一种禽腺病毒Ⅰ群4型毒株WZ株及其应用的制作方法

本发明属于兽医生物制品技术领域，具体涉及一种禽腺病毒Ⅰ群4型毒株WZ株及其应用。

背景技术：

禽腺病毒根据抗原特性可以分为Ⅰ群、Ⅱ群、Ⅲ群3个群，不同群之间的抗原性存在显著差异。Ⅰ群腺病毒在养禽场中广泛分布，拥有一种共同的群特异性抗原；可以从鸡、鸭、鹅、火鸡等多种禽类中分离到，能感染鸡的Ⅰ群腺病毒有12种血清型。Ⅱ群禽腺病毒包括火鸡出血性肠炎病毒、雉鸡大理石脾病病毒、鸡大脾病病毒。Ⅲ群禽腺病毒仅包含产蛋下降综合征病毒。Ⅰ群禽腺病毒中，血清4型（FAdV 4）可引起鸡包涵体肝炎和心包积液综合征（IBH-HPS）。

FAdV 4引起的包涵体肝炎和心包积液综合征则是2014年以来严重困扰我国养鸡业健康发展的最突出的一个疫病，因该病1987年首先报道于巴基斯坦高斯的安卡拉地区而得名“安卡拉病”。

FAdV 4是引起鸡包涵体肝炎和心包积液综合征的病原，该病毒主要感染3-7周龄长势良好的鸡，也可感染产蛋鸡。强毒力毒株感染时，则不表现任何临床症状，而突然出现死亡高峰。死亡率30-70%不等。主要的病理变化是心包增厚、不透明；包涵体肝炎和心包腔积有草黄色透明的、或呈胶冻样液体；肝脏肿大、颜色变黄或有斑驳状土黄色不规则条纹、质脆；肾脏充血，肾叶肿大，分界清晰，输尿管有尿酸盐沉积；脾脏肿大、充血；严重者心脏及心冠脂肪有出血点；腺胃乳头或腺胃和肌胃交界处有时有出血。

FAdV 4为线性双链DNA，无囊膜，呈二十面体对称结构，直径为70-80nm，病毒衣壳由240个六邻粒和12个五邻粒，共252个壳粒组成；病毒在宿主细胞核内复制，产生嗜碱性包涵体，中和抗原位于六邻粒和纤突，六邻粒含有主要的属和亚属特异性抗原决定簇和次要的种特异性抗原决定簇，是中和抗体的靶目标和主要的保护性抗原基因，与致病性密切相关。病毒的基因组从26kb-45kb不等。

FAdV 4主要通过眼、上呼吸道及消化道等途径感染鸡。病毒主要在消化道、呼吸道、肝脏、肾脏等部位复制。感染病毒后，当天即可分离到病毒，但是通常发病鸡在3周龄以后开始大量排毒。其中，肉鸡排出病毒的高峰期是4-6周；产蛋鸡是5-9周。值得注意的是Ⅰ群禽腺病毒在感染后8周还可使鸡重复受到感染；在鸡体内有循环抗体存在的同时，该群病毒仍能在鸡体内复制和排毒。

安卡拉病正在我国从北到南爆发流行，其给我国养禽业造成了巨大的打击。预防安卡拉病的疫苗已经在巴基斯坦、俄罗斯、缅甸、埃及、日本、秘鲁、尼泊尔、韩国、越南、菲律宾、墨西哥等国家和地区商业化应用。在中国，目前尚无商业化的相关制品。

因此，分离、鉴定、筛选中国鸡群感染流行的FAdV 4致病毒株，经鸡胚绒毛尿囊膜、鸡胚肝细胞（CEL）或传代细胞培养，得到一株优良的、抗原性优异的疫苗毒株，制备相应的疫苗，将对预防Ⅰ群4型禽腺病毒感染及其他亚型禽腺病毒的感染具有重要的现实意义和经济价值。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种禽腺病毒Ⅰ群4型毒株WZ株及其应用，从而弥补现有技术中的不足。

本发明的目的是以下述方式实现的：

一种禽腺病毒Ⅰ群4型毒株WZ株，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏单位简称：CCTCC，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，其保藏编号为：CCTCC NO：V201662，分类命名为：Ⅰ群4型禽腺病毒WZ株，保藏日期为：2016年12月14日。

一种包含权利要求1所述的禽腺病毒Ⅰ群4型毒株WZ株的病毒液。

如上述的包含权利要求1所述的禽腺病毒Ⅰ群4型毒株WZ株的病毒液的制备方法，包括以下步骤：将禽腺病毒Ⅰ群4型病毒毒株WZ株鸡胚传代后的种毒接种SPF鸡，收获感染死亡鸡的肝脏组织，研磨、冻融、离心，得到的上清液即为病毒液；或接种鸡胚肝细胞进行培养，冻融后收获细胞上清液即为病毒液。

如上述的禽腺病毒Ⅰ群4型毒株WZ株在制备Ⅰ群4型禽腺病毒疫苗中的应用。

一种禽腺病毒Ⅰ群4型病毒疫苗，所述疫苗的活性成分包括灭活的权利要求1所述的禽腺病毒Ⅰ群4型病毒毒株。

如上述的禽腺病毒Ⅰ群4型病毒疫苗制备方法，将权利要求2所述的病毒液用β丙内酯灭活，再与吐温-80混合均匀，得到水相；将注射用白油和吐温-80混合均匀，得到油相，水相与油相混合乳化，水相与油相的混合比例为1:3，制成Ⅰ群4型禽腺病毒灭活疫苗。

如上述的禽腺病毒Ⅰ群4型病毒疫苗，所述疫苗为禽腺病毒灭活疫苗、鸡新城疫-禽腺病毒二联灭活疫苗、鸡新城疫-传染性支气管炎-禽腺病毒病三联灭活疫苗、鸡新城疫-禽流感-禽腺病毒病三联灭活疫苗或鸡新城疫-传染性支气管炎-减蛋综合征-禽腺病毒病四联灭活疫苗。

如上述的禽腺病毒Ⅰ群4型毒株WZ株在制备禽腺病毒Ⅰ群4型病毒诊断用琼扩抗原试剂或HI抗原试剂中的应用。

如上述的禽腺病毒Ⅰ群4型毒株WZ株在制备禽腺病毒Ⅰ群4型病毒诊断用阳性血清试剂中的应用。

如上述的禽腺病毒Ⅰ群4型毒株WZ株在制备病毒治疗用卵黄抗体、抗血清中的应用。

相对于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明提供的一种Ⅰ群4型禽腺病毒毒株WZ株具有良好的特异性和免疫原性，免疫雏鸡能产生对Ⅰ群4型禽腺病毒特异性的中和抗体，一次免疫后7-14天产生抗体，在21天血清琼扩抗体水平达到1:16，49天血清琼扩抗体水平达到1:64。利用本发明提供的Ⅰ群4型禽腺病毒毒株制备的疫苗免疫后，对于Ⅰ群4型禽腺病毒毒株WZ株的攻毒保护率达到90%-100%。本发明作为制造效果良好的疫苗毒株，可预防禽包涵体肝炎和心包积液综合征，也可用于病毒的鉴定和流行病学的调查。

附图说明

图1是FAdV 4 WZ株间接凝集人O型血红细胞结果，其中1为FAdV 4 WZ株病毒鸡胚液；对为空白鸡胚液。

图2是琼脂免疫扩散试验（AGID）的结果，其中I：FadV 4 WZ株细胞培养液；1：FAdV 4 WZ株制备的标准阳性血清；2：Ⅰ群4型标准株AV211制备的阳性血清；3：阴性SPF鸡的血清；4：PBS液；5：双蒸馏水；6：抗EDS-76 HE02株血清。

图3是分离株DNA聚合酶基因片段PCR扩增结果，其中M：DL2000Mark，1：病毒鸡胚肝细胞培养液。

图4是Ⅰ群4型禽腺病毒分离毒株WZ株聚合酶片段的核苷酸遗传进化树分析图。

图5是SPF鸡胚肝细胞（40×）。

图6是感染FAdV 4 WZ株的鸡胚肝细胞（40×）。

图7是FAdV 4 WZ株感染死亡SPF鸡的病理变化：肝脏色浅变黄。

图8是FAdV 4 WZ株感染死亡SPF鸡的病理变化：心包积液。

图9是FAdV 4 WZ株感染死亡SPF鸡的病理变化：肾脏肿大，肾叶分界清晰。

图10是FAdV 4 WZ株感染死亡SPF鸡的病理变化：心肌出血。

图11是FAdV 4 WZ株感染死亡SPF鸡的病理变化：腺胃乳头出血。

图12是FAdV 4 WZ株感染死亡SPF鸡的病理变化：肺脏出血。

具体实施方式

为了使本发明更容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实例仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

一种Ⅰ群4型禽腺病毒毒株，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏单位简称：CCTCC，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，其保藏编号为：CCTCC NO：V201662，分类命名为：Ⅰ群4型禽腺病毒WZ株，保藏日期为：2016年12月14日。

一种包含权利要求1所述的禽腺病毒Ⅰ群4型毒株WZ株的病毒液。

如上述的包含权利要求1所述的禽腺病毒Ⅰ群4型毒株WZ株的病毒液的制备方法，包括以下步骤：将禽腺病毒Ⅰ群4型病毒毒株WZ株鸡胚传代后的种毒接种SPF鸡，收获感染死亡鸡的肝脏组织，研磨、冻融、离心，得到的上清液即为病毒液；或接种鸡胚肝细胞进行培养，冻融后收获细胞上清液即为病毒液。

如上述的禽腺病毒Ⅰ群4型毒株WZ株在制备Ⅰ群4型禽腺病毒疫苗中的应用。

一种禽腺病毒Ⅰ群4型病毒疫苗，所述疫苗的活性成分包括灭活的权利要求1所述的禽腺病毒Ⅰ群4型病毒毒株。

如上述的禽腺病毒Ⅰ群4型病毒疫苗制备方法，将权利要求2所述的病毒液用β丙内酯灭活，再与吐温-80混合均匀，得到水相；将注射用白油和吐温-80混合均匀，得到油相，水相与油相混合乳化，水相与油相的混合比例为1:3，制成Ⅰ群4型禽腺病毒灭活疫苗。

如上述的禽腺病毒Ⅰ群4型病毒疫苗，所述疫苗为禽腺病毒灭活疫苗、鸡新城疫-禽腺病毒二联灭活疫苗、鸡新城疫-传染性支气管炎-禽腺病毒病三联灭活疫苗、鸡新城疫-禽流感-禽腺病毒病三联灭活疫苗或鸡新城疫-传染性支气管炎-减蛋综合征-禽腺病毒病四联灭活疫苗。

如上述的禽腺病毒Ⅰ群4型毒株WZ株在制备禽腺病毒Ⅰ群4型病毒诊断用琼扩抗原试剂或HI抗原试剂中的应用。

如上述的禽腺病毒Ⅰ群4型毒株WZ株在制备禽腺病毒Ⅰ群4型病毒诊断用阳性血清试剂中的应用。

如上述的禽腺病毒Ⅰ群4型毒株WZ株在制备病毒治疗用卵黄抗体、抗血清中的应用。实施例1：Ⅰ群4型禽腺病毒毒株WZ株的分离与鉴定

2014年以来，我国多个养鸡地区的鸡群爆发了禽包涵体肝炎和心包积液综合征传染性疫病，发病率和死亡率高达30%-70%，给养鸡业造成了严重的经济损失。其剖检病理变化主要为肝炎，肝色浅质脆、肿大，肝和骨骼肌有出血点，镜检可见在肝细胞中有大而圆或不规则的嗜碱性或嗜酸性核内包涵体；心包均有不同程度的积液，积液呈淡黄色或草绿色，或呈果冻状。经PCR检测，结合流行病学调查，确诊为“安卡拉病”，即Ⅰ群4型禽腺病毒感染。2014年10月，发明人从河南省某养鸡场心包积液和包涵体肝炎典型发病病例中分离到1株病毒，命名为WZ株。

1. 病料采集与处理

选择临床症状典型的濒死或死亡后2 h以内的病死鸡，无菌采集肝脏、肾脏、心包液，按体积1：5的比例加入含青霉素1,000 U/mL、链霉素1,000 U/mL的灭菌生理盐水，匀浆制备组织悬液，置2-8 ºC冰箱，作用2 h，反复冻融3次后5000 rpm 离心10 min，取上清液，0.1 μm无菌滤器过滤，置于-20℃保存备用。

2. 病毒鸡胚接种和鸡胚肝细胞接种

上述处理获得的上清液适当稀释后，经绒毛尿囊膜接种9-12日龄SPF鸡胚，每胚0.2 mL，37.5℃孵化，每4-6 h照蛋1次，取出48-240 h死亡的鸡胚，收获含有病毒的绒毛尿囊膜、尿囊液及胚体，用上述方法连续传代，第8代鸡胚仍表现为胚体充血、发育受阻、胚体矮小、肝脏质脆、肝脏密布坏死灶。收集绒毛尿囊膜、羊水、尿囊液和胚体，-20℃保存备用。将上述适当稀释的病毒液接种SPF鸡胚肝细胞，24小时后出现典型病变，如图5-6所示。

3. 病毒的蚀斑纯化

上述处理获得的上清液用细胞培养液适当稀释后，采用SPF鸡胚肝细胞终点稀释法。具体方法是：将上述病毒上清液从10^-3-10^-8进行系列稀释，将每种稀释度病毒液接种3个长满原代SPF鸡胚肝细胞培养瓶，每个培养瓶加入0.2mL病毒稀释液，对照组只用细胞培养液代替，置37℃二氧化碳培养箱吸附1小时，每15分钟摇动1次，以便病毒均匀分布；然后冲洗未被吸附的病毒；取2倍浓缩的细胞培养液加入等量的2%琼脂糖（预热）中混合后，每个培养瓶加入5mL，待冷却凝固后倒置于37ºC二氧化碳培养箱培养48h；然后加入含0.002%中性红的加有等量2倍浓缩的细胞培养液的2%琼脂糖（预热）5mL，冷却凝固后形成第二覆盖层；把培养板倒置，在37℃二氧化碳培养箱继续培养，48h内观察结果。挑出单个蚀斑下的病变细胞再做2次如此蚀斑纯化。最后挑取单个蚀斑增殖发展成为繁殖病毒种，测定毒价，分装安瓿，保存在-80℃冰箱内。

4. 病毒鉴定

4.1 血凝性鉴定

无菌采集SPF鸡的全血10ml，用无菌PBS将红细胞反复洗3次后，将红细胞配置成1%浓度，4℃保存备用。按常规方法检测WZ株凝集该红细胞的特性。同时使用Ⅲ群禽腺病毒ESD-76株为阳性对照，无菌PBS为阴性对照。结果：分离毒不能凝集SPF鸡的红细胞，但是Ⅲ群禽腺病毒ESD-76株能够凝集鸡的红细胞。

无菌采集人O型血全血10ml，用无菌PBS将红细胞反复洗3次，将人O型血红细胞用抗禽腺病毒4型的阳性血清致敏，制备成1%的悬液。按间接血凝试验方法检测WZ株凝集该致敏红细胞的特性。结果：分离毒能凝集致敏的人O型血的红细胞，如图1所示。

4.2 理化特性鉴定

分别使用5-溴尿嘧啶-2′-脱氧核苷、盐酸、氢氧化钠、氯仿、乙醚、等处理病毒液，接种鸡胚，另设定未处理的阳性对照和PBS溶液的阴性对照。结果表明病毒为DNA病毒；不耐碱；无脂质囊膜；经盐酸、乙醚、氯仿处理的病毒液，仍可导致鸡胚的病变。

4.3 血清学鉴定

琼脂免疫扩散试验（AGID）：制备1%的琼脂平板（其中含8%NaCl，pH6.8），按常规打梅花形孔，中心孔加入待检病毒，周围孔加入待检病毒制作的阳性血清对照、Ⅰ群4型禽腺病毒AV211标准株制作的标准阳性血清、阴性血清。将琼脂板置于湿盒内，37℃放置24h后，结果显示：分离的WZ株病毒仅能与Ⅰ群4型禽腺病毒阳性血清出现明显沉淀线，与Ⅲ群禽腺病毒EDSV-76标准阳性血清、鸡阴性血清均无沉淀线，如图2所示。

4.4 PCR检测及全基因组测序

将经鸡胚肝细胞培养纯化的Ⅰ群4型禽腺病毒WZ株病毒液提取病毒DNA，进行PCR鉴定，1.5%琼脂糖凝胶电泳，测序，并进行进化分析。

PCR反应体系：总体积25μL；

模板DNA：1μL；

引物Pol F/Pol R：0.5μL /0.5μL；

Premix Taq：12.5μL；

水：10.5μL

PCR反应条件：

4℃ 保存

经扩增，获得了与预期大小一致的目的片段。结果见图3。

根据聚合酶基因序列比对和遗传进化分析，分离毒WZ株与Ⅰ群禽腺病毒4型属同一分支，核苷酸序列和氨基酸序列存在差异。详见图4。

全基因序列分析：将纯化的WZ株病毒进行全基因组测序，WZ株基因总长度为43591bp，有96个开放阅读框（ORF）；含有10083个A，9580个T，11878个G，12048个C；G+C含量为54.89%；基因的氯化铯浮密度为1.714g/cm3；与报道的JSJ13（KM096544）、HB1510(KU587519)FAdV4、MX-SHP95(KP295475)、KR5（HE608152）、ON1（GU188428）毒株相比，同属于禽腺病毒FAdV-4型，但基因有显著的变异。

4.5 SFP鸡回归试验

接种1日龄、62日龄、105日龄鸡、220日龄SPF鸡，分别口服、肌肉注射10^6.0 CCID₅₀的WZ株病毒液，连续观察14日，试验鸡均10/10发病，10/10死亡，如表1所示。发病鸡精神沉郁，食欲废绝，蹲伏，嗜睡，死亡；剖检均可见心包增厚、不透明，心包积液，肝脏色浅变黄、出血、质脆，如图7-12所示；组织学切片显示心室心肌坏死，尤其是乳头肌出现坏死，心肌纤维萎缩、甚至断裂，肌束和纤维间有蛋白性以及红细胞渗出；有的鸡的心外膜有大量单核细胞的聚集，间质细胞活化、变大，心肌动脉的内膜细胞肿大、变圆、空泡化并突出于动脉管腔；特征性的病理变化表现在发病死亡鸡的肝脏：肝脏有小的、多病灶的凝固性坏死，许多肝细胞有大、圆、嗜碱性的核内包涵体，染色质颗粒化、边缘化，胆管的被覆上皮出现水样变性和坏死，组织细胞堆积在门管区，常见脂肪变性和充血。肺脏有充血和水肿，单核细胞和异嗜白细胞沉积在肺泡壁，肺脏血管的变化同心脏一样。死亡鸡的肾脏肾小管上皮细胞出现大量的坏死，肾脏的管状上皮细胞被水肿液从基底膜挤起。

实施例2：Ⅰ群4型禽腺病毒WZ株毒种的制备

将已经过蚀斑纯化的FAdV 4 WZ株病毒毒株利用细胞培养的方法，在鸡胚肝细胞上扩大培养，同时测定WZ毒株的CCID₅₀，此时细胞培养得到的病毒液即为细胞培养病毒液。将细胞培养病毒液按照10^{6 .0}CCID₅₀的剂量肌肉接种50日龄SPF鸡，收获死亡鸡的肝脏组织，研磨，离心上清液测定病毒含量，该上清液即为制备疫苗使用的病毒液。将检验无菌且病毒含量≥10^-7.5CCID₅₀的病毒液定量分装，冻干保存，建立原始种子批。

实施例3：Ⅰ群4型禽腺病毒WZ株制苗用病毒液的制备

将按照一定比例稀释的FAdV 4 WZ株病毒液肌肉注射接种120日龄的SPF鸡，收获死亡鸡的肝脏、肾脏组织，研磨粉碎，冻融3次，离心，收获上清液，-20ºC保存，进行半成品检验。

实施例4：Ⅰ群4型禽腺病毒WZ株病毒液的灭活及半成品检验

1. 病毒的灭活

收集组织匀浆上清液，充分混合均匀后用70μm纱网过滤，向过滤后的液体中按照1:6000的比例加入适量的β-丙内酯，4℃，灭活24h，再置于37℃，2h。灭活后的病毒也置2℃-8℃保存。

2. 半成品的检验

2.1病毒含量的测定

在离心管中用MEM将病毒液作连续10倍的稀释，从10^-1-10^-6；将稀释好的病毒接种到96孔培养板中，每一稀释度接种一纵排，共8孔，每孔接种100µL；在每孔加入细胞悬液100µl，使细胞量达到（2-3）×10⁵个/mL；设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排（100µl生长液+100µl细胞悬液）；逐日观察并记录结果，一般需要观察4-5天；按Reed-Muench法计算CCID₅₀。

2.2 无菌检验

取灭活后的病毒液，按《中国兽药典》附录进行检验。

2.3灭活检验

将灭活后的病毒液10倍稀释，接种单层的SPF鸡原代肝细胞，37℃，CO₂培养箱培养，观察5-7天。将培养物反复冻融后再盲传1代，37℃，CO₂培养箱培养，观察5天，记录有无细胞病变。

3. 灭活疫苗的制备

取注射用白油94份，加司本-80 6份，混合后，加硬脂酸铝2份，随加随搅拌，加热至透明，高压灭菌备用。取吐温-80 4份，装入3个带玻璃珠的容器中，灭菌后冷却，加入Ⅰ群4型禽腺病毒WZ株制苗用病毒液96份，充分振摇，直至吐温-80完全溶解，制成水相。取油相3份置乳化罐内，开动电机慢速搅拌，同时分别徐徐加入上述水相1份，加完后再以3000 rpm剪切30-60分钟，制成油乳灭活疫苗。

4. 分装

定量分装，加盖密封，4℃保存。

实施例5：疫苗安全检验

用15日龄左右SPF鸡10只，每只肌肉或皮下注射疫苗l mL，观察14日，试验鸡均未出现因注射疫苗而出现的局部或全身反应，且增重不受影响。

实施例6：疫苗免疫效果检测

1. 血清学方法

取14日龄SPF鸡30只，其中10只各皮下或肌肉注射疫苗0.3mL，另30只作对照，免疫后0、3、7周所有鸡分别采血，分离血清，测定血清的琼扩抗体，如表2所示。

所有SPF鸡的攻毒剂量为10^6.0 CCID₅₀，接种剂量为0.3ml，免疫后0周测定血清的琼扩抗体为0；免疫后3周测定血清的琼扩抗体为1:16；免疫后7周测定血清的琼扩抗体为1:64。以上实验表明，注射疫苗后抗体水平不断升高，血清的琼扩抗体水平在第7周达到1:64。

2. 免疫攻毒法

用上述的14日龄的SPF鸡60只，分别在免疫后0天，21天，49天从免疫组和对照组各随机抽取10鸡，肌肉注射10^6.0CCID₅₀的Ⅰ群4型禽腺病毒WZ株病毒液。连续观察14天，记录发病和死亡情况，发现死亡率为10/10。

3. 交叉保护攻毒试验

取100只来自免疫过FAdV 4 WZ株灭活疫苗，抗FAdV 4 WZ株血清阳性的1日龄SPF鸡30只和抗FAdV 4 WZ株血清阴性的1日龄SPF鸡30只，总共分为6组，每组10只，用10⁶CCID₅₀的FAdV 4、FAdV 8和FAdV 11分别肌肉注射血清阳性鸡和血清阴性鸡各10只。观察记录至14天，剖检全部发病死亡鸡只和未死亡鸡只，检查心脏、肝脏，以及肝脏的组织学变化评估攻毒保护情况。

结果显示：疫苗免疫21日后免疫组均产生了较好的琼扩抗体，疫苗免疫3周、7周时攻毒均100%保护；空白对照组鸡只发病率100%，死亡率100%，空白对照组的发病鸡和死亡鸡均出现心包积液和包涵体肝炎，如表2所示。无论攻毒的毒株是那种血清型的禽腺病毒，血清阳性的SPF鸡的死亡率和组织学损伤率均显著低于血清阴性的SPF鸡。免疫含FAdV 4 WZ株的灭活疫苗的鸡只的肝炎的发病率显著降低，抗体阳性鸡攻击FAdV 4、FAdV 8和FAdV 11病毒，均不发生包涵体肝炎，而抗体阴性鸡，包涵体肝炎的发生率在40%以上。可见FAdV 4 WZ株灭活疫苗也能对FAdV 8和FAdV 11产生交叉保护。

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明整体构思前提下，还可以作出若干改变和改进，这些也应该视为本发明的保护范围。