本发明属于兽用生物制品
技术领域：
，具体涉及一种副猪嗜血杆菌四价灭活疫苗。
背景技术：
：猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis,HPS)是猪Glasser's病的病原体，引起猪的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎等。国外对HPS流行病学调查表明，临床病猪的分离率高达20％左右。随着我国集约化猪场的发展，副猪嗜血杆菌病的发生呈上升趋势，给养猪业造成了巨大的经济损失，是近年来严重危害养猪业发展的细菌性传染病之一。副猪嗜血杆菌至少有15个血清型，不同国家或地区流行的优势血清型不同，不同血清型的致病性和免疫学特性差异显著。目前，已经证实副猪嗜血杆菌在我国绝大多数猪场存在和流行。美国、日本、加拿大、德国、澳大利亚、丹麦、西班牙等养猪业较发达的国家均已对本国的副猪嗜血杆菌流行病学进行了调查，表明副猪嗜血杆菌的分离率高达20％左右，而且流行的血清型通常都毒力较强，如血清型4型、5型和13型。日本、美国和西班牙的血清型以4型和5型最为流行；而丹麦和澳大利亚的分离菌株主要为血清5型和13型为主；德国主要是血清2型和4型。各国的流行调查结果显示，各国流行血清型各有差别，具有差异性。近年来，我国学者对不同地区的副猪嗜血杆菌进行了流行病学调查，综合报道的研究结果显示血清4型、5型、12型和13型是目前我国最为流行的血清型。我们对全国不同地区的副猪嗜血杆菌进行流行病学调查研究，结果表明当前给我国养猪业发展带来危害的副猪嗜血杆菌的优势血清型为4型、5型、12型和13型。技术实现要素：本发明的目的是提供一种副猪嗜血杆菌四价灭活疫苗，从而用于预防由4、5、12、13型副猪嗜血杆菌引起的猪副嗜血杆菌病。本发明副猪嗜血杆菌四价灭活疫苗，其中抗原为灭活的副猪嗜血杆菌YBH04、YBH05、YBH12株和YBH13株；其中4型YBH04株的保藏编号为CGMCCNo.5479、5型YBH05株的保藏编号为CGMCCNo.5480；13型YBH13株的保藏编号为CGMCCNo.5501；副猪嗜血杆菌YBH12(HaemophilusparasuisYBH12)株，于2016年11月10日保藏在中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2016636。上述的副猪嗜血杆菌YBH04、YBH05、YBH12株和YBH13株是使用甲醛溶液进行了灭活；上述灭活疫苗中YBH04、YBH05、YBH12株和YBH13菌株的数量优选为2.5-3.0×109CFU/ml。本发明从优势流行菌株中筛选出免疫原性良好的副猪嗜血杆菌4型YBH04株、5型YBH05株、12型YBH12株和13型YBH13株作为疫苗制备菌株，分别接种于TSB营养肉汤培养基上培养，收获培养物，经甲醛溶液灭活，加入201佐剂混合乳化制成；用于预防由4、5、12、13型副猪嗜血杆菌引起的猪副嗜血杆菌病；此疫苗具有安全性好、免疫效力高且免疫期长等优点。具体实施方式本发明所使用的抗原菌株的信息如下：一、副猪嗜血杆菌血清12型YBH12株的筛选1.流行病学调查自2008年以来，我们对副猪嗜血杆菌的流行病学进行调查，并对部分猪场进行跟踪调查。调查结果发现，血清4、5、12、13型是目前流行血清型。而4、5、13型均已筛选出适宜的制苗菌株，而且三价灭活疫苗已有研制；但副猪嗜血杆菌血清12型的菌株还未进行筛选。2.细菌分离采集疑似病猪的肺脏、胸腹腔积液、心包积液、心血、关节液和脑组织等病料，接种TSA培养基，于5％CO2条件下，37℃培养24～48h，挑取单个菌落，进行培养并鉴定。3.细菌鉴定3.1形态观察取疑似菌落，涂片后革兰氏染色镜检，观察其细菌形态。3.2生化特性鉴定取疑似菌落按常规进行溶血性试验、尿素酶试验、氧化酶试验、V-P试验、接触酶试验、硝酸盐还原试验、吲哚试验、卫星生长试验；糖发酵试验，包括葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、核糖和麦芽糖。同时用HPS12型国际参考菌株作对照菌株，于37℃培养24～48h，观察结果。3.3PCR鉴定根据副猪嗜血杆菌16SrRNA序列设计引物，引物为(F：5’-GGCTTCGTCACCCTCTGT–3’，R：5’-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT–3’)。对分离到的疑似HPS分离菌株进行PCR鉴定，PCR扩增的产物应为822bp大小的片段。3.4血清学特性鉴定采用琼脂扩散试验对副猪嗜血杆菌分离菌株进行血清型鉴定。4.毒力试验将分离的10株血清12型副猪嗜血杆菌分别腹腔注射8～10周龄健康易感仔猪各5头，3.0ml/头(活菌量均约为5.0×109CFU)，另取5头不攻毒作为对照。连续观察14日，记录试验猪的发病及死亡情况。5.免疫原性根据毒力试验结果，将筛选的毒力较强的YBH12株分离菌株菌液分别调整至2.0×109CFU/ml，甲醛灭活后与201佐剂按质量比1:1混合乳化，制备单价灭活疫苗，肌肉注射3～5周龄仔猪，2.0ml/头，每组5头。一次免疫后21日按相同剂量相同方法进行二次免疫，二次免疫后14日所有仔猪采血并分离血清，使用微量凝集方法测定血清的抗体效价；并分别用本菌株进行腹腔注射攻毒(活菌量均约为6.0×109CFU)。观察试验猪的发病及死亡情况，比较不同菌株对猪的免疫原性。试验结果表明，微量凝集抗体为5/5大于等于1:32；免疫组为5/5保护，对照组为5/5发病。6.交叉攻毒保护根据毒力试验结果，将筛选的毒力较强的YBH12株分离菌株菌液调整至2.0×109CFU/ml，甲醛灭活后与201佐剂按质量比1:1混合乳化，制备单价灭活疫苗，腿部肌肉注射仔猪，2.0ml/头。一次免疫后21日按相同剂量相同方法进行二次免疫，二次免疫后14日所有仔猪分别用分离的10株同型菌株进行攻毒(6.0×109CFU)。观察14日，记录试验仔猪的发病及死亡情况。试验结果表明，YBH12株疫苗制备的单价灭活疫苗，能抵御YBH12株及其他9株分离株的攻击，攻毒保护率均为5/5，具有较好的交叉攻毒保护力。本发明的副猪嗜血杆菌四价灭活疫苗中使用的其它三个副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis)菌株为YBH04、YBH05、和YBH13株；其中4型YBH04株(2009年从山东省某猪场病死猪的关节液中分离)和5型YBH05株(2008年从山东省平度某猪场病死猪的关节液中分离)，13型YBH13株(2009年从山东省济南某猪场病死猪的心脏中分离)。4型YBH04株、5型YBH05株和13型YBH13株已于2011年11月23日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号分别为：CGMCCNo.5479、CGMCCNo.5480和CGMCCNo.5501；12型YBH12株已于2016年11月10日保藏在中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2016636。2毒株特点2.1形态及生化特性副猪嗜血杆菌菌株YBH04、YBH05、YBH12株和YBH13株菌均为革兰氏阴性细小杆菌，具有多种不同的形态(从单个的球杆菌到长的、细长的、以至丝状的菌体)。接触酶试验、硝酸盐还原试验均为阳性，溶血性试验、尿素酶试验、氧化酶试验、V-P试验、吲哚试验均为阴性，能呈现“卫星生长”现象，能发酵葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、核糖和麦芽糖。2.2培养特性副猪嗜血杆菌YBH04、YBH05、YBH12株和YBH13株在含0.01％辅酶(NAD)和5％新生牛血清的胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基中呈均匀一致的混浊生长；在含0.01％NAD和5％新生牛血清的胰蛋白胨大豆琼脂固体培养基上，37℃培养24～48小时，形成直径0.3～2.0mm、圆形、光滑、湿润、无色透明的露珠样菌落。2.3血清型应用琼脂扩散试验进行血清型鉴定，副猪嗜血杆菌YBH04、YBH05、YBH12株和YBH13株菌分别为HPS4、5、12、13型。2.4菌株毒力腹腔注射8～10周龄健康易感仔猪，能使至少4头及以上仔猪发病的各菌株的攻毒量分别是YBH04株约为5.0×109CFU/头，YBH05株约为5.0×109CFU/头、YBH12株约为6.0×109CFU/头、YBH13株约为6.0×109CFU/头。2.5免疫原性取3～5周龄健康易感仔猪30头，随机分为A、B、C、D、E、F、G、H八组，每组5头，A、B、C、D组为免疫组，E、F、G、H组为非免疫对照组。A、B、C、D组分别颈部肌肉注射YBH04株、YBH05株、YBH12株、YBH13株单价201佐剂灭活疫苗，2.0ml/头(抗原含量为0.5×109CFU/ml)。免疫后21日按相同方法和剂量进行二免，二免后14日攻毒。A、E组试验猪腹腔注射YBH04株菌液3.0ml(活菌量约为5.0×109CFU/头)；B、F组试验猪腹腔注射YBH05株菌液3.0ml(活菌量约为5.0×109CFU/头)；C、G组试验猪腹腔注射YBH12株菌液3.0ml(活菌量约为6.0×109CFU/头)；D、H组试验猪腹腔注射YBH13株菌液3.0ml(活菌量约为6.0×109CFU/头)。观察14日，免疫组猪均应至少4头保护，对照组猪均应至少4头发病。副猪嗜血杆菌四价灭活疫苗的生产方法，主要是：1采用发酵罐分别对四株菌种进行培养：按发酵罐容积的60％～80％加入TSB培养基，同时加入消泡剂，通入高压蒸汽进行灭菌，待其温度降至37～38℃时，分别加入5％新生牛血清、0.01％NAD和3％～5％二级种子液进行发酵培养。培养温度36～37℃、搅拌转速100r/min、pH值7.2～7.4，整个培养过程通过调节进气量来控制溶氧量为60％～80％，菌液培养12～14小时后，取样进行活菌计数和纯粹检验。分别将发酵完成的菌液，导入柱式离心机离心，收获菌泥，置于2～8℃保存，不超过48小时。根据活菌计数结果，将菌泥分别重悬于适量灭菌的生理盐水中，均稀释至1.6×1010CFU/ml，分别计量加入10％甲醛溶液，使其终浓度为0.2％，37℃搅拌灭活16小时，进行灭活检验，其余菌液置2～8℃保存，不超过14日。将灭活的副猪嗜血杆菌4、5、12、13型抗原液等量混合，作为水相。2疫苗制备水相和油相预热至31℃，按质量比1:1混合，4000r/min搅拌30～40分钟，制备灭活疫苗。下面结合实施例对本发明进行详细的描述。实施例1：一、疫苗制备1生产用种子制备1.1生产菌种的复苏及一级种子繁殖分别将YBH04株、YBH05株、YBH12株、YBH13株冻干菌种溶解，划线接种于TSA培养基，置5％CO2、37℃培养24～48小时，分别选取单个典型菌落密集划线接种于TSA培养基，37℃培养16～24小时；分别挑取菌苔接种于TSB培养基，37℃150r/min振荡培养12～16小时，经纯粹检验合格后，作为一级种子。-15℃以下保存，应不超过30日。1.2二级种子繁殖将一级种子按3％～5％比例接种TSB培养基中，37℃150r/min振荡培养12～16小时，镜检纯粹后，作为二级种子。2～8℃保存，应不超过24小时。2制苗用培养基为TSB培养基。3制苗用菌液的制备3.1菌液培养采用发酵罐分别对四株菌种进行培养：按发酵罐容积的60％～80％加入TSB培养基，同时加入消泡剂，通入高压蒸汽进行灭菌，待其温度降至37～38℃时，分别加入5％新生牛血清、0.01％NAD和3％～5％二级种子液进行发酵培养。培养温度36～37℃、搅拌转速100r/min、pH值7.2～7.4，整个培养过程通过调节进气量来控制溶氧量为60％～80％，菌液培养12～14小时后，取样进行活菌计数和纯粹检验。分别将发酵完成的菌液，导入柱式离心机离心，收获菌泥，置于2～8℃保存，不超过48小时。3.2灭活根据活菌计数结果，将菌泥分别重悬于适量灭菌的生理盐水中，均稀释至1.6×1010CFU/ml，分别计量加入10％甲醛溶液，使其终浓度为0.2％，37℃搅拌灭活16小时，进行灭活检验，其余菌液置2～8℃保存，不超过14日。4半成品检验4.1纯粹检验按现行《中国兽药典》附录进行检验。4.2活菌计数按现行《中国兽药典》附录进行计数。4.3灭活检验按现行《中国兽药典》附录进行检验。5疫苗制备5.1水相配制将检验合格的YBH04株、YBH05株、YBH12株、YBH13株菌液等量混合。5.2油相MONTANIDETMISA201VG佐剂(以下简称201佐剂)。5.3乳化水相和油相预热至31℃，按质量比1:1混合，4000r/min搅拌30～40分钟。6分装定量分装，加盖密封，并粘贴标签，置2～8℃保存。二、疫苗的安全试验1对最小使用日龄的单剂量和单剂量重复试验用21日龄健康易感仔猪15头，分成3组，每组5头。A、B组每头颈部肌肉注射201501批疫苗2.0ml，B组在一次免疫后14日再免疫一次。C组为不免疫对照组。观察14日，观察仔猪的注射部位有无红肿、硬结等不良反应。试验结果表明，仔猪单剂量免疫和单剂量重复免疫的精神、饮食正常，注射部位无红肿、硬结等不良反应。2对仔猪、怀孕母猪和种公猪的超剂量注射的安全性试验用实验室试制的3批疫苗(201501、201502、201503批)分别取21日龄仔猪、产前6-7周龄怀孕母猪、1-3年种公猪各5头，每头颈部肌肉注射4.0ml/头，观察14日，观察仔猪的注射部位有无红肿、硬结等不良反应。试验结果表明，超剂量免疫仔猪、怀孕母猪和种公猪的精神、饮食正常，注射部位无红肿、硬结等不良反应。三、疫苗微量凝集抗体效价和攻毒保护相关试验用本课题组实验室试制的猪副猪嗜血杆菌病四价灭活疫苗(以下简称“灭活苗”)，分别按0.5ml/头、1ml/头、2ml/头不同剂量免疫3周龄健康易感仔猪，进行最小免疫剂量试验及抗体与攻毒保护相关性试验。最小免疫剂量结果显示，1ml/头以上的剂量组的免疫仔猪血清中HPS4、5、12、13型抗体效价均在1:32及以上，攻毒能达到4/5及以上保护，因此该疫苗的最小免疫量为1ml/头，考虑到临床应用时影响因素较多，为保证疫苗的免疫效果，将灭活疫苗的免疫剂量确定为2.0ml/头。抗体与攻毒保护相关性试验结果表明，当HPS4、5、12、13型的抗体效价≤1:8时，攻毒保护率为≤2/5；抗体效价为1:16时，攻毒保护率为≤3/5；抗体效价≥1:32时，攻毒保护率为4/5～5/5。因此抗体与攻毒保护之间呈正相关。试验结果详见表1-2。表1免疫猪的抗体效价表2免疫仔猪的攻毒保护试验结果四、抗体消长规律、免疫持续期及仔猪母源抗体持续期试验用本课题组制备的3批猪副猪嗜血杆菌病四价灭活疫苗(4型YBH04株+5型YBH05株+12型YBH12株+13型YBH13株)(批号分别为201501、201502、201503)，颈部肌肉注射3～5周龄健康易感仔猪、1～3年种公猪和产前6～7周怀孕母猪。仔猪首免后3周进行二免，2.0ml/头。仔猪于一免后21日、二免后7日、14日、1、2、4、6、7个月随机抽取5头采血，测定血清中HPS4、5、12、13型的抗体效价；种公猪于免疫后1、3、6、7个月，分别采血测定其抗体效价，观察抗体水平的消长规律；母猪在产前6～7周进行免疫，并于免疫后2、4、6、7个月采血检测血清抗体，产仔后，分别在仔猪出生后第7、14、21、28日采血测定血清的抗体水平，并于出生后21日和28日进行攻毒保护试验。试验结果表明，仔猪在免疫后7个月抗体仍≥1:32；种公猪免后7个月抗体仍≥1:32；母猪免疫后7个月抗体≥1:32，所产仔猪出生后21日抗体仍≥1:32，21日的攻毒保护率为4/5～5/5，出生后28日的抗体均小于1:32，28日的攻毒保护率为2/5～3/5。根据以上数据，最终确定疫苗对仔猪和种猪的免疫期为6个月，仔猪母源抗体保护至出生后21日。详见表3-表6。表3仔猪免疫后微量凝集抗体消长规律的测定表4产前6-7周怀孕母猪免疫后微量凝集抗体消长规律的测定表5仔猪母源抗体消长规律测定结果试验猪日龄HPS4型HPS5型HPS12型HPS13型1周龄仔猪≥1:32≥1:32≥1:32≥1:322周龄仔猪≥1:32≥1:32≥1:32≥1:323周龄仔猪≥1:32≥1:32≥1:32≥1:324周龄仔猪≤1:8≤1:16≤1:8≤1:16非免疫对照组≤1:4≤1:4≤1:4≤1:4表6被动免疫仔猪攻毒保护试验结果并且，用目前市场上出售的副猪嗜血杆菌疫苗进行免疫，再用本发明使用的YBH04株、YBH05株YBH12株YBH13株进行攻毒实验；结果表明目前市场上出售的疫苗的免疫效果远低于本发明制备的四价疫苗效果。五、疫苗成品检验1性状外观乳白色乳剂。剂型水包油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面，应呈云雾状扩散。稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。黏度按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。2装量检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应符合规定。3无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。4安全检验用3～5周龄健康易感仔猪5头，每头颈部肌肉注射疫苗4.0ml，观察14日，应不出现因疫苗引起的局部或全身不良反应。5效力检验先用血清学方法检验，血清学方法检验不合格时，再用免疫攻毒法进行检验。5.1血清学方法取3～5周龄健康易感仔猪10头，其中5头颈部肌肉注射疫苗2.0ml/头，其余5头作非免疫对照。一次免疫后21日，按相同剂量和相同方法进行二次免疫，二次免疫后14日对所有仔猪采血并分离血清，检测HPS4、5、13型抗体效价。免疫组仔猪的血清中4、5、12、13型抗体效价均应≥1:32，对照组仔猪的血清4、5、12、13型抗体效价均应≤1:4。5.2免疫攻毒法取3～5周龄健康易感仔猪40头，随机分为A、B、C、D、E、F、G、H八组，每组5头，A、B、C、D组为免疫组，E、F、G、H组为非免疫对照组。A、B、C、D组分别颈部肌肉注射YBH04株、YBH05株、YBH12株、YBH13株单价201佐剂灭活疫苗，2.0ml/头(灭活前细菌约含量为2.0×109CFU/ml)。免疫后21日按相同方法和剂量进行二免，二免后14日攻毒。A、E组试验猪腹腔注射YBH04株菌液3.0ml(活菌量约为5.0×109CFU/头)；B、F组试验猪腹腔注射YBH05株菌液3.0ml(活菌量约为5.0×109CFU/头)；C、G组试验猪腹腔注射YBH12株菌液3.0ml(活菌量约为6.0×109CFU/头)；D、H组试验猪腹腔注射YBH13株菌液3.0ml(活菌量约为6.0×109CFU/头)。观察14日，免疫组猪均应至少4头保护，对照组猪均应至少4头发病。6甲醛残留量测定按现行《中国兽药典》附录进行测定，应符合规定。六、疫苗的作用与用途用于预防由4、5、12、13型副猪嗜血杆菌引起的副猪嗜血杆菌病。免疫期为6个月。七、用法与用量颈部肌肉注射。仔猪：3～5周龄首免，3周后加强免疫1次，每次2.0ml/头；母猪：产前6～7周免疫1次，每次2.0ml/头；种公猪：每6个月免疫1次，每次2.0ml/头。实施例21.生产用种子制备(1)一级种子繁殖与鉴定将YBH04、YBH05、YBH12株、YBH13株冻干菌种划线接种于TSA琼脂平板上，在5％～10％CO2条件下，37℃培养24～48h，各挑取典型菌落或菌苔，接种于100mlTSB肉汤，置37℃振荡培养24～48h。各取2ml菌液经纯粹检验合格后，作为一级种子。在-20℃下保存，不超过1个月；-70℃下保存，不超过3个月(详见表7)。表7一级种子的制备(2)二级种子繁殖取YBH04、YBH05、YBH12株、YBH13菌株一级种子，划线接种TSA琼脂平板，在含5％～10％CO2条件下，37℃培养24～48h；各挑选典型菌落或菌苔，接种于800mlTSB肉汤中，置37℃振荡培养24～48h，各取2ml菌液经纯粹检验合格后，即为二级种子。在2～8℃保存，应不超过24h(详见表8)。表8二级种子的制备2.菌液培养采用发酵罐分别培养4、5、12、13型菌液。按发酵罐容积的60％～70％加入生产用的半合成培养基20000ml，同时加入消泡剂(泡敌)进行消毒，待其温度降至37～38℃时，将2～8℃保存的二级种子液(单型)按2％～2.5％各400ml加入到发酵罐内。培养温度控制在37～38℃、搅拌转速100～200r/min、pH7.2～7.4、罐压0.03～0.05Pa、溶氧量40％，培养12～14h，收获菌液24300，按菌液体积的0.3％加入甲醛溶液672ml，37℃搅拌灭活24h，取样进行灭活检验，灭活后的菌液置2～8℃保存。(详见表9)。表9副猪嗜血杆菌YBH04、YBH05、YBH12株和YBH13株菌数测定结果4.疫苗配制4.1水相配制将检验合格的YBH04株、YBH05株、YBH12株和YBH13株菌液等量混合。4.2油相MONTANIDETMISA201VG佐剂(以下简称201佐剂)。4.3乳化水相和油相预热至31℃，按质量比1:1混合，4000r/min搅拌30分钟。4.4分装定量分装，加盖密封，并粘贴标签，置2～8℃保存。详见表10。表10疫苗乳化和分装疫苗成品检验(1)性状外观乳白色乳液。剂型油包水型。取一清洁吸管，吸取2ml疫苗滴于清洁冷水表面呈油滴状不扩散。稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，3000r/min离心15分钟，均无水相析出。黏度测定结果分别为25.8cP、26.2cP、26.4cP。(2)无菌检验按《中国兽药典》方法进行，无菌生长。(3)安全检验取3～5周龄健康易感仔猪5头，颈部肌肉注射疫苗，4.0ml/头，观察14日，所有试验猪精神、采食及饮水均未见明显异常，注射部位和全身均无不良反应。详见表11。表11猪副猪嗜血杆菌病四价灭活疫苗安全性检验结果(4)甲醛残留量测定按《中国兽药典》方法进行，甲醛含量为0.06％～0.07％符合规定。(5)效力检验3～5周龄健康易感仔猪40头，随机分为A、B、C、D、E、F、G、H八组，每组5头，其中A、B、C、D组为免疫组，均颈部肌肉注射疫苗，2.0ml/头；E、F、G、H组为非免疫对照组，均颈部肌肉注射生理盐水，2.0ml/头。免疫后21日按相同剂量和相同方法进行二次免疫，二免后14日对所有仔猪采血并分离血清，检测HPS4、5、12、13型抗体效价；采血后A、E组试验猪腹腔注射YBH04株菌液3.0ml(活菌量约为5.0×109CFU/头)；B、F组试验猪腹腔注射YBH05株菌液3.0ml(活菌量约为5.0×109CFU/头)；C、G组试验猪腹腔注射YBH12株菌液3.0ml(活菌量约为5.0×109CFU/头)；D、H组试验猪腹腔注射YBH13株菌液3.0ml(活菌量约为6.0×109CFU/头)。观察14日记录试验猪的发病及死亡情况。结果表明，3批疫苗用猪进行的血清学检测方法结果表明，3批疫苗二次免疫猪后14日，免疫组猪的4、5、12、13型的微量凝集抗体效价均≥1:32，对照组猪的抗体均≤1:4。攻毒保护结果表明，免疫组猪的攻毒保护率均为4/5～5/5，对照猪的发病率为4/5～5/5。详见表12。表12猪副猪嗜血杆菌病四价灭活疫苗攻毒保护试验结果注:分子注:分子指保护仔猪数，分母指攻毒仔猪总数。上述结果表明本发明制备的疫苗对猪副猪嗜血杆菌具有很好的免疫效果。当前第1页1 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