本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪副猪嗜血杆菌病和猪支气管败血波氏杆菌病二联灭活疫苗。
背景技术：
支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica，Bb)可引起猪发生非进行性萎缩性鼻炎(non-progressive atrophic rhinitis，NPAR)和支气管肺炎，也是猪呼吸道综合征(porcine respiratory disease complex，PRDC)的重要致病因子之一。此类疾病现已广泛分布于养猪业发达的国家。近年来随着中国集约化养猪业的发展及猪的引种、调动频繁，由Bb引起的NPAR、PRDC等疾病也随之扩散蔓延，造成较大经济损失。并且易与副猪嗜血杆菌(Haemophilus suis，HPS)有协同致病作用，这样的协同作用可提高呼吸道疾病的发病率并增加疾病的严重程度，造成严重的经济损失。因此，迫切需要对中国的HPS和Bb的流行情况进行系统研究，并迫切需要研制出一种猪副猪嗜血杆菌病和猪支气管败血波氏杆菌病二联灭活疫苗，来防治这两种疫病对养殖业造成的危害。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种猪副猪嗜血杆菌病和猪支气管败血波氏杆菌病二联灭活疫苗，从而弥补现有疫苗的不足。
本发明还提供一种灭活疫苗，其中抗原为灭活的副猪嗜血杆菌YBH05株和猪支气管败血波氏杆菌YBB01株；
其中副猪嗜血杆菌YBH05株已于2011年11月23日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.5480。
猪支气管败血波氏杆菌YBB01株(Bordetella bronchiseptica YBB01)，于2016年11月1日保藏在中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2016606。
上述的灭活疫苗，抗原的灭活采用甲醛灭活；
本发明的二联灭活疫苗的制备方法如下：
1)油相：MONTANIDETM ISA 201 VG佐剂(以下简称201佐剂)；
2)水相制备：将纯粹检验合格的YBH05株和YBB01株抗原，将菌泥分别重悬于适量灭菌的生理盐水中，均稀释至4.0×109CFU/ml灭活后，检验合格后，作为抗原；
3)乳化：
水相和油相预热至31℃，按质量比1:1混合，4000r/min搅拌30～40分钟；
4)分装：定量分装，加盖密封，并粘贴标签，置2～8℃保存。
本发明的疫苗所使用的副猪嗜血杆菌YBH05株和猪支气管败血波氏杆菌YBB01株的毒力强高、免疫原性好并具有较好的交叉保护性。本发明制备的疫苗的安全性良好，未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。保存期试验中经过性状、安全性试验、效力试验数据的分析，各项指标均稳定有效；效力试验结果证明，YBH05株和YBB01株能产生良好抗体，并能产生较好的攻毒保护力。
具体实施方式
申请人筛选获得了一株猪支气管败血波氏杆菌YBB01株，将其与副猪嗜血杆菌YBH05株联合使用制成了灭活疫苗，从而促成了本发明。
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1：猪支气管波氏杆菌YBB01株的筛选
1.流行病学调查 自2013年以来，发明人对猪支气管败血波氏杆菌的流行病学进行调查，并对部分猪场进行跟踪调查。调查结果发现，猪支气管败血波氏杆菌目前已在我国猪场广泛存在。
2.细菌分离 采集疑似病猪的肺脏、胸腹腔积液、心包积液、心血、关节液和脑组织等病料，接种TSA培养基，于5％CO2条件下，37℃培养24～48h，挑取单个菌落，进行培养并鉴定。
3.细菌鉴定
3.1形态观察 取疑似菌落，涂片后革兰氏染色镜检，观察其细菌形态。
3.2生化特性鉴定 对可疑菌落进行葡萄糖、甘露糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、麦芽糖、鼠李糖、山梨醇、卫矛醇、氧化酶、脲酶、硝酸盐还原、柠檬酸盐、鸟氨酸、赖氨酸、谷氨酸脱羧酶、枸橼酸、明胶、甲基红、VP、吲哚半固体等生化试验，于37℃培养24～48h，观察结果。
3.3 PCR鉴定 将上述初步鉴定的细菌进一步用PCR方法确定。用接种环取少许被检菌落于100μL无菌PBS,混匀,取1μL菌悬液作PCR模板。根据波氏杆菌fla基因(NO.AF232939)序列设计引物,P1:5′-GCTCCCAAGAGAGAAAGGCT-3′,P2:5′-GGTGGCGCCTGCCCTATC-3′,扩增片段大小为235bp,引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
4.毒力试验 将分离的10株猪支气管波氏杆菌分别滴鼻注射8～10周龄健康易感仔猪各5头，3.0ml/头(活菌量均约为4.0×109CFU)，另取5头不攻毒作为对照。连续观察14日，记录试验猪的发病及死亡情况。试验结果表明，YBB01株毒力最强，5头仔猪发病，其中4头死亡。
5.免疫原性 根据毒力试验结果，将筛选的毒力较强的YBB01株菌株菌液分别调整至2.0×109CFU/ml，甲醛灭活后与201佐剂按质量比1:1混合乳化，制备单价灭活疫苗，每种疫苗分别肌肉注射3～5周龄仔猪，2.0ml/头，每组5头。一次免疫后21日按相同剂量相同方法进行二次免疫，二次免疫后14日所有仔猪采血并分离血清，使用间接血凝方法测定血清的抗体效价；并用本菌株进行滴鼻注射攻毒(活菌量均约为4.0×109CFU)。观察试验猪的发病及死亡情况。抗体检测结果表明，免疫组5/5均大于等于1:16,对照组5/5均小于等于1:4；攻毒保护结果表明，免疫组5/5保护,对照组5/5发病。
6.交叉攻毒保护 根据毒力试验结果，将YBB01株分离菌株菌液调整至2.0×109CFU/ml，甲醛灭活后与201佐剂按质量比1:1混合乳化，制备单价灭活疫苗，颈部肌肉注射仔猪，2.0ml/头。一次免疫后21日按相同剂量相同方法进行二次免疫，二次免疫后14日所有仔猪分别用分离的10株同型菌株进行攻毒(4.0×109CFU)。观察14日，记录试验仔猪的发病及死亡情况。试验结果表明，免疫组仔猪均未发病或死亡，均5/5保护；而对照组仔猪，均4/5-5/5发病。表明YBB01株所制备的猪支气管波氏杆菌灭活疫苗能抵御YBB01株及各地方分离株的攻击而起到保护作用。
实施例2：副猪嗜血杆菌YBH05株的信息
2.1形态及生化特性 副猪嗜血杆菌菌株YBH05株菌为革兰氏阴性细小杆菌，具有多种不同的形态(从单个的球杆菌到长的、细长的、以至丝状的菌体)。接触酶试验、硝酸盐还原试验均为阳性，溶血性试验、尿素酶试验、氧化酶试验、V-P试验、吲哚试验均为阴性，能呈现“卫星生长”现象，能发酵葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、核糖和麦芽糖。
2.2培养特性 副猪嗜血杆菌YBH05株在含0.01％辅酶(NAD)和5％新生牛血清的胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基中呈均匀一致的混浊生长；在含0.01％NAD和5％新生牛血清的胰蛋白胨大豆琼脂固体培养基上，37℃培养24～48小时，形成直径0.3～2.0mm、圆形、光滑、湿润、无色透明的露珠样菌落。
2.3血清型 应用琼脂扩散试验进行血清型鉴定，副猪嗜血杆菌YBH05株菌为HPS 5型。
2.4菌株毒力 腹腔注射8～10周龄健康易感仔猪，能使至少4头及以上仔猪发病的各菌株的攻毒量是YBH05株约为5.0×109CFU/头。
2.5免疫原性 将YBH05株菌株菌液分别调整至2.0×109CFU/ml，甲醛灭活后与201佐剂按质量比1:1混合乳化，制备单价灭活疫苗，每种疫苗分别肌肉注射3～5周龄仔猪，2.0ml/头，每组5头。一次免疫后21日按相同剂量相同方法进行二次免疫，二免后21日按相同方法和剂量进行二免，二免后14日攻毒。A、B组试验猪腹腔注射YBH05株菌液3.0ml(活菌量约为5.0×109CFU/头)。观察14日，免疫组猪均应至少4头保护，对照组猪均应至少4头发病。
实施例3：副猪嗜血杆菌YBH05株和猪支气管败血波氏杆菌YBB01株抗原的制备
1.菌液培养
1.1 YBB01株的培养 采用发酵罐对YBB01株进行培养：按发酵罐容积的60％～80％加入TSB培养基，同时加入消泡剂，通入高压蒸汽进行灭菌，待其温度降至37～38℃时，分别加入5％新生牛血清、0.01％NAD和1％～3％二级种子液进行发酵培养。培养温度36～37℃、搅拌转速100r/min、pH值7.2～7.4，整个培养过程通过调节进气量来控制溶氧量为60％～80％，菌液培养8小时后，取样进行活菌计数和纯粹检验。分别将发酵完成的菌液，导入柱式离心机离心，收获菌泥，置于2～8℃保存，不超过24小时。
1.2 YBH05株的培养 采用发酵罐对YBH05株进行培养：按发酵罐容积的60％～80％加入TSB培养基，同时加入消泡剂，通入高压蒸汽进行灭菌，待其温度降至37～38℃时，分别加入5％新生牛血清、0.01％NAD和3％～5％二级种子液进行发酵培养。培养温度36～37℃、搅拌转速100r/min、pH值7.2～7.4，整个培养过程通过调节进气量来控制溶氧量为60％～80％，菌液培养12小时后，取样进行活菌计数和纯粹检验。分别将发酵完成的菌液，导入柱式离心机离心，收获菌泥，置于2～8℃保存，不超过48小时。
2.灭活 根据活菌计数结果，将两株菌株的菌泥重悬于适量灭菌的生理盐水中，均稀释至4.0×109CFU/ml，分别计量加入10％甲醛溶液，使其终浓度为0.2％，37℃搅拌灭活16小时，进行灭活检验，其余菌液置2～8℃保存，不超过14日。
3.半成品检验
3.1纯粹检验 按现行《中国兽药典》附录进行检验。
3.2活菌计数 按现行《中国兽药典》附录进行计数。
3.3灭活检验 按现行《中国兽药典》附录进行检验。
实施例4：疫苗的制备
1水相配制 检验合格的YBH05株和YBB01株抗原按1：1混匀，作为水相。
2油相 MONTANIDETM ISA 201VG佐剂(以下简称201佐剂)。
3乳化 水相和油相预热至31℃，按质量比1:1混合，4000r/min搅拌30～40分钟。
3分装 定量分装，加盖密封，并粘贴标签，置2～8℃保存。
4成品检验
4.1性状
外观 乳白色乳剂。
剂型 水包油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面，应呈云雾状扩散。
稳定性 吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不大于0.5ml。
黏度 按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
4.2装量检查 按现行《中国兽药典》附录进行检验，应符合规定。
4.3无菌检验 按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
4.4安全检验 用3～5周龄健康易感仔猪5头，每头颈部肌肉注射疫苗4.0ml，观察14日，应不出现因疫苗引起的局部或全身不良反应。
4.5效力检验
4.5.1血清学方法 取3～5周龄健康易感仔猪10头，其中5头颈部肌肉注射疫苗2.0ml/头，其余5头作非免疫对照。一次免疫后21日，按相同剂量和相同方法进行二次免疫，二次免疫后14日对所有仔猪采血并分离血清，分别检测副猪嗜血杆菌和猪支气管败血波氏杆菌抗体效价。副猪嗜血杆菌的微量凝集抗体：免疫组5头仔猪的抗体效价均≥1:32，对照组5头仔猪的抗体效价均≤1:4；猪支气管败血波氏杆菌的间接血凝抗体：免疫组5头仔猪的抗体效价均≥1:16，对照组5头仔猪的抗体效价均≤1:4。
4.5.2免疫攻毒法 用3～5周龄健康易感仔猪20头，随机分为A、B、C、D 4组，每组5头，其中A、B组为免疫组，均颈部肌肉注射疫苗，2.0ml/头，C、D组为非免疫对照组，均颈部肌肉注射生理盐水，2.0ml/头。一次免疫后21日按相同方法和相同剂量进行二次免疫，二次免疫后14日进行攻毒。A、C组试验猪腹腔注射YBH05株3.0ml(活菌量约为5.0×109CFU/头)；B、D组试验猪滴鼻注射YBB01株菌液3.0ml(活菌量约为4.0×109CFU/头)。观察14日，副猪嗜血杆菌：免疫组猪均至少4头保护，对照组猪至少4头发病；猪支气管波氏杆菌：免疫组猪均至少4头保护，对照组猪均至少4头发病。
5疫苗对比试验
用市场上出售的猪副猪嗜血杆菌病灭活疫苗和猪萎缩性鼻炎灭活疫苗，及本发明的猪副猪嗜血杆菌病和猪支气管败血波氏杆菌病二联灭活疫苗，分别免疫5头、5头和10头猪，并设置10头猪为未免疫对照猪。根据各自疫苗的免疫程序进行免疫，免疫后采血进行抗体测定。并分别用本发明的两株菌株进行攻毒。试验结果表明，市场上出售的猪副猪嗜血杆菌病灭活疫苗和猪萎缩性鼻炎灭活疫苗，无论是从抗体上还是从攻毒保护率上，均比本发明的猪副猪嗜血杆菌病和猪支气管败血波氏杆菌病二联灭活疫苗的效果较差。试验结果见表1。
表1：三种灭活疫苗的抗体和攻毒保护率结果