR探针，所有探针设计由上海翼和生物合成 有限公司完成，见表2。
[00加]表2 UGT1A3、UGT1A6和UGT2B7各位点的特异性LDR探针序列
[0化1 ]
[0化2]
[0化3] 1.6 多重PCR
[0化4] PCR系统，2化L体系，如下： 州ng模板 1 μL, IxBuiTer 2 3 niM iVlg" 0.6 以已
[0055] clNTP (2 mM/each) 2 μL^ ! U Taq 轉 0.2 μ￡ (klH.O 12.2 μL Primer mix (Q.5p) 2 μL.
[00日6] PCR条件：95Γ2π?η一（94T90sec一65rimin一72Γ1 min) X35cycles一72Γ 7min
[0057] 3%的琼脂糖凝胶电泳检测，观察PCR产物的效果，确定其作为模板在LDR反应中加 入的量。
[0化引 1.7 LDR检测
[0059] LDR系统：1化L体系，如下： !x Buffer 1 叫已 Probe mix (2 pmoL|iL) IwL
[0060] 2U Taq DNA 进接鹏 0.05 μL 加扣0 4 μL PC民产物 4七正
[0061 ] LDR条件：95°C2min一（94°C30sec一6(TC2min)X35巧cles ABI PRISM 3730型基 因分型仪测序电泳。
[0062] 1.8数据分析:Genemapper软件分析数据和基因分型；
[0063] 统计学分析:运用SPSS19.0软件进行数据分析。所有数据均W平均值±标准差表 示，计数资料用频数与百分率表示。基因频率的化rdy-Weinberg平衡采用X2检验，不同基因 型间年龄、体重、丙戊酸剂量、丙戊酸血药浓度及标准化血药浓度的比较采用方差分析，两 组间的比较采用t检验，P<0.05认为有统计学意义。
[0064] 二、数据分析结果 [00化]2.1患者基本信息
[0066] 97例入组的癒痛患者的性别、年龄、体重、肝肾功能、丙戊酸剂量、原始及标准化的 血药浓度见表3。
[0067] 表3患者临床信息表
[006引
[0069] 2.2 UGT1A3、UGT1A6和UGT2B7基因分型
[0070] (1)多重PCR琼脂糖电泳结果:见图1，其中A，B，C:癒痛患者全血样本;D:阴性对照； Marker:100,200,300,400,500bp。
[007?] (2 )Genemappe;r数据分析:Genemapper软件进行数据分析，各位点的分型截图见图 2、图3、图4、图5。
[0072] (3)UGT1A3、UGT1A6 和 UGT2B7 基因型分布
[0073] 97例癒痛患者UGT1A3、UGT1A6和UGT2B7的基因型分布和各等位基因突变频率详见 表4和表5。除UGT2B7C161T均为CC基因型和UGT2B7C802T的基因型无法确定不符合化rdy- Weinberg遗传平衡外，其余各等位基因 X2检验的P值均大于0.05,即各基因多态性符合 化rdy-Weinberg遗传平衡。
[0074] 表4 UGT1A3各位点基因多态性分布
[0075]
[0076] 表5 UGT1A6和UGT2B7各位点基因多态性分布
[0077]
[007引 2.3 UGT1A3、UGT1A6和UGT2B7基因型对丙戊酸血药浓度的影响 [00巧]UGT1A3、UGT1A6和UGT2B7不同基因型患者的丙戊酸标准化血药浓度见表6和表7。 不同基因型间年龄、体重、丙戊酸剂量、丙戊酸血药浓度及标准化血药浓度单因素方差分析 结果显示，UGT1A3A17GS种基因型丙戊酸血药浓度及标准化血药浓度差异有统计学意义。 继续做两两组间比较，AA基因型与AG基因型丙戊酸血药浓度和标准化血药浓度差异有统计 学意义，AA基因型的丙戊酸血药浓度和标准化血药浓度高于AG基因型。UGT1A3C133T CC基 因型的丙戊酸标准化血药浓度高于CT基因型，差异有统计学意义。UGT1A6A552CS种基因 型丙戊酸血药浓度及标准化血药浓度差异有统计学意义。继续做两两组间比较，CC基因型 与AA基因型和AC基因型丙戊酸标准化血药浓度差异有统计学意义，AA基因型和AC基因型的 丙戊酸标准化血药浓度高于 CC 基因型。1]61'^3了32(：、6814、1'140(：、414776，1]61'14645416和 UGT2B7A268G、G211TS种基因型丙戊酸血药浓度和标准化血药浓度的差异无统计学意义。
[0080]表6癒痛患者UGT1A3各位点不同基因型的丙戊酸标准化血药浓度
[0081]
[0082] 丙戊酸标准化血药浓度:*UGT1A3A17G AA基因型vs AG基因型，P<0.05;
[0083] #UGT1A3C133T CC基因型vs CT基因型，P<0.05
[0084] 表7癒痛患者UGT1A6和UGT2B7各位点不同基因型的丙戊酸标准化血药浓度
[0085]
[00化]丙戊酸标准化血药浓度:*UGT1A6A552C AA基因型vs CC基因型，AC基因型vs
[0087] CC 基因型，P<0.0
[0088] Ξ、分析结果讨论
[0089] 本发明对UGT (UGT1 A3、UGT1Α6和UGT2B7)基因在中国癒痛患者中的分布特点进行 分析，通过丙戊酸钢血药浓度监测与UGT基因分型，分析UGT基因多态性与癒痛患者丙戊酸 钢血药浓度之间的相关性，具有一定的创新性和应用价值。
[0090] 本发明说明书未详细阐述部分属于本领域公知技术。
[0091] W上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来 说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W做出若干改进和修饰，运些改进和修饰也应视为 本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种基于癫痫患者的丙戊酸血药浓度与基因多态性的分析方法，其特征在于，包括： (1) 样品制备：收集服用丙戊酸钠前、血药浓度达到稳态时患者空腹外周静脉血，分两 份，准备进行多态性检测或HPLC检测分析； (2) 丙戊酸钠血药浓度测定及标准化:血液样本预处理，准备进行HPLC检测分析，取空 白血浆精密加丙戊酸标准溶液配制浓度梯度血浆样品，测定后以标准样品血浆中丙戊酸浓 度对丙戊酸与内标峰面积比回归求标准曲线方程；以标准曲线方程计算各患者血浆样本中 丙戊酸浓度； (3 )血液基因组DNA提取及UGT1 A3、UGT1A6和UGT2B7基因分型；进行多重PCR-LDR检测； (4)数据分析:Genemapper软件分析数据和基因分型，并进行统计学分型。2. 根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述步骤（1)中收集外周静脉血的方 法为：空腹采外周静脉血2 mL 2管，置于无菌无酶的EDTA抗凝试管，4 °C冰箱保存，用于血 药浓度检测，另一份于-20 °C冰箱保存，用于多态性检测。3. 根据权利要求1-2之一所述的分析方法，其特征在于，步骤(2)中血液样本预处理为： 抗凝全血2 mL，4000 r/min，4 °C离心10 min，取上层血衆100 yL，加入内标正庚酸10 μ L，1 mol/L硫酸100 yL，混勾，加入正戊烧2 mL，祸漩振荡3 min，3800 r/min离心5 min，取 上清液1 mL，加10 yL溴苯乙酮和10 yL三乙胺，55 °C水浴蒸干，100 yL甲醇复溶，转入进 样小瓶，进行HPLC检测分析。4. 根据权利要求1-3之一所述的分析方法，其特征在于，步骤（2)中HPLC色谱条件为： Shimpack C18色谱柱（150 mm X 6 mm，5 μ)，流速 1 ml/min，柱温为25 °C，流动相乙腈： 水=75: 25,检测波长243 nm，进样量为20 yL，自动进样器温度4 °C。5. 根据权利要求1-4之一所述的分析方法，其特征在于，所述步骤(2)中，为消除给药剂 量和体重对个体血药浓度的影响，将血药浓度标准化，计算方法为患者的稳态血药浓度除 以每公斤体重的服药剂量，即每mg/kg药物引起的血药浓度改变。6. 根据权利要求1-5之一所述的分析方法，其特征在于，步骤(3)血液基因组DNA提取方 法为:将抽取患者的静脉抗凝血室温解冻后，取250 yL按AxyPrep血基因组DNA小量试剂盒 说明书提取外周血基因组DNA，紫外分光光度仪检测DNA浓度及纯度，并置于-20 °C保存备 用。7. 根据权利要求1-6之一所述的分析方法，其特征在于，所述步骤(3)中PCR条件为，95 °C 2 min，后94Γ 90 s，65°C 1 min，72 Γ 1 min循环35次，72 °C 7 min。8. 根据权利要求1-7之一所述的分析方法，其特征在于，所述步骤(3)中LCR条件为，95 °C 2 min，后94°C 30 s，60°C 2 min循环35次。9. 根据权利要求1-8之一所述的分析方法，其特征在于，步骤(4)中统计学分析具体为： 运用SPSS19.0软件进行数据分析;所有数据均以平均值±标准差表示，计数资料用频数与 百分率表示;基因频率的Hardy-We inberg平衡采用X2检验，不同基因型间年龄、体重、丙戊 酸剂量、丙戊酸血药浓度及标准化血药浓度的比较采用方差分析，两组间的比较采用t检 验，P〈0.05认为有统计学意义。
【文档编号】C12Q1/68GK106011236SQ201610333874
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月18日
【发明人】陈莹蓉, 沈雄荣, 毕京博
【申请人】湖州市中心医院