一种磷酸铝佐剂及其制备方法与应用与流程

本发明属于医药
技术领域：
，具体涉及一种磷酸铝佐剂及其制备方法与应用。
背景技术：
：铝佐剂(aluminum-cotainingadjuvants)包括氢氧化铝佐剂(aluminiumhydroxideadjuvant)和磷酸铝佐剂(aluminiumphosphate)两种。氢氧化铝佐剂等电点11.4，是大小为2-10nm的纤维状粒子，聚集后以松散的颗粒形式存在。化学结构上氢氧化铝以羟基形式存在，在pH7.4的溶液中，胶体结构以阳离子形式是阴离子抗原的良好吸附剂。磷酸铝佐剂不是组分单一的物质，而是羟基磷酸铝复合物，磷酸基团对羟基的置换程度取决于反应物和沉淀的条件及其等电点。商品磷酸铝佐剂的等电点是5.0，在pH7.4的溶液中呈阴离子形式存在，是阳离子抗原的良好吸附剂。铝佐剂具有高度的生物安全性。Stanley等通过同位素标记法证明肌肉注射的铝佐剂在机体内可以被有效的溶解吸收并最终通过尿液排出。铝佐剂可通过多种机制增强抗原的免疫原性提高免疫应性。作用机制包括：可溶性抗原与佐剂结合成的颗粒形式有利于APCs吞噬；注射位点的沉积作用；诱导T细胞显著增殖，增强Th2型免疫应答；诱导单核细胞分化为成熟的CD细胞。因此，铝佐剂在疫苗制剂工艺中被广泛应用，特别是含有蛋白或多糖抗原的疫苗中。美国授权的含铝佐剂的儿童用疫苗包括：白喉-破伤风-无细胞百日咳疫苗(DTaP)，b型流感嗜血杆菌结合疫苗，肺炎结合疫苗，乙肝疫苗，人乳头瘤疫苗。在生理条件下，磷酸铝佐剂适用于吸附阳离子抗原，被应用于多价肺炎结合疫苗中。磷酸铝佐剂的制备，一般方法是将可溶性铝盐溶液和磷酸盐溶液以一定的比例混合。根据混合的方法不同，具体常见包括连续反应法和批量反应法。配制磷酸铝佐剂需要可溶性铝盐溶液，磷酸盐溶液，以及合适的置换缓冲溶液体系。铝佐剂在生产和使用过程中经历了两种环境：佐剂吸附抗原的疫苗环境；皮下或者肌肉注射后的组织间液环境。佐剂吸附抗原的疫苗环境，决定了抗原的吸附率；而吸附率会影响机体对抗原的免疫应答反应。铝佐剂颗粒的大小是铝吸附制品质量评价的重要评价指标，并且可能影响到制品的免疫特性。在疫苗制剂中，典型的铝佐剂粒径大小＜10nm。因此，如何有效的控制磷酸铝佐剂的粒径大小是制剂工艺中的重要环节。技术实现要素：本发明目的是提供一种磷酸铝佐剂及其制备方法与应用。本发明技术方案如下：一种磷酸铝佐剂的制备方法，包括以下步骤：1)磷酸铝溶液的制备将碱性可溶性磷酸盐溶液以及可溶性铝盐溶液以相同的恒定流速同时滴加到反应容器中，反应制得磷酸铝溶液，在反应过程中维持磷酸铝溶液的pH恒定在4.0-6.0；或者，将碱性可溶性磷酸盐溶液以恒定的流速滴加到一定体积的可溶性铝盐溶液中，反应制得磷酸铝溶液，直到pH达到4.0-6.0；其中，所述可溶性磷酸盐包括磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾中的一种或几种；所述碱性可溶性磷酸盐溶液为由所述可溶性磷酸盐溶液和氢氧化钠溶液配制的具有一定酸碱缓冲能力的混合溶液，其中磷酸根离子的浓度为0.290-0.430mol/L；所述可溶性铝盐包括硫酸铝钾，硝酸铝，氯化铝中的一种或几种；2)磷酸铝溶液的置换处理将步骤1)制得的磷酸铝溶液与置换溶液按体积比1:3-1:5混匀，将所得混合液自然沉降或离心后除去上清，收集磷酸铝沉淀；所述置换溶液为注射用水、生理盐水或磷酸盐缓冲溶液；所述磷酸盐缓冲溶液中含有：0.137mol/LNaCl，2.7mmol/LKCl，10mmol/LNa2HPO4，2mmol/LNaH2PO4；3)磷酸铝溶液的重悬处理将步骤2)所得磷酸铝沉淀样品灭菌，然后进行重悬处理；即得磷酸铝佐剂溶液。上述制备方法中，步骤1)所述pH允许偏差±0.02。步骤1)所述可溶性磷酸盐优选为磷酸氢二钠。步骤1)所述碱性可溶性磷酸盐的pH为11.5-13.0，优选为12.5。步骤1)所述可溶性铝盐优选为氯化铝。步骤1)所述可溶性铝盐溶液浓度优选为0.156mol/L。步骤1)所述可溶性磷酸盐溶液的浓度为0.390-0.468mol/L，优选为0.429mol/L。步骤1)所述碱性可溶性磷酸盐溶液中磷酸根离子的浓度优选为0.39mol/L。步骤1)所述流速为20-40mL/min，优选为30mL/min。步骤2)所述置换溶液优选为生理盐水。所述生理盐水与本领域常规含义相同；优选为0.150mol/LNaCl的溶液。步骤2)采用自然沉降或离心的置换处理方法，一般需要重复该操作至少3-6次。优选地，步骤2)置换处理所得磷酸铝沉淀样品的体积与置换处理前磷酸铝溶液体积相同。步骤2)置换处理的目的主要是通过改变磷酸铝溶液缓冲体系，去除游离的磷酸根离子和铝离子，获得纯度高的磷酸铝样品。步骤3)所述灭菌可采用本领域常规方法，例如中国药典中记载的灭菌方法。优选采用高压灭菌，温度121℃，时间为10-30min。步骤3)所述重悬处理为将灭菌处理后的磷酸铝样品在搅拌速度200-800rpm条件下搅拌1-16h；优选在搅拌速度400-800rpm条件下搅拌4-16h。具体地，可将步骤2)所得磷酸铝沉淀样品放入无热源的1L蓝盖瓶中，并加入磁力搅拌子，灭菌，然后进行重悬处理；所述搅拌优选采用磁力搅拌器。优选磁力搅拌子的大小为具体地，上述制备方法包括以下步骤：1)磷酸铝溶液的制备将碱性磷酸氢二钠溶液以及氯化铝溶液以相同的恒定流速同时滴加到反应容器中，反应制得磷酸铝溶液，在反应过程中维持磷酸铝溶液的pH恒定在4.0-6.0；或者，将碱性磷酸氢二钠溶液以恒定的流速滴加到一定体积的氯化铝溶液中，反应制得磷酸铝溶液，直到pH达到4.0-6.0；所述氯化铝溶液的浓度为0.156mol/L；所述碱性磷酸氢二钠溶液为由磷酸氢二钠溶液溶液和氢氧化钠溶液配制的具有一定酸碱缓冲能力的混合溶液，其中磷酸根离子的浓度为0.293-0.390mol/L；所述碱性磷酸氢二钠溶液的pH为12.5；所述流速为20-40mL/min；2)磷酸铝溶液的置换处理将步骤1)制得的磷酸铝溶液与置换溶液按体积比1:3-1:5混匀，将所得混合液自然沉降或离心后除去上清，收集磷酸铝沉淀；所述置换溶液为注射用水、生理盐水或磷酸盐缓冲溶液；所述磷酸盐缓冲溶液中含有：0.137mol/LNaCl，2.7mmol/LKCl，10mmol/LNa2HPO4，2mmol/LNaH2PO4；3)磷酸铝溶液的重悬处理将步骤2)所得磷酸铝沉淀样品灭菌，然后进行重悬处理；即得磷酸铝佐剂溶液；所述重悬处理为将灭菌处理后的磷酸铝样品在搅拌速度200-800rpm条件下搅拌1-16h。本发明还包括实现上述磷酸铝佐剂制备方法的反应装置，其中一种反应装置为连续反应装置，其中一种反应装置为批量反应装置。所述连续反应装置，包括反应容器1，分别盛放碱性可溶性磷酸盐溶液及可溶性铝盐溶液的贮存容器2，用于分别将碱性可溶性磷酸盐溶液、可溶性铝盐溶液以恒定流速泵入反应容器的泵3，在所述泵3的输送下，碱性可溶性磷酸盐溶液和可溶性铝盐溶液通过“Y”型三通4汇入同一管道5，然后进入所述反应容器1；所述连续反应装置还包括用于检测所述反应容器中反应液pH值的pH计，以及用于搅拌所述反应容器中反应液的磁力搅拌子和磁力搅拌器。进一步地，所述反应容器与泵之间，及所述贮存容器与泵之间通过管道连接(优选硅胶管道)。在一个实施例方案中，连续反应装置是将可溶性铝盐和磷酸盐溶液(或碱性磷酸盐溶液)以恒定速度共同滴加到反应容器中，在制备过程中维持磷酸铝溶液的pH恒定。如图2所示，所述批量反应装置，包括反应容器1，盛放碱性可溶性磷酸盐溶液的贮存容器2，用于将碱性可溶性磷酸盐溶液以恒定流速泵入反应容器的泵3，所述批量反应装置还包括用于检测所述反应容器中反应液pH值的pH计，以及用于搅拌所述反应容器中反应液的磁力搅拌子7和磁力搅拌器。进一步地，所述反应容器可事先存放一定体积的可溶性铝盐溶液。进一步地，所述反应容器与泵之间，及所述贮存容器与泵之间通过管道连接(优选硅胶管道)。在一个实施例方案中，批量反应装置是将磷酸盐溶液以恒定的速度滴加到一定体积的可溶性铝盐中，直到pH达到某一特定值。本发明还包括上述方法制得的磷酸铝佐剂(溶液)。本发明制备的磷酸铝佐剂粒径可以有效的控制在7.5-15nm之间；等电点4.0-6.0；优选地，所述磷酸铝佐剂粒径为7.5-10nm，和/或等电点为5.0。优选地，所述磷酸铝佐剂表面电荷为-36～36mV。本发明还包括上述磷酸铝佐剂在制备疫苗中的应用。本发明所制备的磷酸铝佐剂在特定的缓冲溶液体系中应用于吸附一种或者多种抗原。所述疫苗优选为多价肺炎结合疫苗、乙型肝炎疫苗、无细胞百白破疫苗、白喉-破伤风-无细胞百日咳疫苗(DTaP)、b型流感嗜血杆菌结合疫苗等。其中，优选多价肺炎结合疫苗，包括多种血清型肺炎链球菌荚膜多糖和载体蛋白共价连接形成的复合物，肺炎链球菌荚膜多糖血清型包括1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、18C、19F、19A、和23F，载体蛋白包括DT、TT、CRM197。其中，优选所述疫苗中磷酸铝佐剂的浓度为0.1-0.4mg/mL。进一步研究发现，所述疫苗中铝的最终吸附浓度在0.22-0.28mg/mL是磷酸铝佐剂的最佳浓度。本发明采用不同pH和不同磷酸离子浓度下制备磷酸铝，对磷酸铝的配制工艺和后处理工艺进行了探索改良，以获得吸附能力和外观形态均良好的磷酸铝佐剂，从而满足多价肺炎结合疫苗等制备工艺的要求。本发明对现有磷酸铝佐剂制备工艺进行改进，采用本发明方法可以实现磷酸铝佐剂表面电荷和粒径趋于稳定且pH值更加接近于人体体液pH值，适用于一种或多种抗原的吸附，符合多种疫苗在制剂中的应用需求。附图说明图1为本发明连续反应装置示意图。图2为本发明批量反应装置示意图。附图标记：反应容器1，贮存容器2，泵3，“Y”型三通4，管道5。具体实施方式本发明主要涉及磷酸铝佐剂的配制方法、置换处理、重悬处理以及吸附能力评价等方面。更具体的来说下文所述的本发明针对所属领域中关于使磷酸铝佐剂表面电荷和粒径趋于稳定且适用于一种或多种抗原的吸附。上面的公开一般性描述了本发明。通过下面的特定实施例可以更加完全的理解本发明。这些实例仅仅用于阐明目的并且不限定本发明的应用范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。以下所述的磷酸铝样品的表面电荷(surfacepotential)通过ZetasizerNanoZSP设备测定。实验例1磷酸铝溶液的制备方法研究本实验例磷酸铝溶液配制方法包括：连续磷酸铝的制备方法和批量磷酸铝的制备方法。连续磷酸铝的制备方法包括：一定浓度的磷酸盐溶液和碱式磷酸盐溶液的配制；在连续反应容器装置中，以恒定的流速混合可溶性铝盐溶液和磷酸盐溶液，或者以恒定的流速混合可溶性铝盐溶液和碱式磷酸盐溶液，在配制过程中维持反应体系的pH在某一恒定值；利用蠕动泵以恒定的流速从反应容器溶液中泵出已制备的样品，维持反应容器中恒定的溶液体积；连续收集制备条件稳定后的磷酸铝样品。如图1所示，连续反应容器装置包括：反应容器(250mL烧杯)，用于分别将碱性可溶性磷酸盐溶液、可溶性铝盐溶液以恒定流速泵入反应容器的泵(本实施例采用的是GE快速纯化系统型号AKTAprimeplus)，硅胶管道(16#)，“Y”型三通(鲁尔接头，型号2.4mm，3/32英寸)，实验室pH计(本实施例采用的是METTLERTOLEDO型号FE20)，磁力搅拌子(本实施例采用的是型号)，磁力搅拌器(本实施例采用的是IKA型号RCTBS25)。批量磷酸铝的制备方法包括：在反应容器中加入一定体积的可溶性铝盐溶液，以恒定的流速滴加磷酸盐溶液或碱式磷酸盐溶液。在制备过程中，磷酸铝样品的pH逐渐降低最终达到目的pH值。利用蠕动泵以恒定的流速从反应容器溶液中泵出已制备的样品。如图2所示，批量反应容器装置包括：反应容器(250mL烧杯)，用于将碱性可溶性磷酸盐溶液以恒定流速泵入反应容器的泵(本实施例采用的是GE快速纯化系统型号AKTAprimeplus)，硅胶管道(16#)，实验室pH计(本实施例采用的是METTLERTOLEDO型号FE20)，磁力搅拌子(本实施例采用的是型号)，磁力搅拌器(本实施例采用的是IKA型号RCTBS25)。本实验例所述的磷酸铝溶液配制体积是200mL。在制备过程中，磷酸根离子作为缓冲体系，使磷酸铝溶液的pH维持可以维持在某一恒定值。实验材料：氯化铝溶液，浓度0.156mol/L，体积100mL。磷酸氢二钠溶液，浓度分别为0.390mol/L和0.468mol/L。磷酸盐溶液，根据表1所示的比例由上述磷酸氢二钠溶液配制，用水调节体积至100mL。氢氧化钠溶液，浓度0.3mol/L。碱式磷酸氢二钠溶液，由上述磷酸氢二钠溶液和氢氧化钠溶液按照表1所示的比例配制，用水调节体积至100mL。制备方法：样品编号1.1-1.5的磷酸铝溶液的制备方法：使用上述连续反应容器装置配置，使用的是磷酸盐溶液。样品编号2.1-2.5的磷酸铝溶液的制备方法：使用上述批量反应容器装置配置，使用的是磷酸盐溶液。样品编号3.1-3.6的磷酸铝溶液的制备方法：使用上述连续反应容器装置配置，用碱式磷酸盐溶液。样品编号4.1-4.6的磷酸铝溶液的制备方法：使用上述批量反应容器装置配置，用碱式磷酸盐溶液。本实施例所述的制备pH值包括：4.0，4.5，5.0，5.5，6.0；pH允许偏差±0.02。在3.1-4.6样品的制备方案中，使用碱式磷酸盐溶液，其中磷酸盐离子的摩尔数按比例依次降低，浓度为：0.284-0.380mol/L。通过应用碱性磷酸盐溶液取代磷酸盐溶液配制铝佐剂，磷酸铝佐剂中磷酸基团对羟基的置换程度降低，所获得的磷酸铝佐剂表面电荷性质发生了本质的改变。从表1的1.3和2.3样品中可以看出，本实施例条件下制备的磷酸铝溶液样品的等电点为5.0；从表1的3.1-3.6，4.1-4.6可以分别看出，通过降低配制体系中磷酸盐的浓度，样品的等电点分别升高到5.5和6.0。因此，通过工艺改进可以获得的磷酸铝佐剂pH值更加接近于人体体液pH值，符合多种疫苗在制剂中的应用需求。表1：磷酸铝佐剂连续制备工艺方案表1中pH是指所制得的磷酸铝溶液样品的等电点；P/Al是指溶液中磷酸离子和铝离子的摩尔比值；磷酸盐溶液是指磷酸氢二钠溶液，浓度分别为0.390mol/L和0.468mol/L；表面电荷是指所制得的磷酸铝溶液样品的胶体表面所反映的净电荷。实验例2磷酸铝样品置换处理方法研究本实验例磷酸铝样品置换处理是指将制得的磷酸铝溶液通过离心或超滤的方法改变磷酸铝沉淀的缓冲体系，置换去除游离的磷酸根离子以及其他盐离子。本实验例所述使用连续反应装置或批量反应装置配制磷酸铝，体积是200mL，pH值是5.0，允许偏差±0.02。本实施例所述的可溶性铝盐溶液是氯化铝溶液，浓度0.156mol/L，体积100mL；可溶性磷酸盐溶液是磷酸氢二钠溶液，浓度为：0.390mol/L；本实施例所述的氢氧化钠溶液，浓度为：0.3mol/L。本实施例所述的碱式磷酸盐溶液由上述可溶性磷酸盐溶液和氢氧化钠溶液配制的混合溶液，用水调节终体积为100mL，磷酸根终浓度包括0.317mol/L。磷酸铝溶液样品5.1-5.6采用连续磷酸铝的制备方法(同实验例1)；磷酸铝溶液样品5.7-5.9采用批量磷酸铝的制备方法(同实验例1)。将以上制得的磷酸铝溶液样品分别进行置换处理，即将磷酸铝溶液样品与置换溶液按照体积比1:3在容器中混匀、自然沉降后除去上清；重复3次，收集磷酸铝沉淀。其中，样品5.1、5.4、5.7采用注射用水(S1)为置换溶液；样品5.2、5.5、5.8采用生理盐水(S2，即0.150mol/LNaCl溶液)为置换溶液；样品5.3、5.6、5.9采用磷酸盐缓冲溶液(S3)为置换溶液；所述磷酸盐缓冲溶液成分：0.137mol/LNaCl，2.7mmol/LKCl，10mmol/LNa2HPO4，2mmol/LNaH2PO4。分别检测磷酸铝溶液在置换过程中三个阶段的pH，包括：1.制备容器中样品pH，2.置换前收集容器中样品pH，3.置换后收集容器中样品pH。结果见表2。从表2中可以看出，相对其他置换溶液条件使用生理盐水处理的样品pH更加恒定不变，有利于维持磷酸铝佐剂结构和吸附能力的稳定性。表2：磷酸铝佐剂样品的置换处理表2中磷酸铝溶液制备阶段的pH是指所制得的磷酸铝溶液样品的等电点；磷酸盐溶液是指磷酸氢二钠溶液，浓度分别为0.390mol/L；置换阶段的pH是指所置换后所得的磷酸铝溶液样品的等电点。实验例3磷酸铝佐剂的重悬处理研究本实验例所述磷酸铝佐剂的重悬处理是指将置换后的磷酸铝样品高压灭菌处理，冷却后以不同的搅拌速度重悬处理。1)磷酸铝溶液的制备方法同实验例2，样品编号5.5。2)磷酸铝溶液的置换处理将步骤1)制得的磷酸铝溶液与生理盐水按体积比1:3混匀，将所得混合液自然沉降后除去上清，重复3次，收集磷酸铝沉淀。3)将步骤2)所得磷酸铝沉淀样品于121℃高压灭菌30min后，冷却至常温，指用磁力搅拌子重悬，搅拌速度200-1600rpm，搅拌时间1-16h。结果见表3。从表3中可以看出，重悬处理的搅拌速度和搅拌时间是影响磷酸铝粒径的两个关键因素。其中，在搅拌速度为400-800rpm搅拌时间为4-16h条件下，磷酸铝佐剂的粒径可以有效的控制在7.5-10nm之间。表3：磷酸铝佐剂样品的重悬条件样品编号搅拌速度(rpm)搅拌时间(h)粒径(nm)6.1200114.5356.2200413.3976.32001610.2586.4400114.8236.540049.4226.6400169.2756.7800112.2886.880049.9546.9800168.6886.10160016.5756.11160046.2876.121600165.754实验例4磷酸铝佐剂吸附评价采用吸附蛋白的方法评价磷酸铝佐剂的吸附能力，其中铝佐剂吸附为磷酸铝佐剂在特定的缓冲溶液体系中应用于用来吸附一种或者多种抗原。实验样品：实验例3样品编号为6.8的磷酸铝佐剂。实验方法：将一种或者多种抗原(本实验例使用的是破伤风类毒素蛋白)加入到特定的缓冲溶液中，再按表4加入不同浓度的磷酸铝佐剂，搅拌吸附，测定磷酸铝吸附率；吸附率％＝1-上清蛋白/总蛋白。所述特定的缓冲溶液包含以下组分：最终浓度0.150mol/L的氯化钠溶液、最终浓度为5mmol/L且pH为6.1-6.5的琥珀酸盐溶液以及最终质量百分比为0.02％的聚山梨醇酯80溶液。表4：磷酸铝佐剂吸附评价从表4中可以看出，磷酸铝佐剂的吸附率和铝的最终浓度呈正相关关系；当铝的最终浓度高于0.28mg/mL时，吸附率增加缓慢达到了平台期；铝的最终浓度在0.22-0.28mg/mL是磷酸铝佐剂的最佳浓度。实施例1一种磷酸铝佐剂的制备方法，包括以下步骤：1)磷酸铝溶液的制备将碱性磷酸氢二钠溶液以及氯化铝溶液以相同的恒定流速同时滴加到反应容器中，反应制得磷酸铝溶液，在反应过程中维持磷酸铝溶液的pH恒定在5.0，pH允许偏差±0.02；可以连续收集制备条件稳定后的磷酸铝样品，例如利用蠕动泵以恒定的流速从反应容器溶液中泵出已制备的样品，维持反应容器中恒定的溶液体积；所述氯化铝溶液的浓度为0.156mol/L，体积100mL；所述碱性磷酸氢二钠溶液为由浓度为0.390mol/L的磷酸氢二钠溶液溶液77.84mL、浓度0.3mol/L的氢氧化钠溶液13.17mL和注射用水8.99mL配制的具有一定酸碱缓冲能力的混合溶液；所述流速为30mL/min；制得磷酸铝溶液200mL；2)磷酸铝溶液的置换处理将步骤1)制得的磷酸铝溶液与生理盐水(0.150mol/LNaCl溶液)按体积比1:3混匀，将所得混合液自然沉降后除去上清，重复3次，收集磷酸铝沉淀；3)磷酸铝溶液的重悬处理将步骤2)所得磷酸铝沉淀样品121℃高压灭菌30min，冷却至常温，用磁力搅拌子重悬，搅拌速度800rpm，搅拌时间4h，即得磷酸铝佐剂溶液，浓度为1.836mg/mL。本实施例可以获得的磷酸铝粒径为9.422nm，表面电荷18mV，等电点为5.43。4)磷酸铝佐剂的吸附评价将多价肺炎结合疫苗、白喉-破伤风-无细胞百日咳疫苗(DTaP)、b型流感嗜血杆菌结合疫苗分别加入到特定的缓冲溶液中(同实验例4)，再加入步骤3)所制得的磷酸铝佐剂溶液使其终浓度为0.26mg/mL，搅拌吸附，测定磷酸铝吸附率；吸附率％＝1-上清蛋白/总蛋白。测得吸附率分别为86.2％、87.8％、85.4％实施例2一种磷酸铝佐剂的制备方法，包括以下步骤：1)磷酸铝溶液的制备将碱性磷酸氢二钠溶液以及氯化铝溶液以相同的恒定流速同时滴加到反应容器中，反应制得磷酸铝溶液，在反应过程中维持磷酸铝溶液的pH恒定在4.0，pH允许偏差±0.02；所述氯化铝溶液的浓度为0.156mol/L；所述碱性磷酸氢二钠溶液为由磷酸氢二钠溶液溶液和氢氧化钠溶液配制的具有一定酸碱缓冲能力的混合溶液，其中磷酸根离子的浓度为0.429mol/L；所述碱性磷酸氢二钠溶液的pH为12.5；所述流速为25mL/min；2)磷酸铝溶液的置换处理将步骤1)制得的磷酸铝溶液与注射水按体积比1:5混匀，将所得混合液自然沉降后除去上清，重复3次，收集磷酸铝沉淀；3)磷酸铝溶液的重悬处理将步骤2)所得磷酸铝沉淀样品121℃高压灭菌30min，冷却至常温，用磁力搅拌子重悬，搅拌速度600rpm，搅拌时间8h，即得磷酸铝佐剂溶液，浓度为2.200mg/mL。本实施例可以获得的磷酸铝粒径为8.353nm，表面电荷-24mV，等电点为5.10。4)磷酸铝佐剂的吸附评价将多价肺炎结合疫苗、白喉-破伤风-无细胞百日咳疫苗(DTaP)、b型流感嗜血杆菌结合疫苗分别加入到特定的缓冲溶液中(同实验例4)，再加入步骤3)所制得的磷酸铝佐剂溶液使其终浓度为0.22mg/mL，搅拌吸附，测定磷酸铝吸附率；吸附率％＝1-上清蛋白/总蛋白。测得吸附率分别为72.9％、82.3％、79.6％实施例3一种磷酸铝佐剂的制备方法，包括以下步骤：1)磷酸铝溶液的制备将碱性磷酸氢二钠溶液以及氯化铝溶液以相同的恒定流速同时滴加到反应容器中，反应制得磷酸铝溶液，在反应过程中维持磷酸铝溶液的pH恒定在5.5，pH允许偏差±0.02；所述氯化铝溶液的浓度为0.156mol/L；所述碱性磷酸氢二钠溶液为由磷酸氢二钠溶液溶液和氢氧化钠溶液配制的具有一定酸碱缓冲能力的混合溶液，其中磷酸根离子的浓度为0.390mol/L；所述碱性磷酸氢二钠溶液的pH为12.5；所述流速为40mL/min；2)磷酸铝溶液的置换处理将步骤1)制得的磷酸铝溶液与磷酸盐缓冲溶液按体积比1:3混匀，将所得混合液自然沉降后除去上清，重复3次，收集磷酸铝沉淀；所述磷酸盐缓冲溶液成分：0.137mol/LNaCl，2.7mmol/LKCl，10mmol/LNa2HPO4，2mmol/LNaH2PO4。3)磷酸铝溶液的重悬处理将步骤2)所得磷酸铝沉淀样品121℃高压灭菌30min，冷却至常温，用磁力搅拌子重悬，搅拌速度400rpm，搅拌时间16h，即得磷酸铝佐剂溶液，浓度为2.061mg/mL。本实施例可以获得的磷酸铝粒径为10.254nm，表面电荷12mV，等电点为5.513。实施例4一种磷酸铝佐剂的制备方法，与实施例1的区别仅在于步骤1)是将碱性磷酸氢二钠溶液以恒定的流速滴加到一定体积的氯化铝溶液中，反应制得磷酸铝溶液，直到pH达到5.0，pH允许偏差±0.02；所述流速为30mL/min。实施例5一种磷酸铝佐剂的制备方法，与实施例1的区别仅在于步骤2)所用置换溶液为磷酸盐缓冲溶液。其中，所述磷酸盐缓冲溶液中含有：0.137mol/LNaCl，2.7mmol/LKCl，10mmol/LNa2HPO4，2mmol/LNaH2PO4。将实施例1中磷酸氢二钠分别替换为磷酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾中的一种或几种，或者将实施例1中氯化铝分别替换为硫酸铝钾，硝酸铝中的一种或几种，所制得的磷酸铝佐剂溶液性能与实施例1相近，但以实施例1为最佳。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页1 2 3