一株新型RSV病毒及其应用的制作方法

本发明涉及一株新型RSV病毒及其应用。
背景技术：
：呼吸道合胞病毒（RSV）是副粘病毒科、肺炎病毒亚科、肺病毒属的病原性病毒。RSV广泛在世界各地广泛流行，是引起婴幼儿、老年人和免疫力低下人群下呼吸道感染最常见的病原微生物之一。RSV为非节段性的负链RNA病毒，基因组可编码11个蛋白。RNA基因组与病毒N蛋白紧密关联形成包裹在病毒包膜内的核衣壳，病毒粒子直径为150-300nm。RSV主要感染鼻腔以及肺部大、小气道的上皮细胞，也可能感染肺泡巨噬细胞和肺部其他类型的细胞，可引起细胞融合在一起形成合胞体。在RSV外膜具有G、F、SH等跨膜糖蛋白，共同参与病毒外膜与宿主细胞膜的融合以及细胞培养过程中合胞体的形成，其中G、F为两个重要的膜蛋白成分。G蛋白与病毒和细胞的黏附有关，并且G蛋白在亚型间及亚型内变异极大，是RSV逃逸机体免疫攻击的重要手段。根据G糖蛋白的抗原性的不同可将RSV病毒分为A和B两个亚型。F蛋白与病毒进入细胞并形成特征性的合胞体有关，还具有促使RSV在感染细胞间传播及溶血的作用。F和G蛋白是激发机体产生保护性抗体最主要的病毒抗原。但G蛋白具有较高的亚型特异性及变异性，故不宜制成疫苗，与之相比F蛋白的抗原性比较稳定，较少变异，并且F蛋白是诱导机体产生免疫保护的主要蛋白，它诱导产生的抗体能保护机体免受RSVA、B两亚型病毒的侵袭，而G蛋白抗体仅对同亚型病毒提供保护，所以F蛋白更有研究价值。在对临床RSV感染患者所感染的RSV病毒进行分离、分析后发现，中国国内患者感染的RSV病毒与国际流行株RSVA2有所不同。特别是病毒表面的F蛋白有较大差异。人们已经研制出多种形式的RSV疫苗，如福尔马林灭活疫苗(FI-RSV)、亚单位疫苗和减毒疫苗、冷适应株疫苗、病毒载体疫苗、DNA疫苗等，但至今尚无可用于预防RSV感染的疫苗问世。其中福尔马林灭活疫苗在20世纪60年代就已经研制出，但在当时人体接种后自然感染RSV时出现病情加重的意外情况。而RSV感染的广泛性使研发RSV疫苗尤为重要。如何构建得到高免疫原性F蛋白的RSV病毒是开发出高效RSV疫苗的关键。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种新型的RSV病毒及其应用。本发明所采取的技术方案是：一株新型的RSV病毒，其全基因组长15180bp，其序列如SEQIDNO：1所示。上述RSV病毒在制备RSV疫苗中的应用。RSV疫苗为全病毒灭活疫苗、亚单位疫苗、减毒活疫苗、VLP、基因工程疫苗、DNA疫苗。上述RSV病毒在制备进行体外预防性疫苗、治疗性疫苗及治疗性药物药效评价试剂中的应用。一种RSV抗原，其为上述RSV病毒F蛋白中的一段或全部，且至少包括一个特异性F蛋白氨基酸位点。RSV抗原的序列含有103A、276S中的至少一个。特别的，RSV抗原的序列为其F蛋白。本发明的有益效果是：本发明在中国分离的RSVA13病毒株序列的基础上获得的基因工程疫苗具有良好的免疫原性，其中BR4F蛋白可以诱导更高水平的抗体免疫反应，对小鼠肺部RSVA2和A13病毒株均具有极好的清除率。附图说明图1本发明中RSVA13病毒在HEP-2细胞上的扩增示意图；图2BR1、BR2、BR3和BR4F蛋白SDS-PAGE和WB分析图；图3BR1、BR2、BR3和BR4F蛋白抗鼠血清中和RSVA2/A13中和抗体分析图：A：中和RSVA2；B：中和RSVA13；图4小鼠肺组织RSVA2/A13病毒清除率分析图：A：清除RSVA2；B：清除RSVA13。具体实施方式下面结合实施例，进一步说明本发明的技术方案。主要材料病毒：RSVA2；细胞：昆虫细胞Sf9。主要试剂病毒RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒（OMEGA）；KODFX（TOYOBO）；Bac重组杆状质粒提取试剂盒（Omiga生物）；卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal、IPTG（北京鼎国）；1640培养基（Gibco)；胎牛血清（Gibco)；CellfectinⅡ脂质体（Sigma）；Palivizumab单抗；HRP羊抗人二抗（Invitrogen）。HEP-2细胞培养从液氮中取出一支冻存的细胞，37℃温水中迅速融化后，将细胞悬液接种转入75cm2的培养瓶中，逐步滴加培养基(含10％胎牛血清)的1640培养基至20ml，37℃，5％的CO2培养箱中培养。培养48～72h后，弃去培养液，使用D-Hanks洗三遍。用0.25%的胰酶消化细胞后加入上述1640培养基，以1:4～1:5分种率传代细胞，直到获得种毒所需的足量细胞。呼吸道合胞病毒RSV的分离、培养和全基因组测序将HEP-2细胞消化后，在24孔板中每孔按照1.0～2.0×105个/ml的密度加入1ml，37℃，5％的CO2培养箱中培养48h。从医院拿回鼻咽腔内分泌物等临床样品，5000rpm离心15min；离心后的上清液接种于24孔板中，每个孔0.5ml，放置于37℃吸附75～120min；然后加入含2％胎牛血清的1640培养基0.5ml，在37℃，5％的CO2培养箱中培养2～4天；连续盲传3代，第4代出现病变的样品继续传代，未出现病变的舍弃，筛选出一株出现合胞体现象并且增殖、病变速度最快的RSV毒株。取200μl获得的RSV病毒，利用OMEGA公司的病毒RNA提取试剂盒提取其基因组RNA。然后再以此RNA为模板配制逆转录体系，在1.5mlNuclease-Free离心管中加入下列成分配制成混合液：32μlRNA，2μl50μM的Random6mers，2μl10mM的dNTPmix，总体积为36μl；混匀后在65℃孵育5min，取出于冰上冷却2min；加入14μlcDNA合成混合液（10μl的5×RTBuffer、2μl的M-MLVReveraseTranscriptase和2μl的RnaseInhibitor），总体积为50μl，即为PCR扩增模板。设计15对不同引物再进行PCR扩增，反应体系：5μlRSV病毒cDNA，25μl2×PCRBuffer，1μlKODFX，10μldNTPs，1.5μl正向引物1，1.5μl反向引物2，6μlddH2O，50μl总体积；反应程序：94℃，3min；（98℃，10s；57℃，30s；68℃，2～3min），30cycles；68℃，10min。PCR产物送华大基因测序后，利用DNAstar软件进行拼接，结果显示病毒mRNA长15180bp，其基因序列如SEQIDNO：1所示，经分析该病毒株蛋白的氨基酸序列如下所示：编码核酸区域编码蛋白编码核酸区域编码蛋白99-518NS14678-5571G628-1002NS25651-7375F1140-2315N7593-8177M2-12347-3072P8152-8418M2-23255-4025M8485-14982L4293-4487SH将拼接的全长序列在NCBI中BLAST比对，可以看出该病毒是A型RSV病毒，并将该序列与NCBI中的序列RSVA2（GenBank登录号KT992094.1）进行比对，比对结果显示序列具有较高的相似度，分离的RSV病毒主要抗原F蛋白特有的氨基酸位点和氨基酸名称如下表所示，其中F蛋白276位点与A2株该位点不同（Palivizumab来源A2，该位点位于Palivizumab抗原位点II区域内，氨基酸位点为N），该病毒命名为RSVA13。新型RSVF蛋白特有的氨基酸位点和氨基酸名称表氨基酸位点氨基酸名称氨基酸缩写氨基酸位点氨基酸名称氨基酸缩写4脯氨酸P105丝氨酸S9苏氨酸T122苏氨酸T16丙氨酸A124天冬酰胺N20亮氨酸L152异亮氨酸I25丝氨酸S276丝氨酸S66谷氨酸E384异亮氨酸I101苏氨酸T540丙氨酸A103丙氨酸A基于上述测序结果，本领域技术人员可以使用已知的RSV病毒，合成基因组全序列或者构建cDNA克隆，克隆质粒，体外转染和包装病毒的方法，构建得到本发明所述的新型RSVA13病毒株。病毒(RSVA13株)扩增、滴度测定和保藏将HEP-2细胞传代到5瓶75cm2的培养瓶中，当细胞密度达到90%以上时，吸弃培养液上清，接种0.5ml实施例2中分离的RSV-A13病毒和3.5ml不含血清的1640培养基，37℃恒温培养，每隔15min摇晃一次，2h后补加16ml含10％胎牛血清的1640培养基。当细胞出现典型病变或细胞剥离量超过70%时，即可对培养物进行收获，如图1所示。将剩余贴壁的细胞全部吹下，使细胞或细胞碎片均匀悬浮，共100ml；以500μl/管分装至无菌螺盖离心管中，贴好标签，立即投入液氮中进行急冻；5-15min后从液氮中取出，放入-80℃长期保存。利用蚀斑法测定上述扩增的RSVA13病毒滴度，细胞消化后6孔板每孔加入3ml2.5×105个/ml的细胞悬液，在37℃，5%的CO2培养箱中培养。待细胞铺满培养孔后开始进行感染。用EP管将病毒稀释至所需的浓度，例如10-4～10-7；吸弃六孔板里的培养液，用D-Hanks液洗一遍后加入稀释好的病毒液0.2mL/孔，并设置复孔；轻轻振荡使其均匀分散在培养孔中，然后放置在CO2培养箱中，孵育75min，间隔15min轻摇一次；75min后，加入1%的甲基纤维素覆盖培养基，每孔4ml；放置于CO2培养箱中6天，结晶紫染板，统计出斑情况并计算病毒滴度；病毒滴度计算公式为：蚀斑形成单位（PFU/ml）=（平均蚀斑数×病毒稀释度）/每孔接种病毒量取对数计算LogPFU，得到RSVA13病毒滴度。疫苗的制备可以按常规方法进行，方便比较起见，下面提供一种疫苗的制备工艺。当然，本领域技术人员也可以使用其他方法制备得到相应的RSV疫苗。RSVF蛋白基因工程亚单位疫苗制备1)将RSV中国流行株（包括RSVA13）与A2株的F蛋白进行序列比对，发现有两处普遍存在的差异，差异位点为：T103A和N276S，并且其中一个位点在Palivizumab单抗作用的抗原位点II区域内，据此，针对A2株的F蛋白疫苗进行改造，设计出针对中国流行株的F蛋白疫苗，运用现有方法，如CN106119287A公开的方法构建4个针对F蛋白的穿梭载体，分别命名为Rp1、Rp2、Rp3和Rp4，其中Rp1根据RSVA2构建的载体，表达的目的蛋白为RSVA2的F蛋白，其余三个穿梭载体中的目的基因表达的目的蛋白与Rp1表达的目的蛋白有如下差异：Rp2，T103A（即F蛋白序列103位的T替换为A，下同）；Rp3，N276S；Rp4，T103A、N276S；2)将Rp1、Rp2、Rp3和Rp4三个质粒分别转化到本实验室制备的DH10multiBac感受态中进行重组，筛选阳性菌落，摇菌提取杆粒；3)将上一步所获得的杆粒转染到Sf9细胞中获得相应的第一代重组杆状病毒分别命名为：BR1-V1、BR2-V1、BR3-V1和BR4-V1。以MOI=0.1感染Sf9悬浮细胞对各病毒进行扩增，获得的第三代病毒分别为：BR1-V3、BR2-V3、BR3-V3和BR4-V3；4)将上述制得的第三代病毒以MOI=1感染Sf9悬浮细胞，以SF900-Ⅱ为悬浮培养基，接毒后在恒温摇床上27℃，95rpm培养96h，5000rpm离心30min收集细胞沉淀于-80℃保存；5)将收获的细胞样品按照10ml/g的比例加入裂解液（pH8.0，25mMTris-Cl，50mMNaCl，0.1%TergitolNP9，2mg/mlLeupeptin）重悬，冰上震荡摇晃2h，高速离心后依次使用强阴离子柱EMDTMAE，外源凝集素亲和介质GST-Sepharose4B和强阳离子EMDSO3纯化即可获得目的蛋白（RSVF蛋白或改造后的F蛋白）。RSVF蛋白SDS-PAGE和Westernblot分析分别取100μl纯化的BR1、BR2、BR3和BR4F蛋白，分别加入SDS-PAGELoadingBuffer后煮沸用于SDS-PAGE和Westernblot分析。四个样品点样在一块胶上，两个拷贝，其中一块SDS-PAGE电泳后直接考马斯亮蓝染色和脱色液脱色。另一块进行Westernblot分析，检测时一抗使用人源化Palivizumab单抗；二抗使用HRP标记抗人多克隆抗体，SDS-PAGE和Westernblot分析结果如图2所示，BR1、BR2、BR3、BR4四个F蛋白都没发现明显的差异。四个F蛋白对应的F0、F1、F2蛋白在同一水平位置且四个F蛋白纯度相近。同时利用Bradford法测定四个F蛋白的蛋白浓度。RSVF蛋白基因工程亚单位疫苗免疫原性分析将纯化获得的BR1、BR2、BR3和BR4F蛋白分别稀释到适合浓度，分别加入1/10体积的Al(OH)3佐剂（1000mg/ml）。利用加入佐剂后的RSVF蛋白按照1µg、5µg、25µg的剂量对BALB/c小鼠进行腹腔注射免疫。第0、21天分别免疫一次，于第28天进行眼后框采血，收集血清，-80℃分装保存。并在第29天进行攻毒试验。攻毒时每个剂量组又分为三个组别，分别滴鼻106PFURSVA2、RSVA13或PBS，并在攻毒后第4天，断颈处死小鼠，无菌条件下取左肺和右肺置于无菌的收集管中，并加入1ml预冷的1640培养基（2%FBS，双抗），保存于-80℃。抗鼠血清和肺组织标本采集后进行下列处理后和检测：抗鼠血清中和抗体滴度检测取各组小鼠血清样品，56℃灭活30min，用无血清的RPMI-1640培养基成倍比稀释，并分别将RSVA2和RSVA13用无血清的1640培养基稀释到100PFU/100μl。稀释后的病毒液、样品各取100μl，混合均匀，在37℃细胞培养箱放置2小时。吸弃Hep-2细胞培养上清，取200μl混合液加入到6孔板Hep-2细胞中，加入阴性对照，放入37℃继续培养2h。每孔加入4ml1%的甲基纤维素覆盖培养基，放置于CO2培养箱中5天，弃培养基，结晶紫染色，统计出斑情况，能使空斑数减少50%的血清稀释度判定为血清的中和抗体滴度，计算各个血清样品分别中和的RSVA2和RSVA13的中和抗体滴度。实验结果如图3A所示，本发明制备的BR1、BR2、BR3和BR4F蛋白1μg、5μg和25μg抗鼠血清中和RSVA2都可以诱导1:256左右的中和效价，免疫剂量达到1μg以后，中和效价没有明显变化，说明当免疫剂量达到1μg时，引起的体液免疫已经达到饱和；抗鼠血清中和RSVA13也都可以诱导1:256以上的中和效价（图3B），其中BR4F蛋白诱导的中和效价明显高于BR1、BR2和BR3F蛋白，差异极显著。肺组织病毒滴度检测于-80℃取出肺组织，无菌匀浆制备肺组织悬液，4℃，10000g离心5min，保留上清液。取100μl参照实施例3-蚀斑法进行病毒滴度测定，并计算肺组织病毒清除率。肺组织病毒清除率计算公式为：病毒清除率=（PBS对照组肺病毒滴度-样品组肺组织病毒滴度）/PBS对照组肺病毒滴度×100%。实验结果如图4（A：清除RSVA2；B：清除RSVA13）所示，针对RSVA2和RSVA13，BR1、BR2、BR3和BR4F蛋白组别的清除率都达到80%以上，其中BR4F蛋白三个免疫剂量对RSVA13清除率达到100%。综合F蛋白抗血清中和抗体效价和肺部病毒清除率结果说明，本发明在中国分离的RSVA13病毒株序列的基础上获得的基因工程疫苗BR2、BR3和BR4F蛋白具有良好的免疫原性，其中BR4F蛋白针对中国株RSVA13免疫原性更好。因此根据本发明RSVA13的病毒株序列，可构建出作为预防呼吸道合胞病毒感染相关疾病的疫苗。SEQUENCELISTING<110>广东华南联合疫苗开发院有限公司<120>一株新型RSV病毒及其应用<130>RSV-A13<160>1<170>PatentInversion3.5<210>1<211>15180<212>DNA<213>RSV<400>1acgcgaaaaaatgcgtacaacaaacttgcgtaaaccaaaaaaatggggcaaataagaatt60tgataagtaccacttaaatttaactcctttggttagagatgggcagcaactcattgagta120tgataaaagttagattgcaaaatctgtttgacaatgatgaagtagcattgttaaaaatga180catgctatactgacaaattaatacagttaactaatgctttggctaaggcagttatacata240caatcaaattgaatggcattgtatttgtgcatgttattacaagtagtgatatttgcccta300ataataatattgtagtgaaatccaatttcacaacaatgccagtattacaaaatggaggtt360atatatgggaaatgatggaattaacacactgctctcaacctaatggcctaatagatgaca420attgtgaaattaaattctccaaaaaactaagtgattcgacaatgaccaattatatgaatc480aattatctgaattacttggatttgacctcaatccataaatcataataaatatcaactagc540aaatcaatgtcactaacaccattagttaatataaaacttgacagaagataaaaatggggc600aaataaatcaattcagccgacccaaccatggacacaacacacaatgataccacaccacaa660agactgatgatcacagacatgagaccattatcacttgagactataataacatctctaacc720agagatatcataacacataaatttatatacttgataaatcatgaatgcatagtgagaaaa780cttgatgaaagacaggccacatttacatttctggtcaactatgaaatgaaactattgcac840aaagtgggaagcactaaatataaaaaatatactgaatacaacacaaaatatggcactttc900cctatgccaatatttatcaatcatgatgggttcttagaatgcattggcattaagcctacc960aagcacacacccataatatacaagtatgatctcaatccatgaatatcaaaacaagattca1020aacaatccgaaataacaactttatgcataatcacactccatagtccaaatggagcctgaa1080aattatagttatttaaaattaaggagagacataagatgaaagatggggcaaatacaaaaa1140tggctcttagcaaagtcaagttgaatgatacactcaacaaagatcaacttctatcatcca1200gcaaatataccatccaacggagcacaggagacagcattgacactcctaattatgatgtgc1260agaaacacattaataagttatgtggcatgttattaatcacagaagatgctaatcataaat1320tcactgggttaataggtatgttatatgctatgtctagattaggaagagaagacaccataa1380aaatactcaaagatgcgggatatcatgttaaggcaaatggagtggatgtaacaacacatc1440gtcaagacattaatgggaaagaaatgaaatttgaagtgttaacattagcaagcttaacaa1500ctgaaattcaaatcaacattgagatagaatctagaaaatcctacaaaaaaatgctaaaag1560aaatgggagaggtggcaccagaatacaggcatgactctcctgattgtgggatgataatat1620tatgtatagcagcattagtaataaccaaattagcagcaggagatagatcaggtcttacag1680ctgtgattaggagagctaataatgtcctaaaaaatgaaatgaaacgttataaaggtttat1740tacccaaggatatagccaacagcttctatgaagtgtttgaaaaatatcctcactttatag1800atgtttttgttcattttggtatagcacaatcttctaccagaggtggcagtagagttgaag1860ggatttttgcaggattgtttatgaatgcctatggtgcagggcaagtgatgttacggtggg1920gggtcttagcaaaatcagttaaaaacattatgttaggacacgctagtgtacaagcagaaa1980tggaacaagttgtggaggtgtatgagtatgctcagaaattgggtggagaagcaggattct2040accatatattgaacaacccaaaagcatcactattatctttgactcaatttcctcacttct2100ctagtgtagtattgggcaatgctgctggcctaggcataatgggagaatacagaggtacac2160caaggaatcaagatttatatgatgctgcaaaagcatatgctgaacaactcaaagaaaatg2220gtgtgattaactacagtgtattagacttgacagcagaagaactagaggctatcaaacatc2280agcttaatccaaaagataatgatgtagagctttgagttaataaaaaagtggggcaaataa2340atcatcatggaaaagtttgctcctgaattccatggggaagatgcaaacaacagagccacc2400aaattcctagaatcaataaagggcaaattcacatcacccaaagatcccaagaaaaaagat2460agtatcatatctgtcaactcaatagatatagaagtaaccaaagaaagccctataacatca2520aattcaaccattataaacccaataaatgagacagatgatactgtagggaacaagcccaat2580tatcaaagaaagcctctagtaagtttcaaagaagaccctatgccaagtgataatcctttt2640tcaaaactatacaaagaaaccatagaaacatttgataacaatgaagaagaatctagctat2700tcatatgaagaaataaatgatcagacaaacgataatataacagcaagattagataggatt2760gatgagaaattaagtgaaatactaggaatgcttcacacattagtagtagcgagtgcagga2820cctacatctgctcgggatggtataagagatgccatggttggtttaagagaagaaatgata2880gaaaaaatcagaactgaagcattaatgaccaatgacagactagaagctatggcaagactc2940aggaatgaagaaagtgaaaagatggcaaaagacacatcagatgaagtgtctctcaatcca3000acatcagagaaactgaacaacctgttggaagggaatgatagtgacaatgatctatcactt3060gaagatttctgattagctaccaaactgtacatcaaaacacaacaccaatagaaaaccaac3120aaacaaaccaactcacccatccaaccaaacatccatccgctgactagccaaccagccaaa3180aaacaaccagccaatccaaaactagccacccggaaaaaatcgacactatagttacaaaaa3240aagatggggcaaatatggaaacatacgtgaataa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