本发明涉及病毒培养技术领域，具体涉及到一种采用两次细胞培养工艺提高病毒液病毒含量的方法。
背景技术：
病毒(Virus)由一种核酸分子(DNA或RNA)与蛋白质(Protein)构成或仅由蛋白质构成(如朊病毒)。病毒个体微小，结构简单。病毒没有细胞结构，由于没有实现新陈代谢所必需的基本系统，所以病毒自身不能复制。但是当它接触到宿主细胞时，便脱去蛋白质外套，它的核酸(基因)侵入宿主细胞内，借助后者的复制系统，按照病毒基因的指令复制新的病毒。
猪伪狂犬病(Porcine Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病病毒(Porcinepseudorabies virus,PRV)引起的以发热和脑脊髓炎为主要特征的急性、发热性传染病。该病可引起猪、牛、羊、犬、猫、家兔、小白鼠、水貂、狐等多种家畜和野生动物发病，具有高致死率。而猪是该病毒增殖感染唯一可存活的宿主，是该病毒的自然储存库。所以，从猪群中切断伪狂犬病毒的传播是控制伪狂犬病的有效途径。成年猪一般呈隐性感染，引起生长停滞，增重缓慢等；怀孕母猪可导致流产、死胎、木乃伊等综合症；7日龄以内的仔猪发病死亡率可达100％，断奶仔猪发病率可达20％～40％。
目前，该病分布于全世界50多个国家和地区，我国已有23个省(市)报道了该病的发生，给畜牧业造成了巨大的损失。因此必须对该病进行有效的预防和控制，最根本的措施是疫苗接种，而疫苗效果好坏主要取决于抗原的制备，抗原的制备又大多采用细胞增殖病毒的方法，但由于该病毒在不同的细胞上增 殖效果不尽相同，出现病变的时间、病变特征、病变观察的难易程度、病毒含量均有所差别，如不能掌握其规律选择最佳的细胞系进行病毒的培养，将难以生产出优质的疫苗的。
转瓶培养细胞是较传统的一种生产工艺，该工艺按照常规的生产方法制备的半成品抗原效价较低，批间差会比较大，生产效率低下，难以达到配苗要求。常规方法的转瓶生产，常在接毒时间、接毒量以及收获时间上进行工艺摸索，找到病毒增殖的一个峰值；但是现有工艺基础上对抗原病毒含量有进一步提升难度是非常大的。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种采用两次细胞培养工艺提高病毒液病毒含量的方法。
为达上述目的，本发明的一个实施例中提供了一种采用两次细胞培养工艺提高病毒液病毒含量的方法，包括以下步骤：
(1)、细胞培养：取生长良好的传代细胞，弃掉原培养液，使用PBS溶液冲洗；冲洗完毕后加入处理液进行消化传代培养，传代时细胞的接种密度为20万～40万个/ml，获得接种细胞；
(2)、制备种毒：取生长良好的传代细胞加入生长液使传代细胞长成单层后弃掉生长液，接种基础种毒，加入维持液并使基础种毒均匀而充分的接触单层细胞，待细胞病变达到70％～80％时将细胞在低温下冻融，冻融后收获得到生产用种毒；
(3)、制备细胞悬液：在接种细胞中加入处理液分散成单个细胞，然后加入含有血清的维持液振荡待用，得到细胞悬液；
(4)、制备病毒液：取生长成单层的接种细胞加入生产用种毒，然后再加 入细胞悬液后培养，当细胞病变达到70％～80％时停止培养进行冻融处理，收获病毒液。
优选的，述传代细胞为ST细胞或者VERO细胞。
优选的，处理液为0.02％EDTA-0.25％胰蛋白酶的混合液。
优选的，步骤(1)细胞培养过程中，接种体积为接种瓶体积的10％。
优选的，步骤(2)中基础种毒为猪传染性胃肠炎病毒TGEV或伪狂犬病毒；所述冻融的低温温度为-15℃。
优选的，步骤(3)中加入接种瓶体积30％的维持液，所述维持液中含有2％～8％的血清。
优选的，步骤(4)中细胞悬液的加入量为培养瓶体积的10％。
优选的，步骤(4)中生产用种毒的接毒量为0.001MOI～0.1MOI。
优选的，步骤(4)中培养温度为37℃。
优选的，步骤(4)中取生长成单层的接种细胞的具体过程为：接种细胞按照1:3的比例进行传代培养，培养40小时～60小时后细胞生长层致密单层。
优选的，所示维持液为含有质量分数为0.5％赤藓酮糖、质量分数为0.5％丁基羟基茴香醚、体积分数为2％～5％牛血清的MEM培养基。
综上所述，本发明具有以下优点：
本发明在现有常规的生产工艺上进行了优化，在单层细胞接种后再加入细胞悬液进行两次细胞培养工艺，能够打破现有生产工艺的瓶颈，有效提高病毒液中病毒的含量和滴度，有效缩短生产周期，提高产品质量，降低生产成本；同时本发明的方法还具有操作简单和重复性好的特点。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对 本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例一：伪狂犬病毒的增殖
1、实验材料准备
实验细胞：ST细胞；
基础种毒：伪狂犬病毒Bartha-K61株；
处理液：0.02％EDTA-0.25％胰蛋白酶的混合液；
培养瓶；
生长液：含体积浓度10％的新生牛血清(内蒙古金源康生物工程有限公司)的MEM培养基(gibco公司)；
维持液：含体积浓度2％的新生牛血清(内蒙古金源康生物工程有限公司)的MEM培养基(gibco公司)；
2、实验步骤：
(1)、细胞培养：取生长良好的ST细胞，弃掉原培养液，使用PBS溶液冲洗1到2次；冲洗完毕后加入处理液进行消化传代培养，传代时细胞的接种密度为30万个/ml，获得接种细胞；培养温度37±0.5℃，转速：10转/小时；接种体积为接种瓶体积的10％；
(2)、制备种毒：取生长良好的ST细胞加入生长液在37℃下培养使传代细胞长成单层后弃掉生长液，接种2％的基础种毒，加入培养瓶体积10％的维持液转动培养瓶使基础种毒均匀而充分的接触单层细胞，最后把细胞瓶放入37℃培育箱内培养，按时观察。待细胞病变达到70％～80％时将细胞在置于-15℃下冻融，冻融后收获得到生产用种毒；
(3)、制备细胞悬液：在接种细胞中加入处理液分散成单个细胞，然后加 入含有血清的维持液振荡待用；维持液的加入体积为接种瓶体积的30％，维持液中含有2％的血清，得到细胞悬液；
(4)、制备病毒液：接种细胞按照1:3的比例进行传代培养，培养40小时～60小时后细胞生长层致密单层；取生长成单层的接种细胞加入生产用种毒，生产用种毒的接毒量为0.001MOI～0.1MOI。然后再加入细胞悬液后于37℃下培养，细胞悬液的加入量为培养瓶体积的10％；当细胞病变达到80％时停止培养于-15℃下进行冻融处理，测定病毒含量为9.12logTCID50/ml，将收获的病毒液置于2～8℃保存。
3、对比实验：
采用现有的单层细胞接毒后培养制备病毒液，制备方法参考CN103756974专利中公开的方法。为了减少误差，对比实验设置三组，双层细胞接毒为本发明的方法制备得到。对比实验结果如表1所示。
表1：对比实验数据结果(单位：TCID50/ml)
实施例二：
1、实验材料准备
实验细胞：ST细胞；
基础种毒：猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)SCJY株；
处理液：0.02％EDTA-0.25％胰蛋白酶的混合液；
培养瓶；
生长液：含体积浓度10％的新生牛血清(内蒙古金源康生物工程有限公司)的MEM培养基(gibco公司)；
维持液：含体积浓度4％的新生牛血清(内蒙古金源康生物工程有限公司)的MEM培养基(gibco公司)；
2、实验步骤：
(1)、细胞培养：取生长良好的ST细胞，弃掉原培养液，使用PBS溶液冲洗1到2次；冲洗完毕后加入处理液进行消化传代培养，传代时细胞的接种密度为35万个/ml，获得接种细胞；培养温度37℃，转速：10转/小时；接种体积为接种瓶体积的10％；
(2)、制备种毒：取生长良好的ST细胞加入生长液在37℃下培养使传代细胞长成单层后弃掉生长液，接种3％的基础种毒，加入培养瓶体积10％的维持液转动培养瓶使基础种毒均匀而充分的接触单层细胞，最后把细胞瓶放入37℃培育箱内培养，按时观察。待细胞病变达到75％时将细胞在置于-15℃下冻融，冻融后收获得到生产用种毒；
(3)、制备细胞悬液：在接种细胞中加入处理液分散成单个细胞，然后加入含有血清的维持液振荡待用；维持液的加入体积为接种瓶体积的30％，维持液中含有2％的血清，得到细胞悬液；
(4)、制备病毒液：接种细胞按照1:3的比例进行传代培养，培养40小时～60小时后细胞生长层致密单层；取生长成单层的接种细胞加入生产用种毒，生产用种毒的接毒量为0.001MOI～0.1MOI。然后再加入细胞悬液后于37℃下培养，细胞悬液的加入量为培养瓶体积的10％；当细胞病变达到80％时停止培养于-15℃下进行冻融处理，测定病毒含量为9.12logTCID50/ml，将收获的病毒液置于2～8℃保存。
3、对比实验：
采用现有的单层细胞接毒后培养制备病毒液，制备方法参考CN103756974专利中公开的方法。为了减少误差，对比实验设置三组，双层细胞接毒为本发明的方法制备得到。对比实验结果如表2所示。
表2：对比实验数据结果(单位：TCID50/ml)
实施例三：
1、实验材料准备
实验细胞：VERO细胞；
基础种毒：猪流行性腹泻病毒(PEDV)SCJY株；
处理液：0.02％EDTA-0.25％胰蛋白酶的混合液；
培养瓶；
生长液：含体积浓度10％的新生牛血清(内蒙古金源康生物工程有限公司)的MEM培养基(gibco公司)；
维持液：含体积浓度4％的新生牛血清(内蒙古金源康生物工程有限公司)的MEM培养基(gibco公司)；
2、实验步骤：
(1)、细胞培养：取生长良好的ST细胞，弃掉原培养液，使用PBS溶液冲洗1到2次；冲洗完毕后加入处理液进行消化传代培养，传代时细胞的接种密度为35万个/ml，获得接种细胞；培养温度37℃，转速：10转/小时；接种体 积为接种瓶体积的10％；
(2)、制备种毒：取生长良好的ST细胞加入生长液在37℃下培养使传代细胞长成单层后弃掉生长液，接种3％的基础种毒，加入培养瓶体积10％的维持液转动培养瓶使基础种毒均匀而充分的接触单层细胞，最后把细胞瓶放入37℃培育箱内培养，按时观察。待细胞病变达到75％时将细胞在置于-15℃下冻融，冻融后收获得到生产用种毒；
(3)、制备细胞悬液：在接种细胞中加入处理液分散成单个细胞，然后加入含有血清的维持液振荡待用；维持液的加入体积为接种瓶体积的30％，维持液中含有2％的血清，得到细胞悬液；
(4)、制备病毒液：接种细胞按照1:3的比例进行传代培养，培养40小时～60小时后细胞生长层致密单层；取生长成单层的接种细胞加入生产用种毒，生产用种毒的接毒量为0.001MOI～0.1MOI。然后再加入细胞悬液后于37℃下培养，细胞悬液的加入量为培养瓶体积的10％；当细胞病变达到80％时停止培养于-15℃下进行冻融处理，测定病毒含量为9.12logTCID50/ml，将收获的病毒液置于2～8℃保存。
3、对比实验：
采用现有的单层细胞接毒后培养制备病毒液，制备方法参考CN103756974专利中公开的方法。为了减少误差，对比实验设置三组，双层细胞接毒为本发明的方法制备得到。对比实验结果如表3所示。
表3：对比实验数据结果(单位：TCID50/ml)
从上述三组对比实验可以得知，本发明采用双层细胞培养方法相对于单层细胞接毒培养的方法能够显著提高病毒液中病毒含量。