检测Ⅰ群禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒及其检测方法及其应用与流程

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种检测ⅰ群禽腺病毒抗体的间接elisa试剂盒及其检测方法及其应用。

背景技术：

禽腺病毒(fowladenovirus，fav)是一种无囊膜的双链dna病毒，可分为ⅰ、ⅱ、ⅲ三群，ⅰ群禽腺病毒(fowladenovirusgroupi，favⅰ)具有共同的群抗原，该群病毒代表株为鸡胚致死孤儿病毒(chickenembrolethalorphanvirus,celov)。2015年6月以来，我国多数省份的鸡群爆发安卡拉病(angraradisease)，病原为ⅰ群fav中c种fav-4型，主要以病禽突然倒地，出现呼吸道症状、神经症状、包涵体肝炎、心包积液综合征和砂囊糜烂为特征。该病主要发生于3周龄的肉鸡，发病1周左右为死亡高峰，死亡率可达20％～80％，给养殖生产造成巨大经济损失。目前，该病仍在我国鸡群中流行。

目前对于favⅰ传统的实验室诊断方法均存在一定缺陷，如病毒的分离鉴定、中和试验、琼脂扩散试验等方法费时耗力，结果不够精确，pcr、lamp等对试剂和设备要求较高且不便对大量样品进行检测，而elisa具有简便、快速、特异性强等优点，并且elisa检测抗体能有效的评估疫苗免疫效果。六邻体蛋白hexon是favⅰ的主要结构蛋白，位于favⅰ的外壳，hexon蛋白含有主要的属和亚属特异性抗原决定簇和次要的种特异性抗原决定簇，可以作为诊断抗原。因此，六邻体蛋白hexon对于favⅰ抗体的间接elisa检测具有重要研究意义。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明实施例提供了一种检测ⅰ群禽腺病毒抗体的间接elisa试剂盒及其检测方法及其应用，主要目的是提供一种简便、快速及准确检测favⅰ血清抗体的方法。

为达到上述目的，本发明主要提供了如下技术方案：

一方面，本发明实施例提供了一种检测ⅰ群禽腺病毒抗体的间接elisa试剂盒，所述试剂盒包括：包被酶标板、洗涤液、血清稀释液、底物显色液、兔抗鸡酶标二抗、终止液、favⅰ标准阳性血清和favⅰ标准阴性血清；其中，所述包被酶标板是以ⅰ群禽腺病毒favⅰ的重组六邻体蛋白作为包被抗原。

作为优选，所述ⅰ群禽腺病毒favⅰ的重组六邻体蛋白的核苷酸序列表为seq.id.no.1。

作为优选，所述ⅰ群禽腺病毒favⅰ的重组六邻体蛋白的制备方法包括：

设计合成引物，以ⅰ群禽腺病毒favⅰ代表株鸡胚致死孤儿病毒基因组为模板，通过pcr扩增得到六邻体蛋白的扩增产物，所述扩增产物连接其表达载体并同时进行双酶切,然后连接，构建重组质粒；将挑选的阳性重组质粒转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，获得阳性重组质粒单克隆菌，所述阳性重组质粒单克隆菌在iptg诱导下进行蛋白表达得到诱导产物，所述诱导产物依次经裂解沉淀、纯化及六阶段梯度复性后得到重组六邻体蛋白；其中，所述合成引物为：

上游引物：5'-cgcggatccatgactgcgcttactcccga-3'，

下游引物：5'-ccgctcgagccgctcgagcgccagcatgtactggtaac-3'。

作为优选，所述洗涤液为含0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液，ph为7.4。

作为优选，所述血清稀释液为含50g/l脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液；所述底物显色液为过氧化氢的四甲基联苯胺溶液。

作为优选，所述终止液为2m硫酸溶液。

作为优选，所述包被抗原的包被浓度为5.0μg/ml；所述包被酶标板经含50g/l脱脂奶粉的pbst封闭，装入密封袋中置于4℃保存。

作为优选，所述兔抗鸡酶标二抗的稀释倍数为1:5000。

另一方面，本发明实施例提供了上述检测ⅰ群禽腺病毒抗体的间接elisa试剂盒的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：

用血清稀释液以体积比1：200的比例稀释待检血清得到稀释血清；

向96孔酶标板每孔中加入100μ所述稀释血清，向酶标板各添加两孔favⅰ标准阳性血清和favⅰ标准阴性血清作为对照，于37℃孵育1h，弃去反应孔中液体，再向每孔加入300μl洗涤液并洗涤3次，每次5分钟，弃洗涤液，最后一次拍干；

向96孔酶标板每孔中加入100μl以体积比1:5000稀释后的兔抗鸡酶标二抗，于37℃孵育1h，弃去反应孔中液体，向每孔中加入300μl洗涤液并洗涤3次，每次5分钟，弃洗涤液，最后一次拍干；

向96孔酶标板每孔中加入100μl底物显色液，室温下避光作用10分钟；

向96孔酶标板每孔加入100μl终止液以终止显色反应；

用酶标仪在450nm波长下测定各孔吸光光度(od)值；

根据od值判定，当od450值≥0.322时，判定favⅰ抗体水平为阳性，当od450值＜0.322时判定favⅰ抗体水平为阴性。

又一方面，本发明实施例提供了上述检测ⅰ群禽腺病毒抗体的间接elisa试剂盒在检测ⅰ群禽腺病毒抗体中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明的间接elisa试剂盒，使用favⅰ重组六邻体蛋白(hexon)作为包被抗原，该重组六邻体蛋白易于制备和纯化，其免疫反应性良好；该重组六邻体蛋白纯化后作为包被抗原，其浓度易于确定和控制，有利于该试剂盒的大量生产与成本控制。

本发明的试剂盒用于检测ⅰ群禽腺病毒的抗体，具有高效、灵敏特异性和重复性均良好的优点，该试剂盒操作简便、快速、成本低廉，适合于在临床应用中进行推广，为ⅰ群禽腺病毒的快速检测提供可靠的技术手段。

附图说明

图1是本发明实施例1提供的pet-28a-hexon/b2l表达菌阳性单克隆鉴定核酸琼脂糖凝胶电泳图(图中，m是dm2000plusdnamarker，1是hexon基因扩增产物，2是pet-28a-hexon双酶切分析)；

图2是本发明实施例1提供的favⅰhexon重组蛋白的诱导表达及表达形式的分析和纯化图(图中，m是广谱蛋白marker，1是未诱导pet-28a-hexon，2是诱导5h的pet-28a-hexon，3是pet-28a-hexon菌体裂解上清，4是pet-28a-hexon菌体裂解沉淀，5是纯化的hexon重组蛋白)；

图3本发明实施例1提供的westernblot鉴定图(图中，m是预染蛋白marker，1是favⅰ阳性血清，2是spf鸡血清)。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下以较佳实施例，对依据本发明申请的具体实施方式、技术方案、特征及其功效，详细说明如后。下述说明中的多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。

实施例1

1.favⅰhexon蛋白(hexon指六邻体蛋白)表达载体的构建：

提取favⅰcelo毒株(cvccav208)(购自中国兽药监察所)的基因组dna，设计合成引物hexonf:5′-cgcggatccatgactgcgcttactcccga-3'(下划线为bamhi酶切点)，hexonr:5'-ccgctcgagccgctcgagcgccagcatgtactggtaac-3'(下划线为xhoi酶切位点)，扩增获得hexon基因扩增产物，扩增产物长度为1017bp，其核苷酸序列详见seq.id.no.1，胶回收hexon基因目的片段(扩增产物)，连接克隆载体peasy-tl，16℃连接过夜，连接产物转化trans5α克隆感受态细胞，并涂布至卡那霉素抗性(100mg/ml)的lb平板，于37℃培养过夜，挑取单克隆，于卡那霉素抗性的lb培养基中振荡培养10h后，提取质粒，酶切鉴定；

选取鉴定正确的peasy-t1-hexon质粒，pet-28a空质粒，分别用bamhi和xhoi双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，胶回收pet-28a载体条带和hexon基因目的条带，将回收产物16℃连接过夜；连接产物转化trans5α克隆感受态细胞，常规化选取阳性克隆，提取菌体质粒酶切鉴定，鉴定为阳性质粒送公司测序；将测序正确的重组质粒命名为pet-28a-hexon，如图1所示。

2.重组质粒的诱导表达

将构建正确的重组质粒pet-28a-hexon转入大肠杆菌感受态细胞bl21，常规化选取阳性克隆，提取菌体质粒酶切鉴定，阳性质粒命名为pet-28a-hexon/bl21，按体积分数1％转接至5ml新鲜含卡那霉素抗性的lb培养基，振荡培养至对数生长期(3.5h左右)，加入0.1％iptg进行诱导，继续诱导培养5h，取1ml菌液，4℃、12000r/min离心5min收集沉淀，加入100μlpbs(磷酸缓冲液)重悬菌体后，加入25μlsds-page上样缓冲液，沸水煮10min，12000r/min离心10min，进行sds-page电泳分析，电泳结果参照蛋白分子质量标准，可见诱导表达获得蛋白大小为37.4ku，如图2所示，与预测结果相符，证明该重组质粒在大肠杆菌中得到了诱导表达；

取1ml诱导5h的菌液，8000r/min离心5min收集菌体沉淀，加入100μlpbs重悬，超生裂解，4℃、12000r/min离心10min离心分离上清液和包涵体，用sds-page上样缓冲液分别处理上清液和沉淀，进行sds-page电泳分析，由电泳结果可见重组hexon蛋白已在沉淀中表达。

3.favⅰ重组hexon蛋白的westernblot试验

取诱导后5h菌液进行page-sds电泳，将电泳后的page-sds电泳凝胶，不经染色，直接用转印装置将蛋白以150ma转印到padf膜上，转印1.5h，转膜完毕后，小心取出padf膜，在tbst中漂洗一下，置于封闭液(含2.5％脱脂奶粉的tbst)中室温封闭1h(缓慢摇动)；弃封闭液，温育后的padf膜用tbst洗3次，每次10min，把padf膜放入用封闭液合适比列稀释的一抗(favⅰ阳性血清)中，4℃孵育过夜(缓慢摇动)，弃一抗，孵育后的padf膜tbst洗3次，每次10min，把padf膜放入用封闭液稀释的二抗(酶标抗鸡lgg二抗)，平稳摇动，室温孵育1h。弃二抗，用padf膜用tbst洗3次，每次10min，按照eeclwesternblotkit说明书进行显色，暗室压片曝光。

4.重组hexon蛋白的纯化复性

将pet-28a-hexon/bl21加入5mllb培养基，活化培养过夜，取5ml菌液加入500mllb培养基中，培养至对数期，加入0.1％iptg(iptg是指异丙基硫代半乳糖苷，一种诱导剂)后，诱导培养5h，收集菌液5000rpm离心10min，弃上清，再加入200mlpbs(磷酸盐缓冲液，ph＝7.4)重悬，再次5000rpm离心10min，弃上清；将加入50ml的细菌裂解液重悬菌体，超生破碎，12000rpm离心10min，收集沉淀；用包涵体洗涤液重悬沉淀，12000rpm离心10min，弃上清，共洗3次；加入5ml的含8mol/l尿素的包涵体溶解液，室温溶解30min，12000rpm离心10min，取上清用0.45μm滤器过滤，加入到proteinisoni-nta进行纯化，用180mmol/l的咪唑进行洗涤，收集1ml洗涤液，用300mmol/l的洗脱液进行洗脱，每次收集1ml的洗脱液，连收集10次，经sds-page检验，可见纯化效果良好，该蛋白易于制备和纯化；

将一定量的蛋白装入截留分子质量为15ku的透析袋中，用不同浓度的尿素(6，4，2和1mol/l)的透析液a、透析液b(20mmol/ltris-hci，0.6mmol/ll-精氨酸，10％甘油，2mmol/ledta，0.5mol/l尿素，ph8.0)和透析液c(20mmol/ltris-hci，25mmol/lnac1，0.2mol/l尿素)中进行蛋白的梯度复性，共六个阶段，每个阶段12h，于4℃缓慢的磁力搅拌；透析结束，收集复性蛋白，并用微量蛋白浓度测量仪测定蛋白浓度为1mg/ml，可见该蛋白易于纯化复性。

5.样品包被液、稀释液、洗涤液、终止液的配制

包被液为0.05m碳酸盐缓冲液：na2co31.59g，nahco32.93g，加蒸馏水定容至1000ml，ph为9.6；

样品稀释液为含50g/l脱脂奶粉的洗涤液；

洗涤液为含0.05％tween-20的0.01mph为7.4的磷酸盐缓冲液，其配方为：

nacl：8.5g，nah2po4·2h2o：0.356g，nah2po4·12h2o：2.772g，将其混合后，再用蒸馏水溶解并定容至1000ml，再向其中加入0.5ml吐温-20得到上述洗涤液；

终止液为含2m硫酸溶液：将21.8ml浓硫酸稀释定容至200ml得到上述2m硫酸溶液。

6.抗原(重组hexon蛋白)的最适包被浓度和血清的最适稀释度的确定

采用正交试验来确定抗原最适包被浓度，血清最适稀释度和酶标二抗最佳工作浓度；将纯化复性后的重组hexon蛋白用包被液依次稀释为2.5μg/ml、5.0μg/ml和7.5μg/ml三个稀释度，以100μl/孔的量滴加到96孔聚苯乙烯微量反应板中，组成方阵，4℃包被过夜；弃去抗原液，用洗涤液充分洗涤3次，300μl/孔，5min/次，用50g/l脱脂乳封闭，200μl/孔，37℃作用1h；弃去封闭液，用上述方法进行洗涤；将favⅰ阴、阳性血清一次做1:50、1:100、1:200、1:400倍稀释后，以100μl/孔的量滴加到96孔聚苯乙烯微量反应板中，37℃作用1h；弃血清，用上述方法洗涤，加入1:5000倍稀释的酶标二抗，以100μl/孔的量滴加到96孔聚苯乙烯微量反应板中，于37℃作用1h；弃去酶标二抗，用上述方法洗涤，加入底物显色液，100μl/孔，37℃避光显色10min，最终加入终止液终止反应；用酶标仪在450nm波长下测定od值；比较阴、阳性血清的od450值，即选择阳性样品od450值(p值)约为1.0，阴性样品od450值(n值)在0.1左右，并且p/n值最大时为最佳抗原包被浓度及血清和二抗稀释度。

正交试验结果显示当抗原的稀释度为5.0μg/ml每孔，血清以1:200倍稀释，酶标二抗以1:5000倍稀释时，阳性样品od450值(p值)约为1.0，阴性样品od450值(n值)在0.1左右，并且p/n值为9.31最大，因此确定重组hexon蛋白的最佳包被浓度为5.0μg/ml，血清最佳稀释度为1:200，酶标二抗最佳稀释度为1:5000，下述表1为间接elisa正交试验结果。

7.作用时间的优化

以抗原、血清和酶标二抗最佳作用浓度为基础，优化抗原的最佳封闭时间(37℃1h、1.5h和2h)、血清反应时间(37℃0.5h、1h、1.5h)、酶标二抗最佳孵育时间(37℃0.5h、1h、1.5h)以及最佳显色时间(37℃，10min、20min、30min)等条件，取阳性样品od450值(p值)约为1.0，阴性样品od450值(n值)在0.1左右，并且p/n值最大时，为最佳的作用时间，最终确定抗原的最佳封闭时间为1h，血清反应时间为1h，酶标二抗最佳孵育时间为1h，最佳显色时间为10min。

8.阴、阳性标准临界值的确定

取50份favⅰ抗体为阴性的血清样品，按照确定的条件进行间接elisa，用酶标仪在450nm波长下测定od值，计算od450的平均值及标准方差(s)，为消除每次间接elisa检测时，试验环境及操作的影响，每次检测时加入标准阳性血清和标准阴性血清作为对照，阳性血清od450约等于1.0，否则结果无效；经计算，50份阴性血清od450值的平均值标准差s≈0.061，因此间接elisa阴阳性临界值因此，当样品od450值≥0.322时，判定favⅰ抗体水平为阳性，当od450值＜0.322时，判定favⅰ抗体阴性。

9.间接elisa操作程序的确定(试剂盒的检测方法的确定)

按照以上各项所确定的最佳操作条件，确定间接elisa操作程序为：取出已包被并封闭好的elisa板条，用血清稀释液将待检血清做1：200倍稀释，加入酶标板各孔，每孔100μl，各加一孔，favⅰ阴性、阳性血清各加两孔，37℃作用1h；弃去孔内液体，每孔用300μl洗涤液洗涤3次，每次5min，最后一次洗涤完后，在吸水纸上拍打，弃尽孔内液体；每孔加入100μl酶标二抗，37℃作用1h；弃去孔内液体，每孔用300μl洗涤液洗涤3次，每次5min，最后一次洗涤完后，在吸水纸上拍打，弃尽孔内液体；每孔加入100μltmb(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)底物显色液后，室温避光显色10min，加入100μl终止液；用酶标仪在450nm波长读取各孔od值，判定结果。

表1.间接elisa正交试验结果

实施例2

elisa试剂盒的特异性试验：

按已建立的间接elisa操作方法，利用elisa试剂盒分别检测已知的i群禽腺病毒、鸡新城疫、禽流感、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌阳性血清样品；用酶标仪在450nm波长下测定各孔od值，确定该间接elisa检测方法的特异性；

检测结果表明，只有favⅰ阳性血清的od450>0.322，其他各分血清od450在0.112-0.201之间，远小于0.322，说明该间接elisa检测结果特异性良好。

实施例3

elisa试剂盒同批内的重复试验：

使用同批诱导纯化制备的favⅰhexon重组蛋白，按照最佳包被浓度包被酶标板，用已建的间接elisa操作方法，检测favⅰ抗体水平不同的阳性血清和favⅰ阴性血清各3份，在不同时间分别检测该6份随机选择的血清，用酶标仪在450nm波长下测定od值；根据每孔的od450值，计算各份血清的平均值标准差s，变异系数cv；检测结果显示，6份血清od450值的变异系数在1.2％-3.5％之间，说明同批favⅰhexon重组蛋白检测结果重复性良好。

实施例4

elisa试剂盒批间重复性实验：

使用不同批次纯化复性后的favⅰhexon重组蛋白，按照最佳抗原包被浓度包被酶标板，用已建立的间接elisa操作方法，检测同1份favⅰ阳性血清和1份favⅰ阴性血清，每孔设置4个重复，用酶标仪在450nm波长下测定od值；根据每孔的od450值，计算各份血清的平均值标准差s，变异系数cv；检测结果显示，2份血清od450值的变异系数在5.1％-8.3％之间，说明不同抗原检测重复性良好。

本发明的间接elisa试剂盒，使用favⅰ重组hexon蛋白作为包被抗原，该重组hexon蛋白易于制备和纯化，其免疫反应性良好；该重组hexon蛋白纯化后作为包被抗原，其浓度易于确定和控制，有利于该试剂盒的大量生产与成本控制。

本发明的试剂盒用于检测ⅰ群禽腺病毒的抗体，具有高效、灵敏特异性和重复性均良好的优点，该试剂盒操作简便、快速、成本低廉，适合于在临床应用中进行推广，为ⅰ群禽腺病毒的快速检测提供可靠的技术手段

本发明实施例中未尽之处，本领域技术人员均可从现有技术中选用。

以上公开的仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以上述权利要求的保护范围为准。

sequencelisting

<110>杨凌职业技术学院，兴平市众和现代生态农牧有限公司

<120>检测ⅰ群禽腺病毒抗体的间接elisa试剂盒及其检测方法及其应用

<160>1

<210>1

<211>1017

<212>dna

<213>ⅰ群禽腺病毒favⅰ

<400>1

atgactgcgcttactcccgacctgaccacggcgacgccgcggctgcagtactttcatatc60

gcgggccctggcacccgagagtatctatccgaggatctccagcagtttatctcggccacg120

gggagctactttgacttgaaaaacaaattcaggcagacggtcgtagctcccactcgcaat180

gtcaccaccgaaaaggcacaacgtctgcagatcagattctacccgatccagacggatgac240

acgccaaacagctatcgcgtgcgctacagcgtcaacgttggggacagctgggtgttggac300

atgggggcgacctacttcgacataaagggtgtgctggaccgcggaccttccttcaagccg360

tacggcggaacggcttataatccccttgcgccaagagaagctattttcaacacctgggtg420

gagagcactggtcctcagaccaatgtggtgggacagatgaccaacgtgtacacaaatcag480

accaggaacgacaagacggccacgcttcagcaggtcaatagcatctccggggtggttccc540

aacgtcaacctgggacccggcctcagtcaactagcatcccgggccgacgtggataatatt600

ggcgtggtgggacgtttcgccaaggtagactcagcgggcgtgaagcaggcgtacggagcc660

tatgtcaagcccgtgaaggacgacgggtctcagtctctgaaccagaccgcgtactggctg720

atggacaacggaggtaccaactatctgggtgccctggctgtggaagactacactcagacc780

ctgagttaccccgataccgtgctcgtgacccctcccaccgcttaccagcaagtcaactcc840

ggcaccatgcgggcatgcaggcccaactacatcggcttccgagacaactttatcaaccta900

ctgtaccacgactcgggcgtctgcagcggaacgctcaactccgagcgctccggcatgaac960

gtggtcgtggaactccaggacagaaacacagaactgagttaccagtacatgctggcg1017