本发明涉及生物制品技术领域，进步涉及DNA疫苗研发技术，具体涉及一种Ⅰ群4型禽腺病毒DNA疫苗及其应用。
背景技术：
Ⅰ群禽腺病毒组成了腺病毒科的禽腺病毒属。Ⅰ群禽腺病毒呈世界性分布，各年龄段家禽均易感。可以通过水平和垂直两种途径传播。虽然感染鸡的12个血清型之间及血清型内部的毒力各有不同，但12个血清型均能诱发包涵体肝炎(IBH)。FAdV-4引起的心包积水肝炎综合征(HHS)的主要临床症状为产蛋下降和引起死亡(死亡率在20％～80％)，主要病理变化是心包腔中有淡黄色清亮的积液，肝脏肿大、苍白，肾脏肿大，心脏和肝脏出现多发性局灶性坏死，肝细胞中见核内包涵体。FAV-4具有明显的致病年龄段，对雏鸡的致病力最强，可通过接触水平传播及垂直传播。1987年在巴基斯坦临近卡拉奇的安哥拉首先报道本病，1989年在墨西哥，其后在伊拉克、印度的几个邦、厄瓜多尔、秘鲁、智利、中南美洲、俄罗斯和孟加拉国等国相继发现该病。如今，世界各地都有HHS的踪影，遍及拉丁美洲、中东和亚洲的一些国家。
通过对Ⅰ群禽腺病毒的流行病学调查，该病在我国鸡群中发病率较高，且呈逐年上升趋势。发病的宿主范围越来越广，白羽肉鸡、肉种鸡、蛋鸡、黄羽鸡均可感染发病。特别是2010年以后发病呈现增加趋势，在全国范围内均有流行。临床表现包涵体肝炎(IBH)、心包积水肝炎综合征(HHS)。随着我国养鸡业的迅速发展，Ⅰ群禽腺病毒的发病率给饲养业造成了严重的经济损失。关于该病的防治，国外已有预防Ⅰ群禽腺病毒的商品化疫苗，至今国内尚无疫苗可用，导致Ⅰ群禽腺病毒防控存在漏洞。
目前，FAV-4接种鸡胚或原代鸡肾脏细胞肝细胞来接种制备疫苗。鸡胚繁殖病毒毒价低，病毒需要高倍浓缩，成本高昂；而原代肝肾细胞制备繁琐、易污染、不易转染，且在制备细胞过程中易混入鸡胚成纤维细胞(CEF)，不利于实验操作。所以急需新型的疫苗。DNA疫苗的出现，开拓了FAV疫苗研究的新方法。DNA疫苗能同时诱导体液免疫和细胞免疫，对不同血清亚型毒株具有交叉保护，还具有嵌合免疫、多重免疫及联合免疫等优点。
Ⅰ群禽腺病毒具有典型的腺病毒粒子形态，毒粒直径为70-90nm，无囊膜，呈球形，二十面体对称结构。病毒粒子具有252个壳粒，240个非顶角壳粒为六邻体，12个顶角壳粒为五邻体，每个五邻体有2条纤维突起。
技术实现要素：
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种Ⅰ群4型禽腺病毒DNA疫苗及其应用，以解决现有技术的Ⅰ群4型禽腺病毒疫苗对Ⅰ群4型禽腺病毒免疫效果不佳的技术问题。
本发明要解决的另一技术问题是现有技术的Ⅰ群4型禽腺病毒疫苗中抗原物质的免疫原性较低。
本发明要解决的再一技术问题是现有技术中Ⅰ群4型禽腺病毒疫苗对疾病的防疫范围较为局限。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种Ⅰ群4型禽腺病毒DNA疫苗，该疫苗的抗原含有Ⅰ群4型禽腺病毒纤维蛋白C-末端的表达基因。
作为优选，所述Ⅰ群4型禽腺病毒纤维蛋白C-末端的表达基因是在其天然表达基因基础上以鸡偏嗜密码子替换其中的鸡稀有密码子所得的产物。
作为优选，所述Ⅰ群4型禽腺病毒纤维蛋白C-末端的表达基因是序列如SEQ ID No.2所示的DNA。
作为优选，所述抗原是通过以下方法制备的：
1)分别以SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示的DNA片段为引物，以FAV-4病毒为模板，按照94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min，共进行30循环进行PCR扩增；将PCR产物直接克隆到pMD-18T载体上，即得到重组载体pMD-18T-FAV4C；
2)将FAV-4-C基因的核苷酸序列优化至SEQ ID No.2所示状态，合成该基因到pMD-18T载体上，即得到重组载体pMD-18T-optiFAV4C；
3)将重组载体pMD-18T-optiFAV4C与pCAGGS用EcoR I和Sma I双酶切，酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，分别回收目的片段和pCAGGS，然后16℃连接过夜，将连接产物在宿主细胞中扩增。
作为优选，所述将连接产物在宿主细胞中扩增，具体包括以下操作：将连接产物转化到E.coli DH5α感受态细胞，挑取单菌落接种到2ml含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基，37℃振荡培养12h，提取质粒后用双酶切进行鉴定，即得到作为抗原的质粒pCAGoptiFAV4C。
作为优选，步骤3)完成后继续执行以下步骤4)：使用商品名为Endofree的质粒大提试剂盒对重组质粒pCAGoptiFAV4C进行提取纯化。
同时，本发明提供了一种上述疫苗用于预防鸡心包积水肝炎综合征的应用。
本发明提供了一种Ⅰ群4型禽腺病毒DNA疫苗及其应用，该技术方案基于实验手段研究发现研究表明纤维突起具有良好的免役原型，据此以4型禽腺病毒纤维蛋白C-末端基因作为抗原物质，并在其天然序列的基础上进行了密码子优化，克隆入真核表达载体pCAGGS中，构建了DNA疫苗pCAGoptiFAV4C。本发明研究的禽腺病毒DNA疫苗采用了基因工程发酵的方法制备抗原，成本低，抗原纯净，使用安全。
本发明制备的Ⅰ群4型禽腺病毒DNA疫苗，利用血清学方法和免疫攻毒法评估疫苗的免疫效果，结果显示，本发明中制备的DNA疫苗对禽能够提供有效的免疫保护，具有很好的商品化开发前景。与传统疫苗相比，本发明的DNA疫苗既拥有亚单位疫苗和灭活疫苗的安全性，又具有只有弱毒疫苗或重组疫苗才有的同时诱导体液免疫和细胞免疫应答的特点。
附图说明
图1是本发明具体实施方式中各组受试鸡免疫后鸡体内在不同时间段的抗体水平图。其中空白对照组为每羽受试鸡肌注0.2ml生理盐水；DNA疫苗组为每羽受试鸡肌注0.2ml DNA疫苗，其中质粒含量为30ug。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1
1.1纤维蛋白C-末端基因克隆与序列分析：
设计合成一对引物：
引物1：5’AAACATATGTCGAGCTCGGTACCTTT 3’；
引物2：5’AAACTCGAGTTATGTAAAGGGAATGG 3’。
FAV-4强毒株分离自发病肉鸡。
以FAV-4病毒为模板，按照94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min，共进行30循环进行PCR扩增；将PCR产物直接克隆到pMD-18T载体(TaKaRa公司)上，构建pMD-18T-FAV4C；利用双脱氧链终止法进行序列测定，结果显示，从FAV-4基因组中克隆纤维蛋白C-末端的编码基因如SEQ ID No.1所示。根据鸡偏嗜密码子将基因进行密码子优化，优化后的FAV-4-C基因如SEQ ID No.2所示，合成该基因到pMD-18T载体上，构建pMD-18T-optiFAV4C。
1.2DNA疫苗重组工程菌的构建：
将pMD-18T-optiFAV4C与pCAGGS用EcoR I和Sma I双酶切，酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，分别回收目的片段和pCAGGS，然后16℃连接过夜；将连接产物转化到E.coliDH5α感受态细胞，挑取单菌落接种到2ml含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基，37℃振荡培养12h，提取质粒后用双酶切进行鉴定，获得质粒pCAGoptiFAV4C。对重组表达质粒进行双酶切鉴定，并进行测序，确定基因序列及读码框的准确性。
1.3 Ⅰ群4型禽腺病毒DNA疫苗的制备：
使用Endofree质粒大提试剂盒对重组表达质粒DNA疫苗pCAGoptiFAV4C进行提取纯化，按使用说明进行。
1.4疫苗安全检测
用14日龄SPF鸡10只，每只腿部肌肉分点注射疫苗1.0ml(颈后部两侧皮下各注射0.5ml)，观察14日，观察是否由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。结果显示，疫苗免疫的所有试验鸡精神、采食及饮水均未见异常，注射部位均无红肿反应。
1.5疫苗免疫效果检测
血清学方法将14日龄SPF鸡随机分为2组，第1组10只，注射pCAGoptiFAV4C，30μg/只，腿部肌肉两点注射，首次免疫后21日采用相同剂量和途径加强免疫。第2组10只作对照。接种后7日至2个月，每只鸡分别采血，分离血清，用琼扩试验检测免疫鸡和对照鸡的Ⅰ群4型禽腺病毒抗体，记录血清的抗体水平。疫苗免疫组一免后21日及以后琼扩抗体均≥8/10阳性，对照组鸡全部为阴性，取测得的各组血清抗体平均效价绘制图1。
免疫攻毒法将14日龄SPF鸡随机分为3组，第1组10只，注射pCAGoptiFAV4C，30μg/只，腿部肌肉两点注射，首次免疫后21日采用相同剂量和途径加强免疫。第2组10只作对照。二免后14日，所有免疫鸡和对照鸡，肌肉注射Ⅰ群4型禽腺病毒病毒液(约含105.5TCID50/0.1ml)，每只0.2ml。观察并详细记录免疫鸡和对照鸡的发病情况。攻毒保护结果，疫苗免疫鸡攻毒后观察14日，保护数均不少于9只；对照鸡攻毒7日内全部发病，死亡8只，死亡鸡(死亡后剖检)及发病鸡(攻毒后7日剖检)剖检病理变化：均出现典型的心包积水、肝脏肿大病变。
实施例2
一种Ⅰ群4型禽腺病毒DNA疫苗，该疫苗的抗原含有Ⅰ群4型禽腺病毒纤维蛋白C-末端的表达基因。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
所述Ⅰ群4型禽腺病毒纤维蛋白C-末端的表达基因是在其天然表达基因基础上以鸡偏嗜密码子替换其中的鸡稀有密码子所得的产物。
实施例3
一种Ⅰ群4型禽腺病毒DNA疫苗，该疫苗的抗原含有Ⅰ群4型禽腺病毒纤维蛋白C-末端的表达基因。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
所述Ⅰ群4型禽腺病毒纤维蛋白C-末端的表达基因是序列如SEQ ID No.2所示的DNA。
所述抗原是通过以下方法制备的：
1)分别以SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示的DNA片段为引物，以FAV-4病毒为模板，按照94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min，共进行30循环进行PCR扩增；将PCR产物直接克隆到pMD-18T载体上，即得到重组载体pMD-18T-FAV4C；
2)将FAV-4-C基因的核苷酸序列优化至SEQ ID No.2所示状态，合成该基因到pMD-18T载体上，即得到重组载体pMD-18T-optiFAV4C；
3)将重组载体pMD-18T-optiFAV4C与pCAGGS用EcoR I和Sma I双酶切，酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，分别回收目的片段和pCAGGS，然后16℃连接过夜，将连接产物在宿主细胞中扩增。
所述将连接产物在宿主细胞中扩增，具体包括以下操作：将连接产物转化到E.coli DH5α感受态细胞，挑取单菌落接种到2ml含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基，37℃振荡培养12h，提取质粒后用双酶切进行鉴定，即得到作为抗原的重组质粒pCAGoptiFAV4C。
步骤3)完成后继续执行以下步骤4)：使用商品名为Endofree的质粒大提试剂盒对重组质粒pCAGoptiFAV4C进行提取纯化。
实施例4
一种Ⅰ群4型禽腺病毒DNA疫苗，该疫苗的抗原含有Ⅰ群4型禽腺病毒纤维蛋白C-末端的表达基因。
所述抗原是通过以下方法制备的：
1)分别以SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示的DNA片段为引物，以FAV-4病毒为模板，按照94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min，共进行30循环进行PCR扩增；将PCR产物直接克隆到pMD-18T载体上，即得到重组载体pMD-18T-FAV4C；
2)将FAV-4-C基因的核苷酸序列优化至SEQ ID No.2所示状态，合成该基因到pMD-18T载体上，即得到重组载体pMD-18T-optiFAV4C；
3)将重组载体pMD-18T-optiFAV4C与pCAGGS用EcoR I和Sma I双酶切，酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，分别回收目的片段和pCAGGS，然后16℃连接过夜，将连接产物在宿主细胞中扩增。
实施例5
一种Ⅰ群4型禽腺病毒DNA疫苗，该疫苗的抗原含有Ⅰ群4型禽腺病毒纤维蛋白C-末端的表达基因。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津瑞普生物技术股份有限公司
<120> 种Ⅰ群4型禽腺病毒DNA疫苗及其应用
<160> 4
<210> 1
<211> 717
<212> DNA
<213> 天然序列
<400> 1
ATGTCGAGCT CGGTACCTTT GACTTTGGCT TATGATTCCA 40
CGGATTTTCA GGTGACAGAA AACGGCCTAG CCCTAAAGGT 80
ATCTCCGACG CAGACCCCTC TCACCAGAAT AATTTCTATG 120
GGAAATAACT TGTTTGATTC TGGTTATGAG ATTTTTGCTT 160
CATGTCCGCA GAACAAAGCA GCAAAGGTTG CAGGGTATGT 200
GTATTTAACA TCGGTTGGTG GGCTTGTACA TGGGACCATT 240
CAGATTAAAG CTACTGCGGG GTATTGGTTT ACGGGGGAAA 280
ACAGCGTGCA GGAAAGTATC AGGTTTGGAT TGGTGTTGTG 320
TCCTTTTAGT GCTCGCGACC CCACTGCTAA CCTGTCAGGC 360
TGGCCAGCGC CAGTAGTGTG GAGTGGTGAT AGCAATACTC 400
CCCTATATTT TGCGGCCAAT GCCATTAGTT ATACCAATAA 440
CCGTGTAAAT CATGCAGTTA CCGGTAACTT TTACAAGGAG 480
GAAACCGAAT TGCCGGGTTA CACTCGTCAT TCTTTCTGCC 520
CTACCGGGAC CACCGGAATG AATTTTACAG GGGGTAATTT 560
GTATGTGTGT CCCTGCACTG TAAATACAGG GGCCACCACA 600
CTAAATGCCA TTTATATGGT GTTTGTGATT ACTCAATCAG 640
CTTTGGGAAC TAATTTCTTT GCTTCTAACA CCCCTCCCAA 680
CACATTCTTT TTAACTCCCC CCATTCCCTT TACATAA 717
<210> 2
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ATGAGCAGCA GCGTGCCCCU GACCCUGGCC TACGACAGCA 40
CCGACTTCCA GGTGACCGAG AACGGCCUGG CCCUGAAGGT 80
GAGCCCCACC CAGACCCCCC UGACCCGCAT CATCAGCATG 120
GGCAACAACC UGTTCGACAG CGGCTACGAG ATCTTCGCCA 160
GCTGCCCCCA GAACAAGGCC GCCAAGGTGG CCGGCTACGT 200
GTACCUGACC AGCGTGGGCG GCCUGGTGCA CGGCACCATC 240
CAGATCAAGG CCACCGCCGG CTACUGGTTC ACCGGCGAGA 280
ACAGCGTGCA GGAGAGCATC CGCTTCGGCC UGGTGCUGTG 320
CCCCTTCAGC GCCCGCGACC CCACCGCCAA CCUGAGCGGC 360
UGGCCCGCCC CCGTGGTGUG GAGCGGCGAC AGCAACACCC 400
CCCUGTACTT CGCCGCCAAC GCCATCAGCT ACACCAACAA 440
CCGCGTGAAC CACGCCGTGA CCGGCAACTT CTACAAGGAG 480
GAGACCGAGC UGCCCGGCTA CACCCGCCAC AGCTTCTGCC 520
CCACCGGCAC CACCGGCATG AACTTCACCG GCGGCAACCU 560
GTACGTGTGC CCCTGCACCG TGAACACCGG CGCCACCACC 600
CUGAACGCCA TCTACATGGT GTTCGTGATC ACCCAGAGCG 640
CCCUGGGCAC CAACTTCTTC GCCAGCAACA CCCCCCCCAA 680
CACCTTCTTC CUGACCCCCC CCATCCCCTT CACCTAA
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
AAACATATGT CGAGCTCGGT ACCTTT 26
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
AAACTCGAGT TATGTAAAGG GAATGG 26