本发明涉及疫苗技术领域，具体涉及一种禽流感灭活疫苗制备方法。
背景技术：
人感染禽流感，是由禽流感病毒引起的人类疾病。禽流感病毒，属于甲型流感病毒，根据禽流感病毒对鸡和火鸡的致病性的不同，分为高、中、低/非致病性三级。由于禽流感病毒的血凝素结构等特点，一般感染禽类，当病毒在复制过程中发生基因重配，致使结构发生改变，获得感染人的能力，才可能造成人感染禽流感疾病的发生。
肉鸡生长周期短，快速的体重增加使肉鸡的免疫系统处于高负荷状态，这要求肉鸡用疫苗有更高的质量保证，适时适度的接种疫苗是有效避免疫情的措施。现有技术中，灭活疫苗多为油包水型，其制备工艺比较复杂，并且注射部位吸收较慢、抗原释放较慢，影响机体抵抗病毒的能力、后期影响禽类肉制品的品质；虽然能产生一定水平的抗体，但是抗体产生的时间较晚，不适于生长周期较短的肉鸡。
技术实现要素：
为克服现有技术的技术缺陷，本发明提供一种禽流感灭活疫苗。
为了实现以上技术的技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种禽流感灭活疫苗制备方法，包括以下步骤：
1)病毒的接种，将禽流感La Sota种毒用灭菌生理盐水作5000倍稀释，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，37℃孵育；
2)病毒的收获，选取接种后48～120小时之间死亡且病痕明显的鸡胚，收获尿囊腔液，保存于-20℃；按照《中华人民共和国兽药典》规定的半数感染量测定方法，进行病毒含量测定，病毒效价应≥108.5EID50/0.1ml；
3)病毒的灭活，向病毒液中加入质量浓度为37％，终浓度为0.07％～0.15％的福尔马林溶液，混匀，37℃摇床中180～200rpm/min灭活16～24小时；
4)乳化即得到禽流感灭活疫苗。
作为优选，步骤4)所述的乳化包括以下操作：
水相制备：将灭活后的禽流感病毒液通过GQ管式离心机离心，弃去沉淀， 将滤过液用截留分子量为300KD的Millipore膜包进行2～3倍浓缩，浓缩后的病毒液即为水相，使用前置于30～32℃水浴锅中进行预热。
油相制备：取进口MONTANIDETMISA 206VG佐剂，使用前进行充分混匀，并置于30～32℃水浴中进行预热，即为油相。
将水相和油相按质量比为1:1的比例混合，磁力搅拌装置进行预混合，然后采用ATS Engineering Inc公司AH100D型均质机进行水包油包水型疫苗的乳化，二级阀压力20～30bar，一级阀压力调节至400～500bar，共乳化1～2遍，制备成水包油包水型禽流感灭活疫苗，病毒含量≥108.5EID50/0.1ml。
本发明的有益效果在于：本发明制备的疫苗为水包油包水型，粘度低，粒度小，易吸收，同时接种后产生抗体速度较快；本发明选用的佐剂在疫苗制备过程中无需要额外添加任何表面活性剂成分，制备的疫苗安全性好，避免了传统油佐剂难以吸收造成的副作用。
具体实施方式
实施例1
一种禽流感灭活疫苗制备方法，包括以下步骤：
1)病毒的接种，将禽流感La Sota种毒用灭菌生理盐水作5000倍稀释，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，37℃孵育；
2)病毒的收获，选取接种后48小时之间死亡且病痕明显的鸡胚，收获尿囊腔液，保存于-20℃；按照《中华人民共和国兽药典》规定的半数感染量测定方法，进行病毒含量测定，病毒效价应≥108.5EID50/0.1ml；
3)病毒的灭活，向病毒液中加入质量浓度为37％，终浓度为0.07％的福尔马林溶液，混匀，37℃摇床中180rpm/min灭活16小时；
4)乳化即得到禽流感灭活疫苗。
其中步骤4)所述的乳化包括以下操作：
水相制备：将灭活后的禽流感病毒液通过GQ管式离心机离心，弃去沉淀，将滤过液用截留分子量为300KD的Millipore膜包进行2～3倍浓缩，浓缩后的病毒液即为水相，使用前置于30～32℃水浴锅中进行预热。
油相制备：取进口MONTANIDETMISA 206VG佐剂，使用前进行充分混匀，并置于30～32℃水浴中进行预热，即为油相。
将水相和油相按质量比为1:1的比例混合，磁力搅拌装置进行预混合，然后采用ATS Engineering Inc公司AH100D型均质机进行水包油包水型疫苗的乳化，二级阀压力20～30bar，一级阀压力调节至400～500bar，共乳化1～2遍，制备成水包油包水型禽流感灭活疫苗，病毒含量≥108.5EID50/0.1ml。
实施例2
一种禽流感灭活疫苗制备方法，包括以下步骤：
1)病毒的接种，将禽流感La Sota种毒用灭菌生理盐水作5000倍稀释，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，37℃孵育；
2)病毒的收获，选取接种后120小时之间死亡且病痕明显的鸡胚，收获尿囊腔液，保存于-20℃；按照《中华人民共和国兽药典》规定的半数感染量测定方法，进行病毒含量测定，病毒效价应≥108.5EID50/0.1ml；
3)病毒的灭活，向病毒液中加入质量浓度为37％，终浓度为0.15％的福尔马林溶液，混匀，37℃摇床中200rpm/min灭活24小时；
4)乳化即得到禽流感灭活疫苗。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。