一种内盐型共轭有机小分子光敏剂、其合成方法及应用与流程

本发明属于有机小分子光敏剂领域，更具体地说，涉及一种内盐型共轭有机小分子光敏剂、其合成方法及应用。

背景技术：

自十九世纪八十年代光动力学治疗(photodynamic therapy，PDT)方法首次在临床应用以来，一直被认为是一种极具发展前景的无创治疗手段。与其他传统的癌症治疗方法如外科手术、化疗和放射疗法等不同，光动力学治疗选用合适的光敏剂(photosensitizer，PS)，在光照下产生细胞毒性的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，主要是单线态氧，对其所在位置的细胞产生毒性、致其死亡。非常重要的一点是，这一过程仅在光照条件下发生并且只发生在光敏剂存在的部位。这一特性决定了该治疗方法是具有优良的空间选择性，并且可以最大限度的减少副作用的发生。考虑到双光子激发在穿透深度、三维空间选择性和较小的光损伤等方面的优势，双光子激发的光动力治疗的理论早在十九世纪九十年代已经被提出。但是现在可用的双光子吸收的光敏剂在强极性溶剂中(生物环境)表现出很小的双光子吸收截面(δ)。例如目前商业用途的大环卟啉类化合物的双光子吸收截面只有1-50GM(1GM＝10-50cm4s photon-1)，这在很大程度了限制了双光子光动力疗法的应用。为了提高材料的双光子吸收截面，开发大共轭的分子骨架、刚性的平面结构、引入强的供体或者受体基团是最常用的方法。虽然这些方法能够制备出几百甚至几千GM的材料，但是这些数值都是在相对弱极性的溶剂中，如四氢呋喃。在强极性溶剂，如甲醇，依然不是很有效。因此，开发新型的双光子光敏剂，能够在强极性的溶剂中依然保持极大的双光子吸收截面具有极其重要的意义。

除了提高光敏剂的双光子吸收截面，选择合适的光动力治疗靶点有利于进一步放大单线态氧的破坏能力，从而提高双光子光动力治疗的疗效。线粒体一直被认为是最完美的亚细胞靶向位点。但是目前为止并没有这样的材料出现，主要原因可能是现有共轭有机小分子较低的双光子吸收截面和单线态氧量子效率，以及由于靶向功能修饰过程引起的双光子吸收截面的进一步降低。所以，开发一种新的分子结构能同时提高其双光子吸收截面，单线态氧量子产率和线粒体靶向的功能是必要的。考虑到分子电场与分子的双光子吸收截面是迫切相关的，而且线粒体表面负电荷的特性，在共轭分子中引入类似季铵盐的分子结构，可以赋予分子线粒体靶向的功能；带电荷的阳离子基团可以产生额外的电场，扰动分子电场在一定程度上改变分子的双光子吸收截面。同时，研究报道表面季铵盐类共轭聚合物可以表现出一定的单线态氧量子产率，可以作为一种潜在的光敏剂用于光动力治疗。因此，将内盐型分子结构引入共轭有机小分子是提高共轭分子在强极性溶剂中双光子吸收截面，实现单线态氧产生和线粒体靶向的有效途径之一。

中国专利申请公布号CN104693323，申请公布日：2015年6月10日，发明专利名称：共轭结构的含萘环的可见光光敏剂及其应用。该申请案中公开了一种通过简便的方法合成出共轭机构的含萘环光敏剂，使其紫外可见吸收的峰值红移至可见光区，可做外可见光光敏剂与2,4,6-三氯甲基均三嗪一起组成光敏引发系统在可见光照射下引发系类单体聚合。但该发明中共轭结构的含萘环的可见光光敏剂需要与其他物质配合形成引发体系，并且无法将其应用于光动力学治疗(PDT)领域。

中国专利申请公布号CN103705532A，申请公布日：2014年4月9日，发明专利名称：靶向胸苷激酶光敏剂及其药物组合物与治疗癌症的用途。该申请案中公开的靶向胸苷激酶光敏剂具有更大共轭系统吸收波长更长有利于治疗深度肿瘤，该波长区域不需要耗费光输出设备很多能量，甚至使用LED即可，使PDT更具实用性和经济性。但该发明中胸苷激酶光敏剂和化疗剂组合联用，双光子光动力治疗的效率一般，使用受到一定局限。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的共轭小分子光敏剂问题，本发明提供了一种内盐型共轭有机小分子光敏剂、其合成方法及应用，该内盐型共轭有机小分子光敏剂可以提高有机小分子光敏剂在强极性溶剂中双光子吸收截面，表现出极高的单线态氧量子产率和线粒体靶向能力，有效提高其双光子光动力治疗的效率。

本发明的目的通过以下技术方案实现。

内盐型共轭有机小分子光敏剂，其结构式如下：

内盐型共轭有机小分子光敏剂的制备方法，其步骤如下：

A.在装有磁子的单口瓶中加入前驱体，用四氢呋喃作溶剂，室温搅拌完全溶解后加入氢氧化钾的水溶液，接着回流反应1h；

B.反应完毕减压蒸馏除去四氢呋喃，用的稀盐酸溶液调至中性析出大量固体；

C.过滤；

D.用乙醇重结晶得到内盐型共轭有机小分子光敏剂。

更进一步的，步骤A中前驱体为寡聚苯乙炔撑为共轭主链同时具有甲酸甲酯末端和叔胺侧链。

更进一步的，步骤A中氢氧化钾的水溶液浓度为1～5mol/L。

更进一步的，步骤A中回流反应的温度为50～90℃。

更进一步的，步骤B中减压蒸馏的温度为30～40℃，压力为10～20kpa。

更进一步的，步骤B中稀盐酸溶液的浓度为1mol/L。

内盐型共轭有机小分子光敏剂的应用，其特征在于，该内盐型共轭有机小分子光敏剂应用于线粒体靶向的双光子光动力治疗。

更进一步的，所述线粒体靶向的双光子光动力治疗步骤为：

S1.先将Hela细胞接种在96孔细胞培养板上，接种量约为每孔0.5×10⁴个细胞；

S2.孵育24h后，采用含有20μM内盐型共轭有机小分子的培养液孵育细胞；

S3.2h后用PBS清洗细胞，重新培养在DMEM培养液中，每个孔在1千赫兹光密度1.0W cm^-2的750nm飞秒激光器下照射；

S4.光照后的细胞继续培养24h后用MTT检测细胞活性，分析光动力学治疗的效果。

相比于现有技术，本发明的优点在于：

(1)本发明共轭有机小分子光敏剂，由于引入了内盐型分子结构，产物除具有传统共轭有机小分子易剪裁，易代谢，生物毒性小等特性外，其在强极性溶剂中双光子吸收截面得到了极大的提高；

(2)本发明共轭有机小分子光敏剂相对于商业化光敏剂的双光子吸收截面提高了近两个数量级；

(3)本发明共轭有机小分子光敏剂的制备方法易操作，成本低。

(4)本发明共轭有机小分子光敏剂应用于线粒体靶向的双光子光动力治疗，有效的拓宽了其使用范围。

(5)本发明共轭有机小分子光敏剂应用于线粒体靶向的双光子光动力治疗，表现出了极高的单线态氧量子产率和线粒体靶向能力，可以有效提高双光子光动力治疗的效率。

附图说明

图1为内盐型共轭有机小分子光敏剂的¹HNMR谱图；

图2为内盐型共轭有机小分子光敏剂的单晶结构；

图3为开孔Z-scan技术用于测试内盐型共轭有机小分子光敏剂在甲醇中的双光子吸收截面；

图4为内盐型共轭有机小分子光敏剂的单线态氧产率，以商业光敏剂TMPyP4为标准；

图5为内盐型共轭有机小分子光敏剂线粒体靶向，内盐型共轭有机小分子光敏剂与商业线粒体靶向探针(Mito tracker red)共定位实验图；

图6为内盐型共轭有机小分子光敏剂用于双光子光动力治疗；

图7为蛋白印迹技术验证内盐型共轭有机小分子光敏剂引起的内源性线粒体凋亡诱导的双光子光动力治疗；

图8内盐型共轭有机小分子光敏剂引起的内源性线粒体凋亡诱导的双光子光动力治疗的示意图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体的实施例，对本发明作详细描述。

实施例1

制备内盐型共轭有机小分子光敏剂的主要原料有1,4-二碘-2,5-苯二酚、二氯氨基盐酸盐、4-乙炔基苯甲酸甲酯，四三苯基膦钯(Pd(PPh3)4)、丙酮(aceton，分析级)、二异丙胺(DIPA，分析级)、石油醚(工业级)、二氯甲烷(工业级)、氢氧化钾(分析纯)、无水乙醇(分析纯)等。反应前驱体采用Sonogashira偶联反应，内盐型共轭有机小分子光敏剂通过水解后自身质子化作用形成。

本发明的内盐型共轭有机小分子光敏剂具体合成方法如下：

1.1,4-二[3-(N,N-二乙基胺)-1-氧丙基]-2,5-二碘苯(单体1)的制备步骤如下：

在带有回流冷凝管和磁子的500mL两口圆底烧瓶中加入1,4-二碘-2,5-苯二酚(10.8g,0.03mol)、二氯氨基盐酸盐(12.38g,0.072mmol)、无水碳酸钾(24.8g,0.18mol)，加毕后将整个反应体系密封抽真空，然后充入氮气，保持整个反应过程在氮气氛围中进行；用针筒注入溶剂丙酮(250mL)，然后加热65～90℃回流3天。反应完毕，过滤得有机相，减压蒸馏除去溶剂得到粗产品；用石油醚、二氯甲烷(石油醚：二氯甲烷＝8：1)和三乙胺(5％体积比)的混合洗脱液通过硅胶柱提纯，再用正己烷重结晶得白色的晶体(9.3g，0.0167mol)。

2.1,4-二(4-甲氧基羰基苯乙炔)-2,5-二[3-(N,N-二乙基胺)-1-氧丙基]苯的制备步骤如下：

将4-乙炔基苯甲酸甲酯(0.5g,3mmol)、1,4-二[3-(N,N-二乙基胺)-1-氧丙基]-2,5-二碘苯(0.8g，1.42mmol)、碘化亚铜(0.052g,0.3mmol)、四三苯基膦钯(0.12g，0.15mmol)依次加入带有回流冷凝管和磁子的100mL两口圆底烧瓶中，反应装置在氮气保护下用注射器注入混合溶剂四氢呋喃(20mL)和二异丙胺(30mL)，加热至65℃反应24h。反应完毕过滤取滤液减压蒸馏浓缩后用石油醚和二氯甲烷(石油醚：二氯甲烷＝8：1)的混合洗脱液通过硅胶柱提纯，得到黄色固体粉末(1.25g，2mmol)。

3.1,4-二(4-羧基苯乙炔)-2,5-二[3-(N,N-二乙基胺)-1-氧丙基]苯(DBA)的制备步骤如下：

将1,4-二(4甲氧基羰基苯乙炔)-2,5-二[3-(N,N-二乙基胺)-1-氧丙基]苯加入单口圆底烧瓶中，用四氢呋喃作溶剂，在室温搅拌(600-1500rpm)的条件下逐滴加入氢氧化钾的水溶液(1mol/L)反应1小时。反应完毕减压蒸馏除去四氢呋喃，用稀盐酸溶液(1mol/L)调至中性析出大量固体，过滤得到的固体用乙醇重结晶最终得到内盐型共轭有机小分子光敏剂。

所得产物¹HNMR表征结果如图1所示，具体如下：

1H NMR(CD3OD,400MHz):8.05(d,J＝8.4Hz,4H),7.62(d,J＝8.4Hz,4H),7.35(s,2H),4.52–4.45(m,4H),3.74–3.67(m,4H),3.42(q,J＝7.3Hz,8H),1.34(q,J＝7.6Hz,12H).13C NMR(CD3OD,100MHz):152.94,131.01,129.52,117.02,113.94,94.34,64.27,50.91,48.74,8.10。

图2为内盐型共轭有机小分子光敏剂的单晶结构图，单晶解析数据证明了该共轭有机小分子的内盐型构型。

内盐型共轭有机小分子光敏剂双光子吸收截面、单线态氧量子产率及线粒体靶向能力：

双光子吸收截面：双光子吸收截面的测试是基于经典的Z-scan技术。具体过程如下：

激发光源是Ti：sapphire(脉冲：100fs；重复频率：80MHz)。具体如下：测试过程中，激光入射光首先通过一个开孔率为1/10，转速为315r/s的斩波器。该高斯光束通过凸透镜聚焦于样品，通过标准的锁相放大技术用硅光电二极管检测透射光。测试曲线是基于焦点(z＝0)镜像对称的，在焦点处表现出最小的透射率。双光子吸收系数(β)可以通过归一化透射率的方法计算。

I₀₀是峰值强度，z是样品位置，是光束的衍射长度，ω₀是光束在焦点处的束腰半径，L_eff＝[1-exp(-a₀L)]/a_o是样品的有效厚度。作为一个宏观参数,β＝δ₂'N_Ad₀×10^-3,其中δ₂'是分子的双光子吸收截面(cm⁴GW^-1)，N_A是阿伏伽德罗常数，d₀是染料分子的摩尔浓度(单位：M L^-1)。通常双光子吸收截面定义为δ＝hvδ₂'(单位：GM)。

根据上述公式与图3中开孔Z-scan技术用于测试内盐型共轭有机小分子光敏剂在甲醇中的双光子吸收截面数据，计算得内盐型共轭有机小分子光敏剂(DBA)在甲醇中的双光子吸收截面高达3260GM。相比商业普遍使用的光敏剂(5,10,15,20-Tetrakis(1-methyl-4-pyridinio)porphyrin tetra(p-toluenesulfonate，TMPyP₄)在甲醇中只有10GM的双光子吸收截面，该内盐型共轭有机小分子光敏剂提高了两个数量级的双光子吸收截面，为其在双光子光动力治疗领域提供了良好的应用前景。

单线态氧量子产率：通过直接检测单线态氧在1270nm附近的特征发射峰证明了该内盐型共轭有机小分子具有产生单线态氧的能力，如图4所示。进一步与已知单线态氧量子产率的商业光敏剂TMPyP₄(单线态氧量子产率74％)对比，计算得该内盐型共轭有机小分子的单线态氧量子产率高达72.8％，可以与该商业光敏剂相媲美。

线粒体靶向：通过细胞共定位实验发现内盐型共轭有机小分子的发光位置与商业的线粒体探针的发光位置有完美的重合，如图5所示，验证了该材料线粒体靶向的能力。

实施例2

内盐型共轭有机小分子光敏剂用于双光子光动力治疗步骤如下：

S1.先将Hela细胞接种在96孔细胞培养板上，接种量约为每孔0.5×10⁴个细胞，孵育条件同上；

S2.孵育24h后，以含有20μM内盐型共轭有机小分子光敏剂的培养液孵育细胞；

S3.2h后用PBS清洗细胞然后重新培养在DMEM培养液中，每个孔在1千赫兹光密度1.0W cm^-2的750nm飞秒激光器下照射；

S4.然后光照后的细胞继续培养24h后用MTT检测细胞活性，分析双光子光动力治疗的效果。

图6为内盐型共轭有机小分子光敏剂用于双光子光动力治疗效果，相比商业光敏剂TMPyP₄，DBA表现出更加良好的双光子光动力治疗。

蛋白印迹技实验证明内盐型共轭有机小分子光敏剂可以诱导细胞产生细胞色素c，激活凋亡因子caspase-3，如图7所示，从而导致最终的细胞凋亡。图8给出了该内盐型共轭有机小分子光敏剂引起的内源性线粒体凋亡诱导的双光子光动力治疗示意图。

以上示意性地对本发明创造及其实施方式进行了描述，该描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明创造的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。所以，如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本专利的保护范围。