一种血清4型禽腺病毒灭活苗及其制备方法与流程

本发明属于疫苗制备技术领域，具体涉及一种基于悬浮培养技术的血清4型禽腺病毒灭活苗。

背景技术：

禽腺病毒(Fowl Adenovirus，FAdV)属于腺病毒科禽腺病毒属，分为5个种(A-E)，12个血清型。虽然在世界各地均有报道，FAdV感染一般引起亚临床状况，而急性感染主要引起包涵体肝炎、心包积液以及肌胃糜烂等。自2013年，国内鸡群由FAdV引起的包涵体肝炎、心包积液病例逐渐增多。到2015年，FAdV感染在国内多个省份鸡群爆发。目前FAdV爆发不仅发生在3-4周龄肉鸡，还发生于10-20周龄的蛋鸡，给国内养鸡业造成了严重经济损失。病毒分离鉴定发现，目前高致病性血清4型FAdV在国内鸡群流行较广泛。然目前尚无针对血清4型FAdV的商品化疫苗。在疫苗的研制中，病毒效价的高低不仅影响免疫效果，而且直接影响疫苗成本及价格。病毒的鸡胚接种是禽用病毒疫苗常用的扩增技术。虽然血清4型FAdV病毒能在鸡胚中生长复制，但是鸡胚中扩增的血清4型FAdV病毒滴度较低，不能满足疫苗生产高效价的要求。另外，血清4型FAdV病毒虽然能在鸡肝细胞中有效复制，但是普通细胞培养也很难满足疫苗的规模化生产要求。病毒的悬浮培养技术可大大提高病毒效价，是高效价病毒疫苗规模化生产的发展趋势。

技术实现要素：

本发明的目的是在于提供一基于悬浮培养技术的血清4型禽腺病毒灭活苗。本发明的原理和最核心的关键技术是利用鸡肝细胞，通过激流式生物反应器悬浮培养技术高效扩增血清4型禽腺病毒，并研制出高效价血清4型禽腺病毒灭活苗。

一种基于悬浮培养技术的血清4型禽腺病毒灭活苗，所述的灭活苗的抗原为通过悬浮培养方法获得的效价不低于10⁹TCID₅₀/ml的灭活后的血清4型禽腺病毒。

所述的灭活苗的抗原通过下述方法获得：将血清4型禽腺病毒接种于鸡肝细胞，利用激流式生物反应器扩增血清4型禽腺病毒；反应器转速为40r/min、200g载体初始细胞接种为1×109个、细胞生长液为10％FBS血清的DMEM/F12培养液、病毒感染及维持液为含2％FBS血清的DMEM/F12培养基、最适PH为7.0-7.2、病毒接种量MOI为0.1以及病毒收获时间为接种后96小时。

本发明还公开了一种制备高效价血清4型禽腺病毒灭活苗的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)血清4型禽腺病毒悬浮培养：将血清4型禽腺病毒接种于鸡肝细胞，利用激流式生物反应器扩增血清4型禽腺病毒；悬浮培养激流式生物反应器主要培养条件参数为：反应器转速为40r/min、200g载体初始细胞接种为1×10⁹个、细胞培养液为10％FBS血清的DMEM/F12培养液、病毒感染及维持液为含2％FBS血清的DMEM/F12培养基、最适PH为7.0-7.2、病毒接种量MOI为0.1以及病毒收获时间为接种后96小时；感染后96小时后收集病毒、分装，并测定病毒效价；

(2)血清4型禽腺病毒灭活苗制备：将以上扩增获得的血清4型禽腺病毒按终浓度0.1％的比例加入甲醛溶液，置37℃灭活24小时，并进行灭活及无菌检验；将灭活血清4型禽腺病毒稀释至4×10^7.0TCID₅₀/mL，按V/V为4％的比例，向灭活病毒液中加入灭菌吐温-80，并使吐温-80彻底溶解，获得水相；将3份油相导入乳化罐中，同时缓慢加入1份水相进行乳化，制成血清4型禽腺病毒灭活疫苗，分装。

血清4型禽腺病毒灭活苗免疫保护效果评价：将以上制备的灭活疫苗采用皮下接种方式免疫21日龄SPF鸡，并设立未免疫鸡；在免疫后21天采血分离血清，测定中和抗体水平。免疫后21天，通过胸部肌肉接种方式对免疫鸡进行100个LD50病毒量进行攻毒试验。攻毒后连续观察14日，统计免疫保护率。非免疫对照组鸡为100％死亡，观察期内发病鸡多表现精神沉郁、羽毛粗乱、食欲不振，剖检可见心包积液、肝脏病变等相关组织病变；免疫组鸡为100％保护，观察期内未见任何异常现象，剖检未见腺病毒相关组织病变。

本发明的有益效果体现在：通过悬浮培养技术，研制出高效价血清4型禽腺病毒灭活苗，该疫苗效价可达10⁹TCID₅₀/ml，是传统鸡胚疫苗效价的100倍。高效价血清4型禽腺病毒灭活苗的制备可大大降低疫苗的成本，提供疫苗免疫效果，具有很好的应用前景。

附图说明

图1：PCR扩增血清4型禽腺病毒特异性DNA片段

泳道1：PCR扩增产物；泳道M：1Kb DNA Ladder。

具体实施方式

血清4型禽腺病毒JH株:(梁广成,高巍,谢泉,张建军,邵红霞,秦爱建,叶建强.一株高致病性血清4型禽腺病毒的分离与鉴定.《中国家禽》,2016年,38(19),5-28.)。

本发明以血清4型禽腺病毒JH株为例来说明本发明的技术方案，不应理解为对本发明保护范围的限制。

实施例：

1、血清4型禽腺病毒JH株的分离鉴定：取疑似禽腺病毒感染的病死鸡的肝脏，研碎后用按1:5的比例加入PBS制成悬液；5000r/min离心15min，取上清液；加入青霉素和链霉素各 1000IU/ml，37℃反应30min；经0.45um微孔滤器过滤后，以0.2ml/胚的剂量，经尿囊腔接种8日龄SPF鸡胚，接种后96-120小时后收取尿囊液；－20℃保存。取尿囊液400μL于1.5mL指形管内，加入400μL细胞裂解液(50mmol/L Tris-HCl pH 8.0，20mmol/L EDTA pH 8.0，2％SDS和蛋白酶K)，充分混匀后放置56℃水浴锅作用4小时；加入400uLTris平衡酚，充分混匀后10000r/min离心10分钟，取上清液于另一1.5mL指形管；加入400μL酚：氯仿：异戊醇，充分混匀后10000r/min离心5分钟，取上清液于另一1.5mL指形管；加入800μL无水乙醇，颠倒混匀后放入-20℃孵育30分钟，12000r/min离心15分钟，弃尽上清液；室温自然干燥后向沉淀加入30μL灭菌超纯水和2uLRNA酶，充分溶解后，即得病毒基因组，置-20℃备用。取2μL提取的病毒DNA作为模板,利用特异性引物进行PCR扩增。

(上游引物：5’-AATTTCGACCCCATGACGCGCCAGG-3’SEQ ID NO.1；

下游引物：5’-TGGCGAAAGGCGTACGGAAGTAAGC-3’SEQ ID NO.2)

PCR扩增反应体系为：模板1μL，5×Buffer10uL，10mM dNTP Mix 1μL，上游引物为10μmol 2uL，下游引物为10μmol 2uL，高保真酶1μL，加入灭菌超纯水至50μL。PCR扩增反应循环参数为：95℃预变性4分钟，随后进行30个循环(95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟)，72℃延伸10分钟。PCR结束后，PCR产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳分析(如图1所示)。切下PCR特异性产物片段送至南京金斯瑞公司进行序列分析。

2、血清4型禽腺病毒悬浮培养：利用激流式生物反应器扩增血清4型禽腺病毒。悬浮培养激流式生物反应器主要培养条件参数为反应器转速为40r/min、溶氧值不低于50％，200g载体初始细胞接种为1×10⁹个、细胞培养液为10％FBS血清的DMEM/F12培养液、病毒感染及维持液为含2％FBS血清的DMEM/F12培养基、最适PH为7.0-7.2、病毒接种量MOI为0.1以及病毒收获时间为接种后96小时。简要步骤如下：接种鸡肝细胞后，每隔24h取样测糖耗。当残糖量低于1.5g/L，定量补充葡萄糖或进行换液。当细胞生长6天后进行病毒的接种。通过激流袋将灌注袋及激流袋的细胞培养液全部排出，然后在激流袋中加入6L含200ml胎牛血清的DMEM/F12维持液，在灌注袋中接入4L不含血清的4型禽腺病毒(MOI为0.1TCID₅₀)DMEM/F12，吸附2h后，开始循环培养。在感染后96小时，收集病毒上清、分装，并测定病毒效价。结果显示通过悬浮培养扩增的三批血清4型禽腺病毒效价分别达到10^9.16，10^9.25以及10^9.0TCID₅₀/ml(如表1)。

3、血清4型禽腺病毒灭活苗制备：将以上扩增获得的血清4型禽腺病毒按终浓度0.1％的比例加入甲醛溶液，置37℃灭活24小时。每份灭活样接种10日龄SPF鸡胚10枚进行灭活及无菌检验，并盲传1代后，鸡胚均存活，见表1。将灭活的血清4型禽腺病毒稀释至4×10^7.0TCID₅₀/mL，按V/V为4％的比例，向灭活病毒液中加入灭菌冷却后的吐温-80，边加边 搅拌，使吐温-80彻底溶解后即为水相。并取注射用白油94份，加入6份司本，混匀后搅拌至透明，121℃高压灭菌30分钟，冷却后制备成油相。将3份油相导入乳化罐中，开动电机，缓慢搅拌，同时缓慢加入1份水相。通过4000转/分剪切乳化，使油相和水相以3:1的比例进行乳化。乳化结束后，取样10mL疫苗加入离心管中，以3000rpm离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5mL，即为灭活疫苗。

4、血清4型禽腺病毒灭活苗免疫保护效果评价：将以上制备的灭活疫苗采用皮下接种方式免疫21日龄SPF鸡，0.3mL/只，10只/组，并设立未免疫鸡；在免疫后21天采血分离血清，测定中和抗体水平。中和抗体水平测定简要步骤如下：将血清作2倍系列倍比稀释后，取2^-3～2^-910个梯度与100TCID₅₀/0.1mL的标准抗原各100μL，37℃作用1小时后接种鸡肝细胞，同时设阳性对照孔和正常细胞对照孔，6孔/组。置37℃、含5％CO2培养箱中培养，连续观察5日，记录病变孔数，根据Reed-Muench法计算各血清的抗禽腺病毒中和抗体效价。在免疫后21天，通过胸部肌肉接种方式对免疫鸡进行100个LD50病毒量进行攻毒试验。攻毒后连续观察14日，统计免疫免疫保护率。中和抗体检测结果显示，免疫组鸡于免疫后21天，1501、1502和1503三个批次疫苗免疫组中和抗体效价分别为1:110.4、1:92.4和1:97.1，对照组于免疫后21天中和抗体效价均不高于1:2(表2)。

表2免疫和攻毒结果

攻毒保护结果显示(表2)，免疫后21天攻毒，非免疫对照组鸡为100％死亡，观察期内发病鸡多表现精神沉郁、羽毛粗乱、食欲不振，剖检可见心包积液、肝脏病变等相关组织病变；免疫组鸡为100％保护，观察期内未见任何异常现象，剖检未见腺病毒相关组织病变。

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<110> 扬州大学

国药集团扬州威克生物工程有限公司

福建圣维生物科技有限公司

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