本发明涉及用于防御胞内劳森菌、猪肺炎支原体和猪圆环病毒的疫苗。在这个意义上，保护是指疫苗至少提供由胞内劳森菌、猪肺炎支原体和猪圆环病毒引起的负面影响的降低，这样的负面影响为例如，组织损伤和/或临床体征，如，下降的体重增加，腹泻，咳嗽，打喷嚏等。本发明还涉及包含第一个容器、一个或多个其他容器和说明书的试剂盒，所述第一个容器中含有非活性的胞内劳森菌抗原，一个或多个其他容器中含有猪肺炎支原体和猪圆环病毒抗原，说明书用于混合胞内劳森菌、猪肺炎支原体和猪圆环病毒的抗原以配制一种适于全身接种的组合疫苗。许多动物(特别是猪)中的增生性肠病(PE或PPE，也称为肠炎或回肠炎)呈现出未成熟隐窝上皮细胞(特别是在末端回肠中)粘膜增生的临床体征和病理综合征。可能受影响的肠的其他部位包括空肠、盲肠和结肠。断奶和幼小的猪主要受到快速体重减轻和脱水的典型临床表现的影响。猪的普通临床疾病全世界普遍发生。该疾病一向与胞内曲状细菌的存在相关，目前已知为胞内劳森菌。由细菌病原体猪肺炎支原体引起的猪支原体性肺炎是广泛分布的猪慢性呼吸道疾病。尤其是幼仔猪易受这种非致命性疾病的攻击。地方性动物病肺炎是导致饲料转化差和生长受阻碍的慢性疾病。该疾病是高度传染性的，并且通常通过直接接触受感染呼吸道分泌物(例如，咳嗽/打喷嚏后的受感染液滴的形式)来传播。这种疾病问题最大的后果在于易受所有种类的呼吸系统的继发性感染的影响。例如，在美国，估计99％的养猪场受到感染。认为猪圆环病毒与幼猪中观察到的断奶后多系统消耗综合征(PMWS)相关。在1991年，在加拿大，第一次遇到了这种疾病。1997年公开了临床体征和病理学，并包括进行性消瘦、呼吸困难、呼吸急促以及偶发性黄疸和黄疸。猪圆环病毒是小的(17nm)二十面非包膜病毒，其含有环状单链DNA基因组。PDNS(猪皮炎和肾病综合征)是养猪场的另一个主要问题，其与PMWS大约在相同的时间出现，并且其也涉及猪圆环病毒。PDNS的特征是伴有出血的红/棕圆形皮肤损伤，通常是在耳部、两肋、腿部和大腿。关于PE，对抗胞内劳森菌的口服接种疫苗已经显示出是一种在经济上有效的措施，以控制回肠炎和更好地开发猪的遗传生长潜能(PorcineProliferativeEnteropathyTechnicalManual3.0(猪增生性肠炎技术手册3.0)，2006年7月；获自BoehringerIngelheim)。此外，口服而非非肠道的疫苗接种将降低血液携带感染(如通过多次使用的针的PRRS)的传播以及注射部位反应的减少和保留在畜体内的针。与单独的疫苗接种相比，这将减少动物和人的应激、时间、劳动成本和精力(McOrist：“Ileitis-OnePathogen，SeveralDiseases”，IPVSIleitisSymposiuminHamburg，2004年6月28日)。通常了解减毒活疫苗方法的优势是免疫的功效通常是相对良好的，因为宿主的免疫系统以更“自然”的方式暴露于生物体的所有抗原物质。特别地，对于胞内细菌剂，如胞内劳森菌，由于基于完全的和合适的T细胞的免疫应答，认为活的减毒疫苗方法给接种疫苗的动物给予了最好利用的保护。这与用于胞内细菌的亚基或杀灭疫苗类型相关的不定的差的免疫性相反。这对于专性胞内细菌(如，胞内劳森菌或衣原体(Chlamydia))也特别如此，这些胞内细菌在粘膜内引起致病的感染。研究表明目标胞内细菌完整的活减毒形式最好递送至靶粘膜，它们需要作为完整的活细菌形式，以在靶粘膜中产生完全保护性的免疫应答，而且与使用部分细菌成分相比，它们在免疫上也是较好的。一般的了解是需要口服给予对抗胞内劳森菌的疫苗(参见上文中提到的TechnicalManual3.0)。这是基于如下的事实：身体抵抗回肠炎的基础是小肠中的局部免疫力，这是细胞介导的免疫力和通过抗体(尤其是IgA)的局部防御的结果。根据目前的知识，血清抗体(IgG)不能给予任何保护，只是因为它们没有到达肠腔。已经在研究中证明了口服疫苗接种产生细胞介导的免疫力，以及在肠道中局部产生IgA(Murtaugh，见Agrar-undNutztierpraxisAktuell，Ausgabe9，Juni2004；和Hyland等，见VeterinaryImmunologyandImmunopathology102(2004)329-338)。相反，肌内给药没有产生保护。此外，紧次于对抗胞内细菌的成功疫苗必须诱导细胞介导的免疫力以及局部抗体的产生的一般性了解，本领域技术人员知道实际上仅有非常低百分比的口服摄入的抗原被肠上皮细胞吸收，并且胞内劳森菌掺入细胞中是通过细菌启动的活性过程。因此，灭活的疫苗将给肠提供不充足的免疫原性抗原(Haesebrouck等，见VeterinaryMicrobiology100(2004)255-268)。这是为什么认为只有减毒的活疫苗在肠细胞中诱导足够的细胞介导的保护(参见上文中提到的TechnicalManual3.0)。目前，市场上只有一种防御胞内劳森菌的疫苗，即，由BoehringerIngelheim销售的Ileitis。这种疫苗是真正的用于口服给药的活疫苗。迄今为止，现有技术中已经提出了胞内劳森菌的组合疫苗。然而，实际上这些组合中没有多少的功效得到了测试。这种情况的原因在于通常理解为抗原与胞内劳森菌抗原的组合只有当劳森菌抗原作为活(减毒)细胞提供时才能获得成功的保护。在这点上，我们参考WO2005/011731，其也提出了基于胞内劳森菌的所有种类的组合疫苗。然而，关于该专利申请的说明书和权利要求结构，受让人(BoehringerIngelheim)似乎确信只有当劳森菌抗原以活细胞形式存在时才能期望组合疫苗具有合理的成功机会。这对于WO2006/099561同样如此，受让人也是BoehringerIngelheim。实际上，基于普通常识，这是显而易见的想法。然而，活抗原的组合没有直接给出抗原和制造这样的活组合疫苗的困难性之间冲突的高可能性。本发明的目的是提供对抗胞内劳森菌，并且同时对抗一种或多种其他猪病原体的疫苗。为此，发明了包含组合的胞内劳森菌、猪肺炎支原体和猪圆环病毒的非活性抗原和药物学上可接受载体的疫苗。令人惊讶地，与长期以来怎样对抗胞内劳森菌和组合疫苗应当包含活胞内劳森菌抗原的一般性了解相反，发现了通过使用非活性胞内劳森菌抗原，结合来自猪肺炎支原体和猪圆环病毒的抗原，可以提供防御胞内劳森菌、猪肺炎支原体和猪圆环病毒的疫苗。通常，可以通过使用本领域已知的方法制造疫苗，这些方法基本上包括将抗原与载体混合。通常，将抗原与携带该抗原的介质混合，该介质常常被简单地称为载体或“药物学上可接受的载体”。这样的载体可以是任何溶剂、分散介质、敷料、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等，这些载体在生理上与靶动物相容并且是靶动物可接受的，例如，通过无菌制得。这样的携带介质的一些实例是水、盐水、磷酸盐缓冲的盐水、细菌培养物流体、葡萄糖、甘油、乙醇等，及其组合。它们可以提供液体、半固体和固体剂型，这取决于预期的给药方式。如通常所知的，携带介质的存在不是疫苗功效必需的，但可以明显简化抗原的剂量和给药。同样，疫苗的制造可以在工业环境中进行，而且，抗原可以就地(即，在兽医处、农场等)与其他疫苗成分混合，例如，在实际给药于动物之前(即刻)进行混合。在疫苗中，抗原应当以免疫有效量存在，即，能够刺激靶动物的免疫系统足以至少降低用野生型微生物激发后接种的不利作用的含量。任选地，可以加入其他物质，如佐剂、稳定剂、粘度调节剂或其他成分，这取决于打算的用途或需要的疫苗特性。在一个实施方案中，疫苗是适于全身给药的形式。令申请人惊讶的是发现了全身性给药根据本发明的组合疫苗时，即，以达到身体循环系统(包括心血管和淋巴系统)的方式，可以诱导对抗胞内劳森菌的保护，这种保护与使用(单种)活疫苗Ileitis(根据相应的说明书给药)提供的保护相当或甚至有提高，因此影响作为整体的身体，而不是特定部位，如胃肠道。例如，可以通过将抗原给予肌肉组织中(肌内)、真皮中(皮内)、皮肤下(皮下)、粘膜下(膜下)、静脉中(静脉内)等来进行全身给药。对于全身性疫苗接种，许多形式是合适的，特别是液体制剂(含有溶解的、乳化的或悬浮的抗原)，以及固体制剂，如植入物或介质形式，如用于抗原悬浮于液体中的固体载体。全身性疫苗接种，特别是非肠道疫苗接种(即，不通过消化道)，和用于全身性疫苗接种的合适疫苗(物理)形式已经知道有200多年了。该实施方案的优势在于可以使用目前对于给药猪肺炎支原体或猪圆环病毒抗原标准的相同给药方式，即，非肠道，特别是通过肌内或皮内注射(在后一种情况中，通常是无针的)。在一个实施方案中，从含有碳水化合物的组合物获得非活性的胞内劳森菌抗原，该碳水化合物在活的胞内劳森菌中也能找到，与这些细胞的外细胞膜相连。出乎意料地，通过在组合疫苗中使用胞内劳森菌细胞的含碳水化合物部分(即，含有活胞内劳森菌细胞中存在的碳水化合物的组合物)，可以提供对抗PE的良好保护。注意到为了配制疫苗，可以使用直接获自胞内劳森菌细胞的含碳水化合物组合物，也可以使用源自其的组合物，如原始组合物或提取物的稀释物或浓缩物，一种或多种纯化成分等。注意到已经报道了胞内劳森菌细胞的亚基作为疫苗中的抗原，用于保护以对抗这种细菌。然而，这些主要是重组蛋白，并且迄今为止没有一个证明了能够提供良好的保护。还注意到含有碳水化合物的组合物从Kroll等是已知的(ClinicalandDiagnosticLaboratoryImmunology，2005年6月，693-699)，其中该碳水化合物在活的胞内劳森菌中也能找到，与这些细胞的外细胞膜相连。然而，这种组合物是用于诊断的。出于如上所述的原因，尚未测得其为保护性抗原。在一个实施方案中，含有碳水化合物的组合物是由胞内劳森菌细菌的杀灭产生的材料。已经发现了非常方便的提供用于根据本发明使用的碳水化合物的方式是简单地杀灭胞内劳森菌细胞并使用由此产生的材料作为碳水化合物的来源。从活细胞提取碳水化合物在理论上也是可行的(类似于通过除去细胞壁形成活的形骸细胞)，但需要更精密复杂的并因此更昂贵的技术。该材料可以作为整体使用，例如，胞内劳森菌细胞的全细胞悬浮液或裂解物，或可以从该材料中纯化或甚至分离出碳水化合物。可以通过使用相对简单的本领域已知的技术来进行这种方法。在优选的实施方案中，含有碳水化合物的组合物含有杀灭的胞内劳森菌细菌的完整细胞。已经证明了这是最方便用于提供碳水化合物作为疫苗中的抗原的方式。此外，甚至可进一步提高疫苗的功效，可能是因为这种将抗原给予靶动物的免疫系统的方式可更好地模拟碳水化合物的天然环境。在一个实施方案中，疫苗包含水包油型佐剂，其含有亚微米大小的油滴。通常，佐剂是非特异性的免疫刺激剂。原则上，可以将在免疫事件的级联中能够促进或扩大特定的过程并最终导致更好免疫应答(即，对抗原的综合身体应答，特别是通过淋巴细胞介导的应答，并且通常涉及特定抗体或之前敏化的淋巴细胞对抗原的识别)的每种物质定义为佐剂。已经显示出使用含有亚微米大小油滴的水包油型佐剂可提供非常好的对抗胞内劳森菌的保护。实际上，水包油型佐剂这样结合非活性抗原的应用是常见的。然而，通常知道当油滴直径大时获得最好的免疫刺激特性。特别是，当认为安全性是重要问题时，特别地使用具有1微米以下直径的油滴。在这种情况下，可以使用小的液滴，因为已知这些引起较少的组织损伤、临床病征等。然而，对于通过全身性疫苗接种获得肠道相关疾病保护(如本发明中的情况)来说，可以选择大的液滴，因为期望免疫应答必须得到显著加强。相反，我们发现了对于对抗胞内劳森菌的保护，在组合物中使用小的油滴可提供非常好的结果。在更优选的实施方案中，佐剂包含生物可降解油的液滴和矿物油的液滴，生物可降解油的液滴的平均大小不同于矿物油的液滴的平均大小。已经显示出使用生物可降解油和矿物油的混合物对于功效和安全性提供了非常好的结果。除此之外，组合物的稳定性非常高，这是重要的经济优势。已经证明了稳定性是非常好的，特别是当生物可降解油液滴或矿物油液滴的平均(容重)大小小于500nm(优选大约400nm)时。本发明还涉及包含第一个容器、一个或多个其他容器和说明书的试剂盒，所述第一个容器中含有非活性的胞内劳森菌抗原，一个或多个其他容器中含有猪肺炎支原体和猪圆环病毒抗原，说明书用于混合胞内劳森菌、猪肺炎支原体和猪圆环病毒的抗原以配制一种适于全身接种的组合疫苗。在这个实施方案中，在还含有其他抗原(如本领域所知的，其在一个容器中混合，或甚至存在于形成试剂盒内含物一部分的分开的容器中)的试剂盒中提供了分开的用于胞内劳森菌抗原的容器。该实施方案的优势在于劳森菌抗原可以防止与其他抗原的相互作用，直至就在疫苗给药之前。此外，因为抗原在分开的容器中，生产损耗较低。在一个实施方案中，猪肺炎支原体和猪圆环病毒抗原包含在一个容器中，配制于水包油型佐剂中。在这个实施方案中，可以恰在使用前将劳森菌抗原与其他的抗原混合。基于以下的实施例将进一步解释本发明。实施例1描述了获得基本上无蛋白质的含碳水化合物的组合物的方法以及使用该组合物制得的疫苗。实施例2描述了一个实验，其中将非活性的胞内劳森菌疫苗与目前市场上的疫苗和含有胞内劳森菌亚基蛋白的实验疫苗进行比较。实施例3描述了一个实验，其中将两种不同的包含非活性胞内劳森菌抗原的疫苗与目前市场上的活疫苗进行比较。实施例1在这个实施例中，描述了获得基本上无蛋白质的与胞内劳森菌细胞的外细胞膜相连的碳水化合物组合物的方法以及可以使用这种组合物制得的疫苗。通常，碳水化合物是含有碳、氢和氧的有机化合物，碳、氢和氧的比例通常为1:2:1。碳水化合物的实例是糖(糖类)、淀粉、纤维素和树胶。通常，它们作为动物膳食中的主要能源。胞内劳森菌是革兰氏阴性细菌，因此其含有不完全是由磷脂和蛋白质构成的外膜，而是外膜还含有碳水化合物，特别是多糖(通常是如脂多糖、脂寡糖或甚至非脂多糖这样的多糖)。用于疫苗制备的碳水化合物级分取二十微升含有浓度为3.7E8(＝3.7×108)细胞/ml的胞内劳森菌细胞的缓冲水(0.04MPBS，磷酸盐缓冲的盐水)。通过将它们在100℃下保持10分钟来裂解细胞。将0.04MPBS中的蛋白酶K(10mg/ml)加入，至1.7mg/ml的终浓度。将该混合物在60℃下培养60分钟，以降解所有蛋白质并保持碳水化合物完整。随后，将混合物在100℃下培养10分钟，以灭活蛋白酶K。将所得到的材料在2-8℃下储存，直至进一步使用，所得到的材料是含有碳水化合物的组合物，特别是含有存在于活的胞内劳森菌细菌中的与其外细胞膜相连的碳水化合物(参见以下的段落)。将组合物配制于Diluvacforte佐剂中。这种佐剂(参阅EP0382271)包括7.5％重量的具有大约400nm的平均容重大小的醋酸维生素E液滴，液滴悬浮于水中，并用0.5％重量的吐温80(聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯)稳定。每微菌升疫苗含有从1.2E8胞内劳森菌细胞提取的材料。劳森菌碳水化合物抗原的免疫沉淀根据标准程序，在室温下，用饱和的Na2SO4，将两批对抗胞内劳森菌完整细胞产生的单克隆抗体(MoAb’s)进行沉淀。通过离心(10.000g，10分钟)将沉淀物沉淀。用20％Na2SO4洗涤沉淀物，并重悬浮于0.04MPBS中。根据制造商的手册，用0.1MNaPO4(pH7.4)预先洗涤酪氨酰(Tylosyl)激活的Dynal珠粒(DynaBeads，DK)。从每批MoAb’s取出140μg，并加入到2E8预先洗涤过的珠粒中，并在37℃下培养过夜。通过离心沉淀珠粒并通过抽吸上清液来除去未结合的MoAb’s。分光光度计测量显示出20至35％加入的MoAb’s已经与珠粒结合。将0.04MPBS中的两批1ml胞内劳森菌细胞(3.7E8/ml)超声波处理1分钟。将所得到的细胞裂解物加入到酪氨酰激活的珠粒-单克隆复合物中，并在4℃下培养过夜。用0.1MNaPO4(pH7.4)将酪氨酰激活的珠粒-单克隆复合物洗涤三次。以连续的方式，将珠粒在0.5ml的0.04MPBS中的8M脲(E1)；0.5ml10mM甘氨酸pH2.5(E2)；和0.5ml50mMHCl(E3)中洗涤来洗脱结合的化合物。洗脱后，用100μl和200μl1MTris/HCl(pH8.0)中和E2和E3。从每个步骤取样并装载于SDS-PAGE凝胶上。使用考马斯亮蓝(CBB)和银染将凝胶染色或弄污。使用如上所述的相同MoAb’s来产生斑点。凝胶和斑点的观察显示出MoAb’s识别具有21和24kDa表观分子量的条带，这些条带在CBB凝胶上未看到，但在银染的凝胶上看到了。此外，确定了结合MoAb’s的细胞级分是蛋白酶K抗性的。因此，基于这些结果，可以推断出该级分含有碳水化合物(即，所有蛋白被裂解了，并且超声波处理的DNA级分在银染中没有作为清晰的条带显示出来)，并且碳水化合物与胞内劳森菌的外细胞膜(即：对抗这种级分产生的MoAb’s也识别完整的胞内劳森菌细胞)相连(即，形成其的一部分或与其结合)。已知胞内劳森菌是革兰氏阴性细菌的事实，因此认为碳水化合物组合物包括多糖。实施例2进行该实施例来测试在疫苗中配制碳水化合物抗原的方便方法，即，通过杀灭的完整细胞(也称为菌苗)。作为对照，使用了可购得的疫苗ileitis和包含蛋白质亚基的实验亚基疫苗。接着，将未接种疫苗的动物用作对照。实施例2的实验设计如下制得灭活的完整细胞疫苗。收集源自患有PPE的猪的肠的活胞内劳森菌细胞。用0.01％BPL(β-丙内酯)将细胞灭活。所得到的材料，在本发明的意义上固有地是非活性的含有碳水化合物的组合物(特别是因为它含有存在于活胞内劳森菌细菌中的与外细胞膜相连的碳水化合物)，将其以大约2.8×108细胞/ml疫苗的浓度配制于Diluvacforte佐剂中(参见实施例1)。亚基疫苗含有重组P1/2和P4，如从EP1219711中所知的(分别为19/21和37kDa蛋白)，并且该重组蛋白通过基因5074、4320和5464来表达，如WO2005/070958中所述。将蛋白质配制于Diluvacforte佐剂中。疫苗含有大约50μg每种蛋白/微升。使用了四十六周大的SPF猪。将猪分成4组，每组十头猪。根据制造商的说明，组1口服接种一次(T＝0时)2ml“ileitis”(BoehringerIngelheim)。组2和3肌内接种两次(在T＝0和T＝4周时)，分别接种2ml如上所述的灭活劳森菌完整细胞疫苗和重组亚基组合疫苗。组4留着作为未接种的对照。在T＝6周时，所有的猪用均质的胞内劳森菌感染的粘膜口服激发。随后，每日观察所有猪的猪增生性肠病(PPE)的临床病征。在激发之前和之后，以规则的时间，从猪取样血清血液(用于血清学)和粪便(用于PCR)。在T＝9周时，将所有猪安乐死并进行尸检。获取回肠的组织学样品并通过显微镜进行检查。从感染的粘膜制备激发接种物：将500克感染的粘膜(从感染的肠刮下来的)融化并与500ml生理盐水混合。将该混合物在通用匀浆器中在冰上全速均质一分钟。在T＝6周时，用20ml激发接种物口服激发所有猪。在T＝0、4、6、7、8和9w时，获取每只猪的粪便样品(克含量)和血清血样并冷冻储存直至测试。在定量PCR(Q-PCR)中测试粪便样品并表示为以皮克(pg)计的量的对数。在常用的IFT测试(检测对抗血清中完整胞内劳森菌细菌的抗体的免疫荧光抗体测试)中测试血清样品。对于组织学评分，获取回肠的相关样品，在4％缓冲的福尔马林中固定，常规包埋并切片。用苏木精-曙红(HE染色)和使用抗胞内劳森菌单克隆抗体的免疫组织化学染色(IHC染色)将这些切片染色。通过显微镜检查这些切片。组织学评分如下：HE染色：IHC染色：单独记录每只猪的所有数据。按照激发后不同参数的阳性动物的平均值来计算每组的分数。使用非参数Mann-WhitneyU测试来评价统计学显著性(双侧检验的并将显著性水平设定为0.05)。实施例2的结果血清学在第一次接种之前，测试IFT抗体滴度时，所有猪是血清反应阴性的。用完整细胞菌苗(组2)接种疫苗后，猪产生了高IFT抗体滴度，而对照和接种亚基疫苗的猪仍然是阴性的，直至激发(表1)。接种Enterisol的猪(组1)中的两只产生了中等的IFT滴度，而该组中的所有其他猪保持血清反应阴性。激发后，所有猪产生了高IFT抗体滴度。表1中描述了平均结果(使用所用的稀释度，1.0是下侧的检测水平)。表1.接种和激发后猪血清的平均IFT抗体滴度(2log)组T＝0周T＝4周T＝6周T＝9周1<1.01.11.7>11.42<1.03.7>11.8>12.03<1.0<1.0<1.0>11.64<1.0<1.0<1.0>12.0粪便样品的实时PCR在激发之前，所有粪便样品是阴性的。激发后，在所有组中发现了阳性反应。组1(p＝0.02)、组2(p＝0.01)和组3(p＝0.03)与对照相比较，具有明显较低的泄出水平。表2中给出了激发后的概述。表2.接种和激发后粪便样品的PCR平均结果(logpg)组T＝6周T＝7周T＝8周T＝9周激发后总计101.33.61.86.3200.82.81.95.5300.53.82.05.9400.84.94.910.0组织学分数组2具有最低的组织学HE分数(p＝0.05)、IHC分数(p＝0.08)和总的组织学分数(p＝0.08)。其他组具有较高的分数，并且与对照组没有明显差异。参见表3。表3.回肠的平均组织学分数组HE分数IHC分数总分11.81.53.321.31.52.731.81.63.442.42.34.7关于实施例2的结论从结果可以推断出非活性胞内劳森菌完整细胞疫苗的全身性给药诱导了至少部分保护，该疫苗固有地含有还发现与活胞内劳森菌细胞的外膜相连的碳水化合物。与对照相比，研究的所有参数和组织学分数明显或接近明显地更好。实施例3进行该实验来测试疫苗，该疫苗基本上不含蛋白质，并包含作为抗原的含碳水化合物组合物。除了杀灭的胞内劳森菌的完整细胞外，测试的第二种疫苗还含有猪肺炎支原体和猪圆环病毒的抗原(“组合”疫苗)。作为对照，使用了可购得的回肠炎疫苗。接着，将未接种的动物用作第二个对照。实施例3的实验设计按照实施例1中所述的，获得基于基本上无蛋白质的含碳水化合物组合物的疫苗。实验组合疫苗含有水平为1.7×108细胞/ml的灭活胞内劳森菌完整细胞抗原(参见实施例2，所用的提供灭活细菌的方法)。接着，其含有灭活的PCV-2抗原(20μgORF2编码的PCV2蛋白/ml；蛋白是在杆状病毒表达系统中表达的，如本领域所知的，例如，如WO2007/028823中所述的)和灭活的猪肺炎支原体抗原(如从可购得的疫苗Porcilis得知的相同剂量的相同抗原，获自Intervet，Boxmeer，荷兰)。将抗原配制于双乳化佐剂“X”中。这种佐剂是5体积份佐剂“A”和1体积份佐剂“B”的混合物。佐剂“A”由具有大约1μm的平均(容重)大小的矿物油滴组成，用水中的吐温80稳定。佐剂“A”包含25重量％的矿物油和1重量％的吐温，剩余为水。佐剂“B”由具有400nm的大致平均(容重)大小的生物可降解醋酸维生素E滴组成，也是用吐温80稳定。佐剂“B”包含15重量％的醋酸维生素E和6重量％的吐温80，剩余是水。使用了六十四只3天大的SPF仔猪。将猪分成四组14头仔猪和一组8头仔猪(组4)。组1在3天大时静脉内接种2ml组合疫苗，接着在25天大时第二次接种。组2在25天大时肌内接种一次2ml组合疫苗。根据处方，组3在25天大时口服接种2mlileitis(BoehringerIngelheim)。组4在3天和25天大时肌内接种2ml非蛋白碳水化合物疫苗。组5留下未接种，作为激发对照组。在46天大时，用均质的感染的粘膜口服激发所有的猪。随后，每日观察所有猪的猪增生性肠病(PPE)的临床病征。在激发之前和之后的规则时间，从猪获取血清血液和粪便样品，分别用于血清学和PCR。在68天大时，将所有猪安乐死并进行尸检。对回肠进行组织学检查。实验设计中的其他情况与实施例2中所述的相同，除非另外指出。实施例3的结果血清学1-劳森菌在第一次接种前，所有猪对IFT劳森菌抗体滴定是血清反应阴性的。用组合疫苗(组1和组2)和非蛋白质碳水化合物疫苗(组4)接种后，许多猪产生了IFT抗体滴度，而对照和接种Enterisol的猪仍然是血清反应阴性的，直至激发。激发后，所有猪(除了Enterisol组中的两只)产生了IFT抗体滴定。对于所获得的平均值的概述，参见表4(与实施例2比较时，由于较高的稀释，检测水平为4.0)。表4.接种和激发后猪血清的平均IFT劳森菌抗体滴度(2log)组T＝3天T＝25天T＝46天T＝67天1<4.0<4.07.910.32<4.0<4.04.89.83<4.0<4.0<4.08.54<4.0<4.06.910.65<4.0<4.0<4.09.02-猪肺炎支原体对于Mhyo，在实验开始时以及加强那天(25天大)，所有猪对Mhyo是血清反应阴性的。加强接种后，组1产生了高Mhyo抗体滴度，与用可购得的引发-加强疫苗Porcilis获得的那些水平相同。在以下的表5中给出了结果。显然，在这些情况(肌内给药)下，只有当给予加强疫苗接种时，在46天时的抗体滴度才高于检测水平(对于所用的方法为6.0)。然而，已知使用Mhyo抗原的单次短暂接种可以提供足够的保护，特别是当皮内给药时(参见，例如，WO2007/103042)。表5.接种后猪血清的平均IFTMhyo抗体滴度(2log)组T＝3天T＝25天T＝46天1低于检测水平低于检测水平8.32低于检测水平低于检测水平低于检测水平5低于检测水平低于检测水平低于检测水平3-猪圆环病毒对于PCV，3天大的仔猪具有高的母猪衍生的PCV抗体滴度。在强化那天(25天大)，与组2和对照组相比，接种的猪(组1)具有相似的滴度。与3天大的滴度相比，25天大时的PCV滴度略低。接种后，25天大时，组1(在第3天和25天时接种2次)和组2(25天时接种一次)的滴度保持在高水平，而对照仔猪显示出正常的母猪衍生抗体的降低。所获得的PCV滴度与用含有相同抗原的单次疫苗(例如，Intervet’sCircumventPCV，该疫苗提供非常好的对抗PCV的保护)获得的滴度相当。对于平均值的综述，参见下表。表6.接种后猪血清的平均IFTPCV抗体滴度(2log)组T＝3天T＝25天T＝46天111.59.610.1212.19.510.8510.99.17.0粪便样品的实时PCR激发后三周，与组3和组5相比，组1、组2和组4的猪在其粪便中具有较少的劳森菌(DNA)。仅有组1和组3(Enterisol)之间以及组4和组3之间的差异是统计学显著的(p<0.05，Mann-WhitneyU测试)。对于平均结果，参见表7。表7.接种和激发后粪便样品的平均PCR结果(logpg)组平均值11.021.232.040.651.8组织学分数与组3和组5的组织学分数相比，组1和组4的明显较低(p<0.05，双边Mann-WhitneyU测试(参见表8))。证实患有PPE的猪的数量为：组1，2/13，组2，6/12，组3，12/14，组4，2/7和对照组5，12/14。与组3和组5相比，组1和组4具有明显较低的PPE发病率(p<0.05，双边Fischers’精确测试)。表8.回肠的平均组织学分数组HE分数IHC分数总分10.40.61.020.70.71.431.61.43.040.40.40.851.91.53.4实施例3的结论从结果可以推断出碳水化合物外细胞膜抗原给予了相对良好的对抗回肠炎的保护。还发现了完整劳森菌细胞菌苗是在对抗回肠炎的疫苗中提供碳水化合物抗原的好方法。此外，已知的情况是：对于Mhyo和PCV抗体的滴度，组合疫苗提供了与用可购得的适于对抗这些微生物的单种疫苗可获得的水平相当的水平，已经证明了含有非活性胞内劳森菌抗原并结合Mhyo和PCV抗原的组合疫苗适于对抗胞内劳森菌以及猪肺炎支原体和猪圆环病毒。当前第1页1 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