白纹伊蚊浓核病毒及其应用的制作方法

本发明属于蚊浓核病毒
技术领域：
，具体涉及白纹伊蚊浓核病毒及其应用。
背景技术：
：蚊媒传染病是以蚊虫为媒介传播的疾病，包括疟疾、丝虫病、登革热、流行性乙型脑炎、黄热病等。蚊媒病流行范围广，传播力强，发病率高，尽管经过了几个世纪的努力防制，蚊媒传播的疾病仍然在世界各地繁荣。全球每年有上亿人感染疟疾，疟疾每年致使100多万儿童的死亡，主要在非洲撒哈拉以南。登革热的主要传播媒介是白纹伊蚊和埃及伊蚊，在过去几十年中，随着其传播媒介的全球性扩散，传播范围也逐渐扩大，埃及伊蚊(Aedesaegypti)回到其在20世纪中期被消灭的区域并引起广泛流行的出血热，而白纹伊蚊则起源于东南亚。西尼罗河病毒在过去10年间在整个美洲已成为流行病，而基孔肯雅病毒已经出现在印度洋盆地和亚洲大陆，影响到数百万人。日本脑炎病毒也在印度次大陆和澳大拉西亚扩散，主要影响幼儿。我国已知蚊类18个属、371个种和亚种，涵盖疟疾、登革热、乙型脑炎、丝虫病的主要媒介。蚊媒传染病的流行严重危害人类生命健康，影响社会的稳定，阻碍经济的发展。限制蚊虫病在流行地区的影响的努力面临着控制蚊子数量和提供有效的公共卫生干预的双重挑战。媒介蚊虫防制是控制蚊媒传染病流行的重要措施。目前，对于登革热、黄热病、西尼罗病毒病等蚊媒性病毒传染病尚无特效治疗方法或特异性预防手段，媒介控制在预防其发生和流行方面的重要性就显得更加突出，而寻求有效的控制方法则成为世界医学界面临的重要课题。媒介化学防制由于其突出的效果在蚊媒防制中一度占有统治地位，但是随着传统上的化学防制所造成严重的环境污染，易引起蚊虫药物抗性产生等弊端的日益显现，蚊虫的生物防制愈来愈受到人们的青睐。生物防制主要应用蚊虫病原体、寄生物、捕食物来达到防治效果，对非目标生物和有益生物无害，不污染环境，蚊虫对其不易产生抗性。蚊浓核病毒(mosquitodensovirus，MDV)属细小病毒科(Parvovirinae)浓核病毒属，是单正链DNA病毒，病毒衣壳无包被，直径为20nm的正二十面体结构。蚊浓核病毒的基因组长4000nt左右，由左侧的非结构蛋白NS1、NS2编码区与右侧的结构蛋白VP编码区，以及两端的重复序列(invertedrepeatsequences，IRS)组成。非结构蛋白NS1的作用主要是辅助病毒复制，激活结构蛋白的转录。结构蛋白VP是病毒的衣壳蛋白IRS则作为病毒复制起始位点与包装信号。MDV是一类特异性感染蚊类的病原，感染蚊类后引起宿主特征性的细胞核致密增生病变(densonucleosis)严重时导致宿主发病或死亡。人们相继从自然界中的埃及伊蚊、白纹伊蚊、微小按蚊等多种蚊类以及多种实验室蚊细胞系/实验室株中相继分离到该类病毒，目前共分离得到20余株，约60％从野外种群分离得到。其宿主特异性强，仅感染蚊类，实验证实其不能感染其它种类昆虫、鱼类、鸟类和包括人类在内的哺乳动物。MDV在高滴度情况下对白纹伊蚊个体有致死效应，在低浓度情况下，对蚊虫个体具有亚致死效应，包括延长白纹伊蚊幼虫的幼虫期，延长化蛹时间，延长羽化时间等。蚊虫孳生水体中的病毒可入侵蚊虫脂肪体、成虫盘、气管周围细胞、马氏管等多种组织器官。蚊幼虫感染MDV后活动力大大降低，畸变，受到刺激后痉挛性抽搐，部分死亡。幸存幼虫成蛹与羽化时间延迟，易于蜕皮时死亡。病毒感染后成蚊的寿命会缩短，从而减少蚊传播病原的机会，而感染后的雌蚊产卵率及所产卵的活力也都大为下降。病毒不仅可以经由幼虫、成虫水平传播，还可以由雌蚊垂直传播，从而使病毒可播散到各种孳生水体并在自然界中不断延续。蚊浓核病毒MDV的宿主特异性，生物安全性等病原学特点使其具有蚊虫防制的潜在价值与其它种类病原不能比拟的优势，有作为高效的蚊类生物杀虫剂的应用前景，具有在蚊媒传染病防控方面的潜在价值。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供一种白纹伊蚊浓核病毒和其制备方法及其在制备生物杀蚊剂中的应用。本发明的上述技术问题是通过如下技术方案来实现的：一种白纹伊蚊浓核病毒，其名称为白纹伊蚊浓核病毒AalDV-6，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO.V201652。该病毒白纹伊蚊浓核病毒AalDV-6是由南方医科大学顾金保副教授等首次由广州野外捕获的白纹伊蚊分离得到，并对其体外细胞培养，形态结构，安全性等方面进行了深入研究，病毒基因组结构见图4。本发明还提供了上述白纹伊蚊浓核病毒AalDV-6的全序列，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1所示，该序列包含有白纹伊蚊浓核病毒的反向重复序列ITR，两种非结构蛋白编码序列NS1和NS2，以及一种结构蛋白编码序列VP。上述白纹伊蚊浓核病毒AalDV-6的制备方法包括培养所述细胞系增殖蚊浓核病毒AalDV-6株和饲养蚊幼虫增殖蚊浓核病毒AalDV-6。其中大量饲养蚊幼虫的方法培养增殖蚊浓核病毒可以较大地提高病毒产量，降低病毒生产的成本，操作也相对简便。具体地，所述的蚊细胞系培养增殖的方法为：(1)将白纹伊蚊浓核病毒AalDV-6(本发明分离获得的)接种于易感蚊细胞系，并培养接种后的细胞，收获细胞培养物；(2)将步骤(1)中的细胞培养物反复冻融多次，离心后，收集上清液即是蚊浓核病毒AalDV-6悬液。步骤(2)中优选将步骤(1)中的细胞培养物反复冻融3次，离心优选3750转/分钟离心15分钟。其中易感细胞可以是传代细胞系，也可以是原代细胞。适合于蚊浓核病毒的易感细胞包括但不限于白纹伊蚊C6/36细胞系(ATCC编号：CRL-1660)、埃及伊蚊aag2细胞等传代细胞系；原代细胞可以通过本领域公知的方法，用蚊幼虫或其组织进行分离和制备。所述易感细胞，是指适合于蚊浓核病毒感染和增殖的易感细胞。包括但不限于白纹伊蚊C6/36细胞，埃及伊蚊aag2细胞等蚊类传代细胞系。所述饲养幼虫制备蚊浓核病毒的方法为：(1)每组将约200只易感蚊虫暴露于108个/毫升的蚊浓核病毒AalDV-6中(来源于蚊浓核病毒AalDV-6悬液)，并饲养感染的蚊幼虫，收集死亡幼虫，7天后收集全部幼虫；(2)将步骤(1)中获得的幼虫用1毫升PBS研磨，3750转/分钟离心15分钟，上清用0.22μm滤膜过滤除菌，滤液即是蚊浓核病毒悬液。所述易感蚊虫，是指适合于感染蚊浓核病毒的易感蚊虫。包括但不限于白纹伊蚊、埃及伊蚊、致倦库蚊等蚊幼虫。进一步的上述白纹伊蚊浓核病毒AalDV-6的制备方法包括以下步骤：(1)病毒感染幼虫将刚蜕皮的白纹伊蚊幼虫置于蚊浓核病毒AalDV-6(本发明分离获得的)中，24小时后，再改用龟粮饲养，病毒感染幼虫后在体内逐渐增殖；(2)病毒分离饲养过程中，每天收集死亡幼虫的尸体，低温保存，将全部幼虫用PBS研磨，离心后，上清液采用0.22μm滤膜过滤除菌，吸取50μL提取DNA并采用实时荧光定量PCR对病毒进行定量，其余低温保藏，即获得含有蚊浓核病毒AalDV-6的悬液。步骤(1)～(2)饲养条件优选为恒温28±1℃，湿度为70％～80％，一天中光照和黑暗各12h。步骤(1)中优选将刚蜕皮的约200只白纹伊蚊幼虫加入200毫升108个/毫升浓度的蚊浓核病毒AalDV-6中。步骤(2)中优选7天后，全部幼虫用1毫升PBS研磨，3750转/分钟离心15分钟，上清液采用0.22μm的滤膜过滤除菌。上述病毒浓度定量的方法，采用本领域公知的实时定量荧光PCR绝对定量的方法，可以按照实施例2中叙述的SYBRGreen法，亦可采用Taqman探针法。实施例2的方法中采用引物如下：正向引物：5’-CAGGAGGAAACAGCACAAGA-3’，反向引物：5’-GTTTCGATACCGTAACGGATGC-3’，退火温度为55℃，荧光定量PCR反应体系的配制如下：2SuperRealGreenPreMixPlus10μL模板1μL正向引物(10μm)0.6μL反向引物(10μm)0.6μL50ROXReferenceDye0.4μLRNase-free7.4μL荧光定量PCR仪采用life公司的ABI7500，反应程序如下：上述白纹伊蚊浓核病毒在制备生物杀蚊剂中的应用。本发明还提供了一种生物杀蚊剂，其包括白纹伊蚊浓核病毒AalDV-6，将白纹伊蚊幼虫暴露于1010个/毫升的白纹伊蚊浓核病毒AalDV-6，白纹伊蚊的半数致死时间LT50为11.54天。本发明具有如下优点：(1)本发明提供的白纹伊蚊浓核病毒是一种只感染蚊虫的病毒，而不能感染其它种类昆虫、鱼类、鸟类和包括人类在内的哺乳动物，而病毒具有高度的寄生性，完全依赖宿主细胞的能量和代谢系统，获取生命活动所需的物质和能量。(2)本发明中的白纹伊蚊浓核病毒离开宿主细胞，它只是一个大化学分子，停止活动，可制成蛋白质结晶，为一个非生命体，只有遇到蚊类及其细胞才会通过吸附、进入、复制、装配、释放子代病毒而显示典型的生命体特征，根据该特点表明了其安全性，并且相比于其他种类诸如细菌真菌开发的生物杀蚊剂，对储存运输过程中的温度、时间等条件要求更低，运输和储存成本更低。(3)随着登革热、寨卡热以及基孔肯雅热等蚊媒传染病毒的流行，蚊虫对于化学杀虫剂抗药性增强的问题逐渐凸显，新型蚊媒控制方法的发明显得尤为重要，而本发明中的蚊浓核病毒就可开发成为一类高效安全的生物杀蚊剂。附图说明图1是实施例2中感染蚊浓核病毒AalDV-67天内C6/36细胞内的增殖情况；图2是实施例3中蚊浓核病毒AalDV-6在白纹伊蚊幼虫体内和孳生水体中的增殖情况；图3是实施例4中C6/36细胞培养后纯化的蚊浓核病毒AalDV-6的电镜照片；图4是实施例5中蚊浓核病毒AalDV-6基因组，其中AalDV-6基因组全长3961nt，编码两种非结构蛋白NS1和NS2，以及一种结构蛋白VP，病毒基因组两侧为末端重复序列(Invertedterminalrepeatsequence，ITR)；图5是实施例6中蚊浓核病毒AalDV-6在1010个病毒/毫升的剂量下，白纹伊蚊的累积死亡率。具体实施方式本发明在下述各实施例中被给予了具体的说明。这些实施例都是说明性的，并不在任何方面限制本发明。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。定义：“编码序列”在本申请中是指一种DNA序列，其能够被转录得到相应的RNA序列。“ITR”在本申请中是指病毒基因组两侧的末端反向重复序列，具有ITR结构是细小病毒科的特征之一，该结构具有调控病毒基因复制、转录、病毒拯救等多种功能。“NS1和NS2”在本申请中指的是病毒非结构蛋白1和2，该结构主要起到辅助病毒转录，包装等作用。“VP”在本申请中指的是病毒结构蛋白，该结构主要表达病毒的衣壳。“载体”在本申请中是指人工构建的，用于克隆的重组质粒。“AalDV-6”在本申请中是指一株从白纹伊蚊体内分离得到的蚊浓核病毒，由于现在全世界范围内报导的，在白纹伊蚊的体内或者白纹伊蚊C6/36细胞系内分离得到了5株蚊浓核病毒，故而目前本发明中分离获得的株病毒是由白纹伊蚊分离得到的第六株病毒，根据国际病毒分类委员会(InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses,ICTV)2015年颁布的病毒分类命名规则将该株病毒命名为AalDV-6，该病毒在中国典型微生物保藏中心的保藏号是CCTCCV201652。“LT50”在本申请中是指每组中半数数量蚊虫死亡的时间。实施例1蚊浓核病毒AalDV-6的分离与鉴定材料与方法：白纹伊蚊浓核病毒AalDV-6(AedesalbopictusdensovirusAalDV-6)，在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号：CCTCCV201652。保藏日期：2016年11月29日，保藏地点：中国武汉，武汉大学。本实验所用的0.01mM的pH7.2磷酸盐缓冲液PBS购自美国life生物科技有限公司，病毒基因组提取试剂盒TaKaRaminiBESTViralRNA/DNAExtractionKit购自Takara公司，ThermoScientificMaximaHotStartGreenPCRMasterMix酶购自美国ThermoFisher公司，T载体购自Promega公司，Trans1-T1化学感受态细胞购自北京全式金生物科技有限公司，引物合成和DNA测序均在上海英潍捷基贸易有限公司完成。广州野外捕捉的白纹伊蚊以20只为一组，分别用2mLPBS缓冲液进行研磨，3750转/分钟离心15分钟，收集上清，0.22μm的滤膜过滤除菌，取100μL上清提取病毒基因组，在蚊浓核病毒中保守的NS1编码区设计引物，检测蚊浓核病毒，引物采用美国国立卫生研究院NCBI的引物设计工具Primer-blast进行设计，引物序列为：正向引物：5’-CAGGAGGAAACAGCACAAGA-3’，反向引物：5’-GTTTCGATACCGTAACGGATGC-3’反应程序：预变性95℃，退火55℃，延伸72℃,延伸时间为15秒。含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳检测分析，PCR产物长度为150bp左右，将PCR检测阳性样本的PCR产物，纯化回收，连接T载体，转化Trans1-T1化学感受态细胞，菌落PCR鉴定之后，提交上海英潍捷基生物技术有限公司测序。各样本PCR检测后，得到一个阳性样本，PCR产物连接T载体后经公司测序，与NCBI上已发现的浓核病毒进行blast，发现其与已发现的蚊浓核病毒序列相似。实施例2白纹伊蚊浓核病毒-6在白纹伊蚊C6/36细胞内增殖情况材料与方法：本实验所用的病毒基因组提取试剂盒TaKaRaminiBESTViralRNA/DNAExtractionKit购自Takara公司，EcoRV限制性内切酶购自ThermoFisher公司，SuperRealPreMixPlus购自北京天根生物科技有限公司。C6/36细胞传代至25cm2细胞培养瓶，24h后细胞覆盖度约70～90％，将培养基弃掉，1mL28℃预热的PBS漂洗细胞一次，加入实施例1中检测到的AalDV-6，补足含有5％胎牛血清的1640培养基至5mL，置于28℃生化培养箱培养。每天收集200μL细胞悬液，-80℃储存，持续到第7天。剩余细胞悬液反复冻融3次，4℃3750转离心10分钟，上清转移至新的15mL离心管，用于实施例4中电镜观察病毒形态。由于MDV属DNA病毒，DnaseI除去病毒混合液中未包装入病毒颗粒的DNA后，病毒液用TaKaRaminiBESTViralRNA/DNA病毒基因组提取试剂盒进行提取，50μL无酶水洗脱，具体操作参见试剂说明书。荧光定量PCR检测病毒的浓度，qPCR引物如下：正向引物：5’-CAGGAGGAAACAGCACAAGA-3’，反向引物：5’-GTTTCGATACCGTAACGGATGC-3’荧光定量PCR反应体系的配制：2SuperRealGreenPreMixPlus10μL模板1μL正向引物(10μm)0.6μL反向引物(10μm)0.6μL50ROXReferenceDye0.4μLRNase-free7.4μL将实施例1中连接PCR产物的T载体为模板，EcoRV进行单酶切，回收的线性质粒测定浓度，计算出回收产物中每微升线性质粒的拷贝数，计算公式如下，拷贝数＝(DNA质量×6.022×1023)/(模板DNA的长度×1×109×660)，公式中DNA质量为qPCR中标准品的质量，模板DNA长度为标准品的长度。以倍率为10依次进行倍比稀释，选取其中5个点作为病毒绝对定量的标准品，检测病毒液中病毒的总拷贝数。反应程序如下：病毒浓度根据下列公式求得：病毒浓度(个/毫升)＝拷贝数×50μL/(200μL×10-3mL)，公式中50μL为提取病毒基因组时的洗脱体积，200μL指的是提取基因组的病毒悬液体积。结果见图1，C6/36中加入AalDV-6后，从第1天的1.34×109个/毫升开始，病毒浓度呈现逐渐升高的趋势，第5天达到最高的9.32×109个/毫升，与第1天相比病毒浓度升高了5.96倍，说明AalDV-6感染C6/36细胞后，能够在C6/36细胞内增殖，5天后，细胞开始老化，病毒浓度开始下降。实施例3白纹伊蚊浓核病毒-6在白纹伊蚊体内和孳生水体中的增殖情况材料与方法：本实验所用的TaKaRaminiBESTViralRNA/DNAExtractionKit，SuperRealPreMixPlus购自北京天根生物科技有限公司。取刚蜕皮的约1000只白纹伊蚊一龄幼虫以每200只分成一组，共五组，分别加入至2ml1010个/mL浓度的AalDV-6病毒中，用于感染后第1，3，6，9，12天白纹伊蚊幼虫体内和孳生水体中病毒浓度的检测。24小时后，加入除氯的水至200mL正常饲养。同时于取出其中一组，收集200微升水体用于孳生水体中病毒浓度的检测。所有幼虫则用1mLPBS缓冲液研磨，3750转/分钟离心15分钟，将上清通过0.22μm的滤膜过滤除菌，取出50μL提取病毒基因组，用于检测幼虫体内病毒的浓度，其余病毒储存于-80℃。感染1，3，6，9，12天后的样品采集参照上述方法。结果如图2所示，从图2中可以看出，白纹伊蚊1龄幼虫感染AalDV-6后，病毒感染第一天就开始侵入幼虫体内，并且在幼虫体内增殖，从第1天的1.86×1010个/毫升开始，至第9天达到最高的1.65×1012个/毫升，病毒浓度升高了88.71倍，死亡的幼虫，尸体在水体中崩解或被其它幼虫蚕食，导致幼虫体内的病毒释放入水，水体中病毒浓度增高，从第1天的2.51×108个/毫升升高至第9天的3.65×1010个/毫升，病毒浓度升高了145.42倍，相比实施例2中白纹伊蚊C6/36细胞系生产病毒，白纹伊蚊一龄幼虫生产有着明显的优势。无论在幼虫体内还是孳生水体内，病毒都有着更高的产量，其中幼虫体内可以富集到更高的病毒可以达到1012个/毫升的级别。实施例4白纹伊蚊浓核病毒形态鉴定材料与方法：取实施例3中回收的病毒液，4℃35000转/分钟离心75分钟沉淀病毒颗粒。沉淀的病毒用1M蔗糖缓冲液于4℃39000转/分钟离心120分钟进一步纯化。加入氯化铯(0.3克/毫升)于8℃60000转/分钟离心过夜以密度梯度分离病毒，用来提取DNA和电镜检测。将纯化的病毒颗粒用2％PTA负染色，PhilipsCM12电子显微镜下拍摄放大37000。结果见图3，从图3中可以看出，分离提纯后，电镜下可观察到大量直径为22～25nm的二十面体病毒粒子，该病毒粒子表面光滑；少数的粒子中央可被负染色剂染色，说明它的核酸已流出，为空的病毒衣壳。实施例5白纹伊蚊浓核病毒-5基因组序列测定材料与方法：病毒基因组提取试剂盒TaKaRaminiBESTViralRNA/DNAExtractionKit购自Takara公司，T4DNAligase，PCRpurificationkit，klenow酶均购自Thermofisher公司，TransStbl3化学感受态细胞购自北京全式金生物科技有限公司；DNA测序交由上海英潍捷基生物科技有限公司。TaKaRaminiBESTViralRNA/DNAExtractionKit提取AalDV-6的基因组DNA。提取的AalDV-6DNA中加入10单位的klenow酶，常温孵育15分钟使DNA平末端化。将平末端化的DNA用PCRpurificationkit纯化。含有卡那抗性的克隆载体pKMV质粒则用EcoRV限制性内切酶酶切，将线性质粒切胶回收。平末端化的AalDV-6DNA与线性质粒pKMV用T4DNAligase酶连接，转化化学感受态Trans-Stbl3，挑取单克隆菌落进行菌落PCR鉴定，引物采用M13F/M13R，引物序列如下：正向引物M13-F205'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'反向引物M13-Rev5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3'挑选阳性克隆，提交上海英潍捷基生物科技有限公司进行DNA测序，采用双向测通。结果：菌落PCR鉴定后，得到阳性克隆，使用M13-F20和M13-Rev进行双向测通。测序结果用DNAstar的Seqman工具进行拼接得到AalDV-6的全序列如下(见序列表1)：对该序列进行生物信息学分析，可知其基因组结构与其他埃及伊蚊和白纹伊蚊细胞系或蚊类种群中分离得到的相似，具有90％以上的同源性，表明此病毒是一株新的存在于蚊体内的浓核病毒。编码两种非结构蛋白NS1和NS2，以及一种结构蛋白VP，病毒基因组两侧为末端重复序列(Invertedterminalrepeatsequence，ITR)，其中AalDV-6基因组全长3981nt(见图4)。该菌株命名为白纹伊蚊浓核病毒AalDV-6(AedesalbopictusdensovirusAalDV-6)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年11月29日，保藏编号为CCTCCNO.V201652，保藏地址为中国武汉，武汉大学。实施例6白纹伊蚊浓核病毒-6杀虫剂毒力测试材料与方法：含白纹伊蚊浓核病毒AalDV-6粒子按照实施例3中的方法，由AalDV-6以108个/毫升浓度感染白纹伊蚊一龄幼虫，7天后分离提取白纹伊蚊幼虫体内的病毒而制备，根据qPCR绝对定量的方法可以精确测定AalDV-6的浓度。400只新孵化的一期幼虫，分为2组，分别为AalDV-6感染组与空白对照组。病毒处理组在除氯的自来水中加入含有病毒悬液使得AalDV-6病毒的为1010个/毫升，同时设置对照组，在没有食物的情况下保持24h。加入龟粮饲养，并监测幼虫数量直到化蛹，将蛹放入蚊笼中。每天记录幼虫，蛹和成虫数量，实验在感染后28天结束。概率单位法计算白纹伊蚊半数致死时间LT50。结果见图5，从图5中可以看出，白纹伊蚊暴露于1010个/毫升的浓核病毒AalDV-6，第7天开始进入死亡高峰，观察到28天，白纹伊蚊的死亡率达到96.5％。由SPSS22.0进行概率单位法计算得到浓核病毒AalDV-6的半数致死时间为11.54天，95％置信区间为10.848～12.217。通过本发明在前面的详细描述，对于那些本领域内的普通技术人员来说，本发明的修改和变化将是显而易见的，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，本发明的方法和仪器可以进行众多修饰。这些修改和变化都通过权利要求书被包括在本发明的范围内。<110>陈晓光顾金保<120>白纹伊蚊浓核病毒及其应用<210>1<211>3981<212>DNA<221>白纹伊蚊浓核病毒AalDV-6的全序列<400>1tataagtccatattccatataagaaatattatttcgtgatacggatactgtaagatacag1tttctattagaaacgatgtattacatctgtatcttacagtatccgtatcacgaaataata61tttcttatatggaatatggacttatatcaaagttctatatggatcactggaggtggaaaa121taagagagaaacataaggtggaaaataacttattatccacatacaaatacatccttaatt181tccactaccacatggtccacccctatataaggagtacaaaaggagggccaaatcgagtga241tgaattcagtctgcgttgaacattcaccgtgtgaacacggaaatctattttgtgagtgca301tatattgttgggagcatgacggtcagtgcagggggagaaaattggatttgggagcatcaa361ctggaatcgaaagaagattggccaacgataaccaacaaccagggctctcagatttatatt421gcaccgagacaatacatcttgcaactgcaataccagaaaggagaaccatcgatcgagaaa481attacgtcaaagatttcgctggtcaaaccgttggtgacctctacccacaattacaaggca541gcaccggagcctctgaaccaattgatttcgcatttccaactgttggctcaggaagctggg601aaatacttgtacgtgaatctcacaaacatttcgagccaaattatacggaagaagcttatc661aatcacatattagaagtgtacgaagaagattattccccgaagaaactatggataataacg721ggtcacaggcaagcacgaccgaaatgctacgagacgctgtccaaagatgcggttttgaag781gccctcctaacagcccaagcgaaaataacagagatggaattgatggaacgtgtatatcaa841ccgtggacatacaaagcaattgtattgttaacgcacattgcccaaaacaaggaccaagca901gtcaaaccaataagagaaagaaatcaaccgatacaacagaatcaagcggatccaaaaaaa961ataaaagcagcaataatcaacaaaatatacaagaacaaagcagttccagcatcaccgacg1021cactcgatctcgtcgacggagagttggatggatcaactggatcgaatcgagaaacagcat1081actacacattcgtcctccacaaaaacaacgttaaagaggactggagatacatcgccacaa1141ccagggccaagcaagcgccgagtttcatcacattcgatcacggagaccacatccatatcc1201tcttctcctcgtccaatacaggaggaaacagcacaagagtcagaaccagaatcaccaagt1261ttcttagtgcaacaagcgcaggaagtgcagaagcgactatcactttttccaaagttaaat1321ttctcaggaactacattctctattgcatccgttacggtatcgaaacagtcaatatctatg1381gaaataaaatccaacaacaattaaccgaagcaatggatacatttaaaatattatttgaaa1441atagagacccaaatgacgtaatattagaagccggatgcaaattatatcatgaagaaaaaa1501aggataataaacaaaaaagatgcggacaacggaagcaacaaaatctaacggacattatat1561tggaaaaaattaaagaaaagaaaattacaacggcacaacaatgggaaaatcaaattgaac1621cggaattcaaaatacaattaatgaaagagtttggattaaatgtggacagttatgtaacaa1681gaatagtacgcatcgaaagaacacgtatacaacaattgataaaagcaaaaacgcttacgg1741aaataatgcttgaaatattaaatgatgactatattaaacacttcacaccaggagaagaca1801acagcaaaacaacaaaatgtattgaatggatagaatatctattcaaagaaaataacatca1861atataatccacttcttggcatggaatgaaattataaaaacaaaaagatataaaaaaataa1921acggaatggtactagaaggtatcacaaacgcaggaaaatcactaatattagacaacttat1981tggccatggttaaaccagaagaaataccacgagaacgagacaacagtggattccaccttg2041accaagtaccaggagcaggatcgatcctatttgaagaaccaatgatcacaccagtaaacg2101tcggaacatggaaattattattagaaggaaaaaccataaaaacggatgtaaaaaacaaag2161acaaggaaccgatagaacgcacaccaacgtggatcacaacagcaactccaataacaaaca2221acattgatatgaatgaaacatcacaaatactacaaagaataaaattatatatattcaaaa2281aaagtatccaacacagagacgacaaatatactataaatgcgcaaattcaaaataaattaa2341tcagtcgtcctccaactctcattgagccaatacatatggccatagtgtttataaaaaatt2401tcacaaaaatatataatctaatcgcagaagaagacaaggcacacacagtaaacgaaaagg2461caatacaaataagcaacgaagtgaaagaagaagcagaatcatggcagacagcactacaat2521ggaccatgatggagaacaacgaggaacaaaacgaaaacgagacgcaggagctggaggatc2581aggtgctggaattggcaaaggagcaagcaactacgtaaaagaaggatatggaccaaatat2641gaccgaaatggtaccaagaaacatattgaataaaggaaatcacacagtctatcatgtggt2701aaaacaacaaaaatatctagacttcaattacgtaacaaatcaaaacccatacataattcc2761atatcaaacagcaggattctgggcatcaatgtgggaccaaacagacatcggatccaataa2821cagcattaatataatgaaagcattaaacaacgtatcactaggagtaacatggatcaaagg2881agaaatcacattcgaagtatattcagtaacaagacaacgcttgctaacaggaacaacaaa2941ccaaactacatgggactttgaaacaagtcaaaacatgttcatcgcagatgcagacagaga3001accagaaaacttcaacttagcaacagcagcagcaactggaccacttgcacaacaaacaac3061acaaacattactattcaatgcaaacaatgacagatatacaaaatatgaattaccacaaag3121aaaccaatatacaagggaaattaacttccaacaattaacaaacaactatatgtggaaacc3181attggacatcagcgctgcagcaaactttagaagattgatcccaatggcagaaggagtata3241tacaacatcaaatgcaacaagtaaaatgacagaattaacaaatcaaactacagcatacgc3301cacatcaggcaaaacaacacaagcaacactattcagaaatagaacatcataccctagaat3361gcatatggcacaaccacaagttccagatgaaaccggatacatgaaattcagataccaagt3421acgaatgagcacaaaactacatctcgaattccatctctacccagattacggcacatcaac3481aaacatagaatatatgcagagacaagtactggaattaccagaagtaacagcaacaggagg3541agtggtaacatgtatgccgtatgaaatcaaaacttaaatattaaattcaacttgtatcaa3601ctataacacatatataatcaataaagcattcaaaaaacatataagtcaaattaatatata3661tcacaataaaaatccaccttaaaacataagcttaatttccacctccgtattccacctcag3721aatattggcttaaaatccacctccaatgatacagttaggaagctaatattagtccgggat3781ccccgtgtggccgataggcgaggatcgaaagcccaaattttgatgacgtcacctcacaca3841cataccaaaagctttagtttctaatagaaacagcgtattacgcttaaagcttttggtatg3901tgtgtgaggtgacgtcatcaa3961。当前第1页1 2 3