本发明涉及免疫
技术领域：
，进一步涉及卵黄抗体免疫效果的协同增效技术，具体涉及一种针对腺病毒的多途径协同免疫方法。
背景技术：
：鸡心包积液和肝炎综合征是由禽腺病毒I群中的一些血清型引起鸡的一种急性传染病，但各血清型的致病力不同。该病多发于3～6周龄的肉鸡，也可偶发于20周龄内的后备蛋鸡或种鸡，无性别差异，在更大龄的肉鸡也很少发生。各种品系肉鸡对本病都易感，其他禽类如火鸡、鹅、雉鸡等也有发病的报道。临床上以突发性死亡率增加，心包积液和肝炎综合征为主要特征。本病的感染途径主要是呼吸道、消化道及眼结膜等，可经机械方式和被带毒粪便污染的器具而在鸡群间、鸡场间迅速传播。国内曾经在非SPF鸡胚传代的疫苗生产用毒种中检测到禽腺病毒的污染，如果污染的疫苗曾经推广使用，可能会引起此病的广泛传播。越来越多的研究表明，心包积液和肝炎综合征的发生与某些免疫抑制病有关，常与引起禽类呼吸道疾病的病原微生物混合感染，随着家禽养殖规模的逐渐扩大，该病的危害也更加严重，对该病的防控现已成为国际禽病研究的热点。由于腺病毒的多血清型，该病至今没有有效疫苗可供使用。技术实现要素：本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种针对腺病毒的多途径协同免疫方法，以解决现有技术中针对腺病毒的人工免疫方法效果不佳的技术问题。本发明要解决的另一技术问题是现有技术注射卵黄抗体免疫腺病毒的方法效果不佳。为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：一种针对腺病毒的多途径协同免疫方法，包括以下步骤：1)制备腺病毒液；2)制备腺病毒卵黄抗体；3)将所述腺病毒液与腺病毒卵黄抗体混合后对鸡进行免疫注射。作为优选，所述腺病毒液中的抗原成为为腺病毒I群血清4型。作为优选，步骤3)所述腺病毒液中病毒效价为108.5TCID50、108.0TCID50或107.5TCID50。作为优选，步骤3)所述腺病毒卵黄抗体中抗体效价为1:4、1:8或1:16。作为优选，步骤3)中腺病毒液与腺病毒卵黄抗体的混合体积比是1:1。作为优选，步骤3)中所述注射的剂量是0.5mL。作为优选，步骤3)中腺病毒液与腺病毒卵黄抗体混合后先加入油佐剂乳化，油水混合制剂型，而后再对鸡进行免疫注射。作为优选，步骤1)所述腺病毒液是通过以下方法制备的：取分离鉴定株腺病毒I群血清4型，用灭菌生理盐水10倍稀释病毒液，接种已长满单层的鸡胚成纤维细胞，待细胞病变达到80％时，收获，反复冻融三次，测得的病毒含量为108.0TCID50，将检验合格的冻融液浓缩4倍后，为免疫原。作为优选，步骤2)所述腺病毒卵黄抗体是通过以下方法制备的：A)制备腺病毒灭活疫苗；B)取120日龄蛋鸡，每只胸部肌肉注射步骤A)所述疫苗2ml，10日后每只胸部肌肉再注射步骤A)所述疫苗2ml，10日后每只胸部肌肉再注射步骤A)所述疫苗2ml；C)取步骤B)三免后的鸡卵，制备卵黄抗体。作为优选，步骤C)所述制备卵黄抗体，具体包括以下操作：将分离的蛋黄搅拌成均匀膏状，加入等体积注射用水，搅拌均匀后，65℃加热灭活30分钟；加入6倍量酸化水，重复3组；将各组降温至1～4℃；4℃静置2～5小时，14000转离心取上清；加入正辛酸终浓度为0.3％，室温放置5～12小时；卵黄液用孔径为0.45μm滤器过滤澄清，再用0.22μm滤器过滤除菌；经截留分子量为100KD超滤膜堆进行浓缩；加入终浓度为0.2％甲醛溶液，室温放置24小时，期间振摇4～6次。作为优选，所述鸡是SPF鸡。本发明提供了一种针对腺病毒的多途径协同免疫方法，该技术方案在卵黄抗体免疫方法的基础上加以改进，在卵黄抗体中加入腺病毒免疫原，利用所得到的抗原抗体复合物执行免疫注射。实验验证发现，在控制特定的混合比例的基础上不仅不会产生感染问题，而且能显著提升免疫效果。本发明创新性的在SPF鸡上使用腺病毒免疫原加入卵黄抗体复合物，各组鸡均未见异常，全部健活，进行腺病毒抗体的监测，免疫原加入卵黄抗体复合物和灭活疫苗都能迅速的产生抗体。在优选技术方案中，优选用SPF鸡；优选用腺病毒灭活疫苗免疫，制备卵黄抗体；优选的，用腺病毒免疫原加入卵黄抗体的复合物免疫。此外，本发明方法可以用于鸡心包积液和肝炎综合征的免疫和预防。本发明巧妙的利用腺病毒加入卵黄抗体复合物的免疫方法，能够在现疫地有效的预防安卡拉病。本发明效果突出，同时成本较低、易于实现，因此具有突出的推广前景。附图说明图1是本发明具体实施方式中不同实验组免疫后血清中抗体水平变化图。具体实施方式以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。实施例11、免疫原的制备取分离鉴定株腺病毒I群血清4型，用灭菌生理盐水10倍稀释病毒液，接种已长满单层的鸡胚成纤维细胞，待细胞病变达到80％时，收获，反复冻融三次，测得的病毒含量为108.0TCID50，将检验合格的冻融液浓缩4倍后，为免疫原。2、卵黄抗体的制备2.1疫苗的制备将免疫原加入甲醛灭活后，制备成水相。将白油10号高压灭菌后，水相与油相乳化比例为1:1(V/V)，先将油相导入胶体磨，2500r/min搅拌，缓慢加入水相，加完后10000r/min乳化15分钟。充分振荡混匀，制成疫苗。2.2免疫首免：120日龄蛋鸡100只，每只胸部肌肉注射疫苗2ml；二免：首免10日后进行二免，每只胸部肌肉注射疫苗2ml；三免：二免后10日后进行三免，每只胸部肌肉注射疫苗2ml；2.3卵黄抗体的制备卵黄抗体制备方法：将分离的蛋黄搅拌成均匀膏状，加入等体积注射用水，搅拌均匀后，65℃加热灭活30分钟。加入6倍量酸化水，重复3组。将各组降温至1～4℃。4℃静置2～5小时，14000转离心取上清。加入正辛酸终浓度为0.3％，室温放置5～12小时。卵黄液用孔径为0.45μm滤器过滤澄清，再用0.22μm滤器过滤除菌。经截留分子量为100KD超滤膜堆进行浓缩。加入终浓度为0.2％甲醛溶液，室温放置24小时，期间振摇4～6次。卵黄抗体效价达到1:8以上，为合格。3、腺病毒免疫原加入卵黄抗体复合物的制备3.1配制不同浓度的免疫原将免疫原的108.0TCID50配制成108.5、108.0、107.5TCID50三种浓度。3.2配制不同腺病毒的抗体效价将腺病毒卵黄抗体的效价配制成1:4、1:8、1:16三种浓度。3.3配制不同体积混合的腺病毒加入卵黄抗体复合物将三种不同浓度的免疫原和三种不同浓度的卵黄抗体按照1:1的比例混合，制成抗原抗体复合物(三组)如表1，加入油佐剂中进行乳化，即可得到抗原抗体复合物的油水混合制剂型。表1抗原抗体复合物混合比例表项目复合物一复合物二复合物三免疫原108.5TCID50108.0TCID50107.5TCID50卵黄抗体1:41:81:164、对鸡进行免疫取10日龄SPF鸡50只，随机分为5组，每组10只，分别为复合物一组、复合物二组、复合物三组、疫苗组和空白对照组。分别肌肉注射1.0ml/只，空白对照组不免疫。免疫后，每周进行采血，检测抗体，直至7周。如表2所示。血清中的抗体水平见图1。表2不同实验组免疫方法及注射剂量由曲线图可知，注射抗原抗体复合物的鸡只，产生免疫应答的时间都要短于疫苗组，复合物二组是各组中血清抗体效价上升最快的，能够产生抗体的水平也是各组中最高的；复合物一组和复合物三组与疫苗组在抗体水平达到稳定时，抗体水平没有明显差异。5、攻毒保护取10日龄SPF鸡50只，随机分为5组，每组10只，分别为复合物一组、复合物二组、复合物三组、疫苗组和空白对照组。分别肌肉注射1.0ml/只，空白对照组不免疫。免疫后第7天，分别进行腺病毒I群血清4型攻毒，观察10天。见表3。表3不同实验组免疫效果评价表组别免疫剂量攻毒发病只数死亡只数复合物一组复合物一0.5mlI群4型42复合物二组复合物二0.5mlI群4型10复合物三组复合物三0.5mlI群4型32疫苗组疫苗组0.5mlI群4型75空白对照组//I群4型1010各组免疫7天后，分别进行腺病毒I群血清4型攻毒，观察10天。统计各组中鸡只发病率、死亡率及保护率。结果表明：空白对照组鸡只死亡率为100％，复合物二组死亡率最低，保护率可达到100％。复合物一组和复合物三组的保护率都高于疫苗组。实施例2一种针对腺病毒的多途径协同免疫方法，包括以下步骤：1)制备腺病毒液；2)制备腺病毒卵黄抗体；3)将所述腺病毒液与腺病毒卵黄抗体混合后对鸡进行免疫注射。在以上技术方案的基础上，满足以下条件：所述腺病毒液中的抗原成为为腺病毒I群血清4型。步骤3)所述腺病毒液中病毒效价为108.5TCID50、108.0TCID50或107.5TCID50。步骤3)所述腺病毒卵黄抗体中抗体效价为1:4、1:8或1:16。步骤3)中腺病毒液与腺病毒卵黄抗体的混合体积比是1:1。步骤3)中所述注射的剂量是0.5mL。步骤3)中腺病毒液与腺病毒卵黄抗体混合后先加入油佐剂乳化，油水混合制剂型，而后再对鸡进行免疫注射。步骤1)所述腺病毒液是通过以下方法制备的：取分离鉴定株腺病毒I群血清4型，用灭菌生理盐水10倍稀释病毒液，接种已长满单层的鸡胚成纤维细胞，待细胞病变达到80％时，收获，反复冻融三次，测得的病毒含量为108.0TCID50，将检验合格的冻融液浓缩4倍后，为免疫原。步骤2)所述腺病毒卵黄抗体是通过以下方法制备的：A)制备腺病毒灭活疫苗；B)取120日龄蛋鸡，每只胸部肌肉注射步骤A)所述疫苗2ml，10日后每只胸部肌肉再注射步骤A)所述疫苗2ml，10日后每只胸部肌肉再注射步骤A)所述疫苗2ml；C)取步骤B)三免后的鸡卵，制备卵黄抗体。步骤C)所述制备卵黄抗体，具体包括以下操作：将分离的蛋黄搅拌成均匀膏状，加入等体积注射用水，搅拌均匀后，65℃加热灭活30分钟；加入6倍量酸化水，重复3组；将各组降温至1～4℃；4℃静置2～5小时，14000转离心取上清；加入正辛酸终浓度为0.3％，室温放置5～12小时；卵黄液用孔径为0.45μm滤器过滤澄清，再用0.22μm滤器过滤除菌；经截留分子量为100KD超滤膜堆进行浓缩；加入终浓度为0.2％甲醛溶液，室温放置24小时，期间振摇4～6次。实施例3一种针对腺病毒的多途径协同免疫方法，包括以下步骤：1)制备腺病毒液；2)制备腺病毒卵黄抗体；3)将所述腺病毒液与腺病毒卵黄抗体混合后对鸡进行免疫注射。以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3