本发明涉及GLP-1类似物和齐考诺肽组合物缓释微球制剂及其制备方法，属于药物制剂领域。
背景技术：
：随着社会的发展，世界范围内糖尿病的发病率呈明显增加的趋势，2000年曾估计为2.8％，到2025年预计为4.3％，糖尿病患者人数也将从2000年的1.71亿增加到2025年的3.8亿。糖尿病的并发症较多，已成为导致患者致死、致残的主要原因，严重影响着人类健康。糖尿病并发症包括糖尿病酮症酸中毒、糖尿病肾病、高血压、痛性糖尿病神经病变(Painfuldiabeticneuropathy,PDN)等，其中PDN是糖尿病最常见、最严重的并发症之一。慢性病变在PDN中常见，主要侵犯四肢及足部。患者主要表现为肢端疼痛，烧痛、刀割样、撕裂性、针刺样疼痛。PDN是目前临床上最复杂、最难治的糖尿病周围神经病变之一。糖尿病患者中大部分为2型糖尿病患者，占90-95％。GLP-1类似物是21世纪出现的新型治疗药物，因该类药物具有良好的降糖效果、能够减少低血糖的风险，同时具有适当的减重作用等优势一直是糖尿病治疗药物研究的热点。目前主要的GLP-1类似物降糖药物包括利拉鲁肽、艾塞那肽、度拉糖肽、阿必鲁肽等，该类药物主要经皮下注射给药。然而，临床上艾塞那肽、度拉糖肽、阿必鲁肽等虽然有长效制剂，但单独使用时，对糖尿病的治疗效果仍不能令人满意，无法缓解PDN并发症的疼痛。利拉鲁肽需每日皮下注射，给患者带来极大的给药痛苦。临床上用于治疗PDN的药物主要有抗惊厥药、抗抑郁药、阿片类药、醛糖还原酶抑制剂、血管紧张素转化酶抑制剂、钙离子拮抗剂及前列腺素等。然而阿片类镇痛药对慢性神经源性等疼痛的治疗效果并不理想，而且有成瘾性，快速耐受性(即几次用药后疗效逐渐降低)，引起便秘和呼吸抑制等严重不良发应。齐考诺肽是人工合成的ω-MⅦA芋螺毒素，能可逆地阻断N型钙离子通道，成为第一种新型的神经治疗药物—N型钙离子通道阻断剂(NCCB)。作为一种非阿片类镇痛剂，齐考诺肽与其他镇痛药物的区别在于其临床应用的安全性和有效性，从而预示了其在严重慢性疼痛治疗中重要的潜在价值，而在临床研究中也没有发现病人对齐考诺肽产生抗药性。目前齐考诺肽采用鞘内滴注的方式给药，鞘内给药系统需植入，给患者带来很大的不便，同时临床管理要求也比较严格。临床上降血糖及并发症治疗方案是分开给药的，给患者带来多次给药的痛苦。目前，尚未发现将两者联合应用的报道。将GLP-1类似物和齐考诺肽进行联用，能有效治疗糖尿病及其PDN并发症，明显镇痛，减轻患者痛苦，提高患者用药依从性。技术实现要素：基于此，有必要提供一种具有缓释效果的GLP-1类似物和齐考诺肽组合物缓释微球制剂，以实现治疗糖尿病及其PDN并发症的作用，并减轻患者痛苦，提高患者用药依从性，具有临床现实意义。为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：一种GLP-1类似物和齐考诺肽组合物缓释微球制剂，包含GLP-1类似物、齐考诺肽、可生物降解且具生物相容性的高分子材料、稳定剂和冻干保护剂；在其中一个实施例中，所述GLP-1类似物选自利拉鲁肽或其盐、艾塞那肽或其盐、度拉糖肽或其盐、阿必鲁泰或其盐中的一种；在其中一个实施例中，所述GLP-1类似物与齐考诺肽的质量比为1:1～1:25。在其中一个实施例中，所述缓释微球制剂由以下重量百分比含量的成份组成：GLP-1类似物0.02～1.35％、齐考诺肽0.02～1.58％、可生物降解且具生物相容性的高分子材料60.00～92.00％、稳定剂0.05～25％和冻干保护剂0.21～28.54％；所述GLP-1类似物与齐考诺肽的质量比为1:8～1:20。在其中一个实施例中，所述缓释微球制剂由以下重量百分比含量的成份组成：GLP-1类似物0.05～1.25％、齐考诺肽0.06～1.58％、可生物降解且具生物相容性的高分子材料75.00～92.00％、稳定剂0.05～20.00％和冻干保护剂0.35～20.30％；所述GLP-1类似物与齐考诺肽的质量比为1:10～1:20。在其中一个实施例中，所述可生物降解且具生物相容性的高分子材料选自聚丙交酯—乙交酯、聚羟基丁酸戊酸酯、聚乳酸-羟基乙酸、聚乳酸-聚乙二醇中的一种或多种，分子量为5000～90000道尔顿。在其中一个实施例中，所述可生物降解且具生物相容性的高分子材料优选自聚丙交酯—乙交酯、聚羟基丁酸戊酸酯、聚乳酸-羟基乙酸(50∶50～85∶15)、聚乳酸-聚乙二醇(5∶1～20∶1)中的一种或多种，分子量为8000～80000道尔顿。在其中一个实施例中，所述缓释微球的平均粒径为10μm～100μm。在其中一个实施例中，所述稳定剂为聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基丙烯酸钠、聚丙烯酸钠中的至少一种；所述冻干保护剂选自山梨醇、甘露醇、乳糖、蔗糖、海藻糖、泊洛沙姆中的至少一种。在其中一个实施例中，所述稳定剂优选为聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮中的至少一种；所述冻干保护剂优选自甘露醇、乳糖、泊洛沙姆中的至少一种。一种GLP-1类似物和齐考诺肽组合物缓释微球制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1)将GLP-l类似物和齐考诺肽加水配成药物溶液A；将可生物降解且具生物相容性的高分子材料加有机溶剂配成溶液B；步骤2)将溶液A和溶液B混合超声形成初乳，初乳加入到用有机混合溶剂饱和过的稳定剂水溶液中，均质乳化得复乳；步骤3)将复乳室温搅拌1小时后升温至40℃～45℃保持1小时，再降温至10℃，加入冻干保护剂，过筛收集颗粒，冻干，经辐射灭菌。在其中一个实施例中，步骤1)中的有机溶剂选自乙酸乙酯、苯甲醇混合溶液或二氯甲烷、苯甲醇混合溶液中的一种。在其中一个实施例中，步骤1)中的有机溶剂乙酸乙酯和苯甲醇的体积比为2.5～8∶1；二氯甲烷和苯甲醇的体积比为2.5～7∶1。在其中一个实施例中，步骤2)中的有机混合溶剂为苯甲醇和乙酸乙酯，有机混合溶剂的浓度为1％～3％。在其中一个实施例中，步骤3)中的复乳室温搅拌1小时后升温至45℃保持1小时，再降温至10℃。所述的GLP-1类似物和齐考诺肽组合物缓释微球制剂，用于治疗糖尿病及其痛性糖尿病神经病变并发症。附图说明图1为实施例1、3、7、9制备的缓释微球体外释放曲线。具体实施方式以下实施例是对本发明的进一步说明，但绝不是对本发明范围的限制。下面参照实施例进一步详细阐述本发明，但是本领域技术人员应当理解，本发明并不限于这些实施例以及使用的制备方法。而且，本领域技术人员根据本发明的描述可以对本发明进行等同替换、组合、改良或修饰，但这些都将包括在本发明的范围内。一实施方式的GLP-1类似物和齐考诺肽组合物缓释微球制剂，包括GLP-1类似物、齐考诺肽、可生物降解且具生物相容性的高分子材料、稳定剂和冻干保护剂。其中，GLP-1类似物选自利拉鲁肽或其盐、艾塞那肽或其盐、度拉糖肽或其盐、阿必鲁泰或其盐中的一种。例如，GLP-1类似物可以是利拉鲁肽、醋酸利拉鲁肽或利拉鲁肽的醋酸盐。GLP-1类似物和齐考诺肽混合形成缓释微球的内核，可生物降解且具生物相容性的高分子材料包覆在内核的表面形成缓释微球的包衣。可生物降解且具生物相容性的高分子材料作为包衣，使得该GLP-1类似物和齐考诺肽组合物缓释微球具有较好的缓释性能，能够克服普通的GLP-1类似物制剂给药次数多、不利于患者接受的缺点。GLP-1类似物能够治疗糖尿病。齐考诺肽能够有效减轻严重慢性疼痛。GLP-1类似物和齐考诺肽联合使用，能有效治疗糖尿病及其PDN并发症，明显减轻慢性疼痛而不会产生耐药性，减轻患者痛苦，提高患者用药依从性。优选地，GLP-1类似物和齐考诺肽的质量比为1:1～1:25，以充分发挥GLP-1类似物和齐考诺肽的优点，起到较好的协调作用，以较好地治疗糖尿病及其PDN并发症。优选地，GLP-1类似物和齐考诺肽组合物缓释微球制剂主要由以下重量百分比含量的成份组成：GLP-1类似物0.02～1.35％、齐考诺肽0.02～1.58％、可生物降解且具生物相容性的高分子材料60.00～92.00％、稳定剂0.05～2.84％和冻干保护剂0.21～28.54％；所述GLP-1类似物与齐考诺肽的质量比为1:8～1:20。更优选地，GLP-1类似物和齐考诺肽组合物缓释微球制剂主要由以下重量百分比含量的成份组成：GLP-1类似物0.05～1.25％、齐考诺肽0.06～1.58％、可生物降解且具生物相容性的高分子材料75.00～92.00％、稳定剂0.05～2.00％和冻干保护剂0.35～20.30％；所述GLP-1类似物与齐考诺肽的质量比为1:10～1:20。采用上述重量百分比，能够发挥活性组分GLP-1类似物和齐考诺肽的联用的疗效，且使得该GLP-1类似物和齐考诺肽组合物缓释微球具有较好的缓释效果，不仅能够显著减少给药次数，方便临床使用和患者接受，而且能够消除普通制剂多次给药产生的药物浓度峰谷现象，有利于获得平稳长时间的有效浓度，降低毒副作用。优选地，可生物降解且具生物相容性的高分子材料选自聚丙交酯—乙交酯、聚羟基丁酸戊酸酯、聚乳酸-羟基乙酸、聚乳酸-聚乙二醇中的一种或多种，分子量为5000～90000道尔顿。更优选地，可生物降解且具生物相容性的高分子材料选自聚丙交酯—乙交酯、聚羟基丁酸戊酸酯、聚乳酸-羟基乙酸(50∶50～85∶15)、聚乳酸-聚乙二醇(5∶1～20∶1)中的一种或多种，分子量为8000～80000道尔顿。上述可生物降解且具生物相容性的高分子材料的生物相容性较好，且可生物降解，使得该GLP-1类似物和齐考诺肽组合物缓释微球制剂的安全性较好。优选地，上述缓释微球的平均粒径为10μm～100μm，使得该GLP-1类似物和齐考诺肽组合物缓释微球制剂有利于在体内的有效扩散，能够有效地控制体内血糖含量和减轻PDN并发症疼痛，减少给药次数和药物耐受性，提高病人的顺应性，方便临床使用和患者用药。优选地，稳定剂为聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基丙烯酸钠、聚丙烯酸钠中的至少一种；冻干保护剂选自山梨醇、甘露醇、乳糖、蔗糖、海藻糖、泊洛沙姆中的至少一种。更优选地，稳定剂为聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮中的至少一种；冻干保护剂选自甘露醇、乳糖、泊洛沙姆中的至少一种。该GLP-1类似物和齐考诺肽组合物缓释微球制剂能够有效治疗糖尿病及其PDN并发症。由于使用了缓释微球，使得该GLP-1类似物和齐考诺肽组合物缓释微球制剂具有缓释效果，能够显著发挥GLP-1类似物和齐考诺肽的协调效应，提高疗效。GLP-1类似物和齐考诺肽组合物缓释微球制剂经皮下注射给药，经实验表明，释放时间长达1个月，累计释放度达90％以上。通过一次皮下注射上述GLP-1类似物和齐考诺肽组合物缓释微球制剂进行给药，同时实现GLP-1类似物和齐考诺肽的给药，解决了单独给药时临床给药不便的问题。一种GLP-1类似物和齐考诺肽组合物缓释微球制剂的制备方法，包括如下步骤：步骤1)将GLP-l类似物和齐考诺肽加水配成药物溶液A；将可生物降解且具生物相容性的高分子材料加有机溶剂配成溶液B；步骤2)将溶液A和溶液B混合超声形成初乳，初乳加入到用有机混合溶剂饱和过的稳定剂水溶液中，均质乳化得复乳；步骤3)将复乳室温搅拌1小时后升温至40℃～45℃保持1小时，再降温至10℃，加入冻干保护剂，过筛收集颗粒，冻干，经辐射灭菌。优选地，步骤1)中的有机溶剂选自乙酸乙酯、苯甲醇混合溶液或二氯甲烷、苯甲醇混合溶液中的一种。优选地，步骤1)中的有机溶剂乙酸乙酯和苯甲醇的体积比为2.5～8∶1；二氯甲烷和苯甲醇的体积比为2.5～7∶1。优选地，步骤2)中的有机混合溶剂为苯甲醇和乙酸乙酯，有机混合溶剂的浓度为1％～3％。优选地，步骤3)中的复乳室温搅拌1小时后升温至45℃保持1小时，再降温至10℃。通过该方法能够解决普通复乳法制备水溶性药物过程中最常见的突释问题以及在洗涤微球外部时导致的药物损失问题；能够提高微球表面的平滑度从而使得血药浓度更加稳定平滑。以下通过具体实施例进一步阐述。实施例1称取0.2mg利拉鲁肽和0.2mg齐考诺肽加水配成浓度为40％的药物溶液，将1g聚丙交酯-乙交酯用25mL乙酸乙酯和10mL苯甲醇溶解，将二者混合超声2min，形成白色均质初乳。初乳在1600rpm的均质下通过注射器加入到6℃的1000mL0.01％(重量体积比)的聚乙烯醇水溶液(含1％苯甲醇和1％乙酸乙酯)中，均质乳化2min得复乳。将复乳移至悬臂搅拌机上，转速为600rpm，搅拌1h，然后升温到40℃保持1小时，再降低到10℃，加入山梨醇0.1g得混合物，筛网过滤，冻干得粉末状微球。经JSM-5600型扫描电子显微镜观察，微球孔洞连续完整，微球均呈圆球状，且大小均匀规整，粒径范围10～40μm，平均粒径18μm。经Zeta电位分析仪测定，微球的Zeta电位置为(-28.5±1.23)mV，其表面所带电荷为负电荷。实施例2称取0.25mg艾塞那肽和0.3mg齐考诺肽加水配成浓度为20％的药物溶液，将1g聚羟基丁酸戊酸酯用30mL乙酸乙酯和10mL苯甲醇溶解，将二者混合超声2min，形成白色均质初乳。初乳在1600rpm的均质下通过注射器加入到6℃的1000mL0.02％的聚乙烯醇溶液(含0.5％苯甲醇和1％乙酸乙酯)中，均质乳化2min得复乳。将复乳移至悬臂搅拌机上，转速为600rpm，搅拌1h，然后升温到45℃保持1小时，再降低到10℃，加入乳糖0.1g得混合物，筛网过滤，冻干得粉末状微球。经JSM-5600型扫描电子显微镜观察，微球孔洞连续完整，微球均呈圆球状，且大小均匀规整，粒径范围10～55μm，平均粒径25μm。经Zeta电位分析仪测定，微球的Zeta电位置为(-33.2±1.06)mV，其表面所带电荷为负电荷。实施例3称取5mg利拉鲁肽和0.1g齐考诺肽加水配成浓度为18％的药物溶液，将6g聚丙交酯-乙交酯用25mL二氯甲烷和10mL苯甲醇溶解，将二者混合超声2min，形成白色均质初乳。初乳在1600rpm的均质下通过注射器加入到6℃的1000mL0.2％的聚乙烯吡咯烷酮溶液(含1％苯甲醇和1.5％乙酸乙酯)中，均质乳化2min得复乳。将复乳移至悬臂搅拌机上，转速为600rpm，搅拌1h，然后升温到42℃保持1小时，再降低到10℃，加入甘露醇0.5g得混合物，筛网过滤，冻干得粉末状微球。经JSM-5600型扫描电子显微镜观察，微球孔洞连续完整，微球均呈圆球状，且大小均匀规整，粒径范围12～70μm，平均粒径20μm。经Zeta电位分析仪测定，微球的Zeta电位置为(-26.1±1.27)mV，其表面所带电荷为负电荷。实施例4称取4mg度拉糖肽和90mg齐考诺肽加水配成浓度为18％的药物溶液，将8g聚乳酸羟基乙酸(50:50)用40mL二氯甲烷和10mL苯甲醇溶解，将二者混合超声2min，形成白色均质初乳。初乳在1600rpm的均质下通过注射器加入到6℃的1000mL0.1％的聚丙烯酸钠溶液(含1.5％苯甲醇和1.5％乙酸乙酯)中，均质乳化2min得复乳。将复乳移至悬臂搅拌机上，转速为600rpm，搅拌1h，然后升温到40℃保持1小时，再降低到10℃，加入泊洛沙姆2g得混合物，筛网过滤，冻干得粉末状微球。经JSM-5600型扫描电子显微镜观察，微球孔洞连续完整，微球均呈圆球状，且大小均匀规整，粒径范围27～78μm，平均粒径35μm。经Zeta电位分析仪测定，微球的Zeta电位置为(-29.4±1.54)mV，其表面所带电荷为负电荷。实施例5称取1g阿必鲁肽和1g齐考诺肽加水配成浓度为20％的药物溶液，将50g聚乳酸-聚乙二醇(280:50)用50mL乙酸乙酯和20mL苯甲醇溶解，将二者混合超声2min，形成白色均质初乳。初乳在1600rpm的均质下通过注射器加入到6℃的1000mL1％的聚乙烯醇溶液(含1％苯甲醇和1.5％乙酸乙酯)中，均质乳化2min得复乳。将复乳移至悬臂搅拌机上，转速为600rpm，搅拌1h，然后升温到45℃保持1小时，再降低到10℃，加入蔗糖12g得混合物，筛网过滤，冻干得粉末状微球。经JSM-5600型扫描电子显微镜观察，微球孔洞连续完整，微球均呈圆球状，且大小均匀规整，粒径范围15～40μm，平均粒径25μm。经Zeta电位分析仪测定，微球的Zeta电位置为(-22.4±1.68)mV，其表面所带电荷为负电荷。实施例6称取80mg艾塞那肽和120mg齐考诺肽加水配成浓度为25％的药物溶液，将48g聚丙交酯-乙交酯用80mL乙酸乙酯和15mL苯甲醇溶解，将二者混合超声2min，形成白色均质初乳。初乳在1600rpm的均质下通过注射器加入到6℃的1000mL0.15％的聚乙烯吡咯烷酮溶液(含0.5％苯甲醇和1.5％乙酸乙酯)中，均质乳化2min得复乳。将复乳移至悬臂搅拌机上，转速为600rpm，搅拌1h，然后升温到50℃保持1小时，再降低到10℃，加入甘露醇5g得混合物，筛网过滤，冻干得粉末状微球。经JSM-5600型扫描电子显微镜观察，微球孔洞连续完整，微球均呈圆球状，且大小均匀规整，粒径范围15～60μm，平均粒径30μm。经Zeta电位分析仪测定，微球的Zeta电位置为(-29.3±1.61)mV，其表面所带电荷为负电荷。实施例7称取20mg度拉糖肽和0.5g齐考诺肽加水配成浓度为30％的药物溶液，将80g聚羟基丁酸戊酸酯用50mL乙酸乙酯和12mL苯甲醇溶解，将二者混合超声2min，形成白色均质初乳。初乳在1600rpm的均质下通过注射器加入到6℃的1000mL0.15％的聚乙烯吡咯烷酮溶液(含1.5％苯甲醇和1.5％乙酸乙酯)中，均质乳化2min得复乳。将复乳移至悬臂搅拌机上，转速为600rpm，搅拌1h，然后升温到50℃保持1小时，再降低到10℃，加入乳糖12g得混合物，筛网过滤，冻干得粉末状微球。经JSM-5600型扫描电子显微镜观察，微球孔洞连续完整，微球均呈圆球状，且大小均匀规整，粒径范围10～90μm，平均粒径35μm。经Zeta电位分析仪测定，微球的Zeta电位置为(-27.2±1.39)mV，其表面所带电荷为负电荷。实施例8称取50mg阿必鲁肽和0.8g齐考诺肽加水配成浓度为25％的药物溶液，将80g聚乳酸-羟基乙酸(75:15)用30mL二氯甲烷和12mL苯甲醇溶解，将二者混合超声2min，形成白色均质初乳。初乳在1600rpm的均质下通过注射器加入到6℃的1000mL0.2％的聚乙烯醇溶液(含0.8％苯甲醇和1.5％乙酸乙酯)中，均质乳化2min得复乳。将复乳移至悬臂搅拌机上，转速为600rpm，搅拌1h，然后升温到50℃保持1小时，再降低到10℃，加入乳糖5g得混合物，筛网过滤，冻干得粉末状微球。经JSM-5600型扫描电子显微镜观察，微球孔洞连续完整，微球均呈圆球状，且大小均匀规整，粒径范围15～70μm，平均粒径25μm。经Zeta电位分析仪测定，微球的Zeta电位置为(-32.0±1.34)mV，其表面所带电荷为负电荷。实施例9称取0.5g艾塞那肽和8g齐考诺肽加水配成浓度为25％的药物溶液，将500g聚乳酸-聚乙二醇(18:2)用60mL乙酸乙酯和12mL苯甲醇溶解，将二者混合超声2min，形成白色均质初乳。初乳在1600rpm的均质下通过注射器加入到6℃的1000mL10％的聚乙烯醇溶液(含2％苯甲醇和1％乙酸乙酯)中，均质乳化2min得复乳。将复乳移至悬臂搅拌机上，转速为600rpm，搅拌1h，然后升温到50℃保持1小时，再降低到10℃，加入海藻糖40g得混合物，筛网过滤，冻干得粉末状微球。经JSM-5600型扫描电子显微镜观察，微球孔洞连续完整，微球均呈圆球状，且大小均匀规整，粒径范围10～80μm，平均粒径30μm。经Zeta电位分析仪测定，微球的Zeta电位置为(-23.6±1.97)mV，其表面所带电荷为负电荷。实施例10体外累计释放度的测定剪取长度约为5cm的透析袋(8000-14000)，放入盛有适量水的烧杯中，加热煮沸5min(从水沸腾开始计时)，将煮沸后的透析袋一端用细线扎紧，检漏。采用动态透析法进行体外累计释放度的测定。精密称实施例1、3、7、9制备的缓释微球40mg置入透析袋中，加入2mLPBS缓冲液(0.1M，pH＝7.4，含0.02％叠氮化钠)，封口，置于装有48mLPBS缓冲液的具塞锥形瓶中，放入(37.0±0.5)℃的恒温水浴摇床，以转速为100r·min-1的速度振摇，分别于0，5，10，15，20，25，30d各取出5mL，同时补加等量新鲜同温的PBS缓冲液，用紫外分光光度仪测定吸光度，计算累积释放百分率，绘制释放曲线如图1所示。图1的释放曲线可以看出，本发明的缓释微球制剂在30天内可持续稳定的释放药物，保证血药浓度的稳定，达到了本发明的目的。取实施例2、4、5、6、8制得的缓释微球制剂进行释放度测定，结果与实施例1、3、7、10测得的结果相近，表明实施例2、4、5、6、8、9提供的缓释微球制剂同样具有明显的缓释作用，保证血药浓度的稳定，达到了本发明的目的。实施例11体内药效学动物模型建立及分组清洁级雄性SD大鼠210只(180±20)g，适应性喂养1周后，按体重层次随机取30只，分为三组，分别为2w、4w、8w正常对照组(每组10只)，其余180只大鼠造模。模型组饲以高糖高脂饲料(在标准全价混合饲料的基础上添加蔗糖、炼猪油和蛋黄，热能含量21.6kJ/kg)。高糖高脂饲料组喂养4周后，腹腔注射链脲佐菌素枸橼酸缓冲液(临用前溶解在pH＝4.0的0.1mmol/L枸橼酸缓冲液内，25mg/kg，1次/d，连续2d)；正常对照组普通饲料喂养4周，再注射等量枸橼酸缓冲液，1次/d，连续2d。注射药物两天后间隔1d血糖测试仪测查大鼠空腹血糖(测试前禁食12h)，即注射后血糖，以血糖含量16.7mmol/L为糖尿病大鼠模型判定标准，大于16.7mmol/L的大鼠被作为观察对象，继续饲以普通饲料4周之后使用Vonfrey纤维测定大鼠后足的机械性痛阈值，下降50％者认为PDN造模成功。将造模成功的大鼠按血糖层次随机分为2w、4w、8w模型组(每组10只)，2w、4w、8w本实施例1、3、5、7、9缓释微球组(每组10只)。给药方法正常组：按生理盐水10mL/kg/d皮下注射；模型组：按生理盐水10mL/kg/d皮下注射；缓释微球组：5mg/kg每月一次性皮下注射，注射前微球先用混悬剂(3％羧甲基纤维素钠+0.1％Tween20)混悬；所有组都从PDN大鼠模型成立后，除缓释微球组，开始每日皮下注射一次，直到各组实验结束。实验期间各组大鼠均在相同条件之下饲养。统计学处理采用SPSS13.0软件进行统计学处理，计量资料用x±s表示，组间比较采用单因素方差分析和t检验，P＜0.05表示有统计学意义，P＜0.01表示有显著性差异。血糖测定分别于治疗后2周末、4周末、8周末三个时间点，各组随机取8只大鼠，应用稳步型血糖仪来测定大鼠尾静脉空腹血糖。各组血糖在各时间点的变化，如表1所示。表1各组大鼠血糖(mmol/L)在各时间点的变化(n＝8)组别2w4w8w正常组5.21±1.245.14±0.565.32±0.45模型组21.34±4.45**24.25±3.12**28.98±2.91**实施例112.65±0.87**△6.84±1.23*△△6.65±0.54△△实施例311.45±0.25**△7.33±0.71*△△6.27±1.26△△实施例510.35±0.51**△7.45±0.73*△△5.93±0.26△△实施例710.01±0.41**△8.02±0.66*△△7.01±0.26△△实施例910.25±0.12**△7.65±0.27*△△6.15±0.54△△注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。实验期间，随着时间延长，模型组大鼠尾静脉血糖明显升高，与正常组比较，2周，4周和8周时都有显著性的差异(P＜0.01)，而在实验期间，治疗组大鼠大鼠尾静脉血糖值呈降低的趋势，与模型组相比，2周时有统计学意义(P＜0.05)，4周和8周时，具有显著性的差异(P＜0.01)，与正常组相比，2周时具有显著性的差异(P＜0.01)，4周时有统计学意义(P＜0.05)，8周时无统计学意义(P＞0.05)。说明本发明的缓释微球组合物可以明显抑制血糖升高的作用。机械性痛阈测定分别于治疗后2周末、4周末、8周末，各组随机取8只大鼠，采用标准的Vonfrey纤维，采用up-down方法来检测大鼠后足的机械性痛阈值(MPT)。各组大鼠机械性痛阈(MPT)在各时间点的变化，如表2所示。表2各组大鼠MPT(g)在各时间点的变化(n＝10)注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。可见模型组随着实验时间延长，大鼠机械性痛阈值呈现明显降低趋势，与正常组相比，2周，4周，8周时具有显著性的差异(P＜0.01)；而在实验期间，治疗组大鼠机械性痛阈值呈升高的趋势，与模型组相比，2周时有统计学意义(P＜0.05)，4周和8周时，具有显著性的差异(P＜0.01)，与正常组相比，2周和4周时有统计学意义(P＜0.05)，8周时无统计学意义(P＞0.05)。说明本发明的缓释微球组合物可以明显提高糖尿病大鼠神经机械性痛阈值。当前第1页1 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