一种罗非鱼源无乳链球菌荚膜多糖疫苗的制备方法及其应用与流程

本发明属于疫苗学技术领域。更具体地，涉及一种罗非鱼源无乳链球菌荚膜多糖疫苗的制备方法及其应用

背景技术：

无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)是一种人畜鱼共患革兰氏阳性菌，能引起新生儿脑膜炎、牛乳腺炎和鱼类脑膜脑炎。无乳链球菌能感染多种海水、淡水鱼类并引起死亡，给我国乃至世界水产养殖业造成重大经济损失。因此，研究无乳链球菌相关的防治技术具有很重要的现实意义。

目前，在国内已有一些与链球菌疫苗相关的专利。申请号：200580013779.X，发明名称：无乳链球菌疫苗公布了一种β溶血性无乳链球菌的完整灭活细胞和该菌培养物的浓缩提取物制备的组合疫苗通过注射和浸泡两种方式对罗非鱼抗无乳链球菌的免疫保护效果分别为80％和35％。申请号：200780025577.6，发明名称：抗链球菌的联合疫苗公布了一种联合疫苗，当难辨链球菌和海豚链球菌在疫苗制剂中的比例(基于细胞∶细胞)为20∶1或40∶1时，可得到抗难辨链球菌的64％的相对保护率和抗海豚链球菌的71％的相对保护率。申请号：201080047156.5，发明名称：链球菌组合疫苗，公布了一种组合疫苗，包含无乳链球菌生物型1血清型Ia细胞和血清型III细胞的组合疫苗提供针对罗非鱼抗无乳链球菌生物型1血清型Ia的88.9％保护率和抗罗非鱼无乳链球菌生物型1血清型III的92％的保护率。申请号：201010207289.6，发明名称：罗非鱼二联链球菌灭活疫苗的制备方法，公布了一种罗非鱼无乳链球菌和海豚链球菌等体积混合二联疫苗的制备过程。申请号：201210337267.0，发明名称：一种预防罗非鱼链球菌病的疫苗，公布了一种无乳链球菌全菌灭活疫苗通过浸泡、注射和口服免疫罗非鱼后最高分别能达到60％、90％和75％的免疫保护率。申请号：201410121138.7，申请名称：一种无乳链球菌的口服疫苗及其制备方法，构建一种表达无乳链球菌sip蛋白的重组减毒沙门氏菌，将其拌料投喂罗非鱼后最高可获得63％的抗无乳链球菌免疫保护率。

但是，以上公开使用的无乳链球菌疫苗均是单一或是二联全菌灭活疫苗，尚未出现荚膜多糖疫苗。荚膜多糖是细菌的保护性抗原和毒力因子，是细菌结构变化最少的表面抗原，具有较好的免疫原性，是最适宜做疫苗成分的靶抗原之一，纯化的荚膜多糖制备的疫苗具有较好的效果。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明旨在提供一种罗非鱼源无乳链球菌荚膜多糖疫苗的制备方法及其应用。

本发明提供的无乳链球菌荚膜多糖联合疫苗包含无乳链球菌荚膜多糖与蛋白载体的联合物，

所述的疫苗为液体制剂。

其中所述蛋白载体为破伤风类毒素。

本发明提供的无乳链球菌荚膜多糖联合疫苗其每一单位给药剂量的制剂中含有无乳链球菌荚膜多糖的量为5ug.

本发明中的无乳链球菌荚膜多糖，可通过以下制备工艺制备：

1)将无乳链球菌菌种接种于装有5mLBHI液体培养基的试管中，置于恒温培养摇床(28℃，160rpm)培养12h，以备扩大培养用；

2)将培养所得菌液5ml，接种于装有500ml BHI液体培养基的三角烧瓶中，在恒温培养摇床(28℃，160rpm)中振荡培养10h；

3)低温离心菌液，将菌体用PBS溶解并高压蒸汽灭菌；

4)离心灭菌后的溶液，取上清，并使用0.22um针头滤器过滤上清；

5)在过滤后的悬液中加入终浓度为1％的CTAB，充分搅拌后4℃静置过夜；

6)离心CTAB结合物，收集沉淀物，即为复合多糖；

7)将复合多糖溶入2mol/l氯化钙溶液中搅拌，充分溶解后离心取上清；

8)向上清溶液中加入两倍体积的80％乙醇，4℃静置2天；

9)离心收集沉淀，即为粗糖；

10)粗糖用无水乙醇洗涤后，溶入饱和乙酸钠中；

11)用酚：氯仿：异戊醇之比为25∶24∶1的溶液提蛋白5次；

12)装入透析袋内，去离子水透析2天，每12h换透析外液1次；

13)取出透析袋内液体，加入两倍体积无水乙醇，4℃静置2天；

14)离心液体，并将液体放入-80℃冰箱冻块；

15)冻干机冻干，即得荚膜多糖；

本发明使用的蛋白载体破伤风类毒素，从公司购买所得；

本发明提供的所述联合疫苗的制备方法，荚膜多糖和载体蛋白按质量比2∶1混合得到；

本发明的联合疫苗制剂，以破伤风类毒素作为无乳链球菌荚膜多糖的载体蛋白免疫鱼体，可唤起免疫系统对破伤风类毒素的回忆反应，从而得到较好的对无乳链球菌荚膜多糖的免疫反应；

本发明提供的无乳链球菌荚膜多糖联合疫苗经腹腔注射免疫罗非鱼后可激发罗非鱼机体产生抗无乳链球菌荚膜多糖的抗体。

本发明的另一个目的在于提供所述的联合疫苗在预防或治疗无乳链球菌诱发的疾病的疫苗中的应用。

本发明的荚膜多糖疫苗制备方法中荚膜多糖的提取是应用了化学试剂十六烷基三甲基溴化铵与多糖可以形成季胺络合物而沉淀多糖的原理，这种方法对多糖的针对性较高，纯化的效率较高，而且方法简便易行，应用的设备都为常规设备，操作简便适用，制备过程安全适于大规模生产应用。

上述方法制备得到的罗非鱼源无乳链球菌荚膜多糖疫苗，以及所述罗非鱼源无乳链球菌荚膜多糖疫苗在制备防治罗非鱼无乳链球菌病的药物或制剂方面的应用，也都应在本发明的保护范围之内。

附图说明

图1为荚膜多糖疫苗免疫罗非鱼后攻毒的存活曲线。横坐标为攻毒后天数；纵坐标为存活率。

图2为荚膜多糖疫苗Elisa检测血清抗体滴度；横坐标为初免后第2、4周的血清；纵坐标为抗体滴度，抗体滴度用产生阳性结果的最大稀释倍数表示。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明但不用来限制本发明的范围。

实施例1无乳链球菌荚膜多糖的制备

1、粗糖的提取

将无乳链球菌菌种接种于装有5mLBHI液体培养基的试管中，置于恒温培养摇床(28℃，160rpm)培养12h；将培养所得菌液5ml，接种于装有500ml BHI液体培养基的三角烧瓶中扩大培养，在恒温培养摇床(28℃，160rpm)中振荡培养10h；将培养好的细菌低温离心(4℃，4500rpm×15min)，弃上清收集细菌，用高压灭菌PBS(pH7.4)重悬菌体，并全部转移到1000ml容量瓶中，将菌悬液高压蒸汽灭菌(121℃，60min)；低温高速离心(4℃，4000rpm×30min)收集上清，将得到的沉淀再次高压蒸汽灭菌(121，60min)并低温高速离心收集上清，将两次得到的上清合并；为防止细菌生长以及过滤残留的细菌，使用0.22um针头滤器过滤上清；在过滤后的液体中加入终浓度为1％的CTAB，充分搅拌后4℃静置过夜；低温高速离心(4℃，11000rpm×10min)CTAB结合物，弃上清收集沉淀物，即为复合多糖；2mol/l氯化钙溶液中溶解复合多糖，充分溶解后低温高速离心(4℃，11000rpm×10min)离心收集上清；向上清溶液中加入两倍体积的80％乙醇，4℃静置2天；低温高速离心(4℃，11000rpm×5min)收集沉淀，即为粗糖。

2、精致多糖的提取

将收集到的粗糖用无水乙醇洗涤；将溶液溶入饱和乙酸钠中；用酚∶氯仿∶异戊醇体积之比为25∶24∶1的溶液抽提蛋白3次，每次低温高速离心(4℃，11000rpm×10min)收集上清；将上清所得装入透析袋，使用去离子水透析2天，每12h换透析外液1次；取出透析袋内液体，加入两倍体积无水乙醇，4℃静置2天；低温高速离心(4℃，11000rpm×10min)溶液，并将全部液体装入50ml离心管，在-80℃冰箱静置2天；使用冻干机冻干(2天)，即得荚膜多糖；所得多糖呈白色疏松状。

实施例2制备罗非鱼源无乳链球菌荚膜多糖疫苗

将实施例1获得的精制荚膜多糖用灭菌PBS稀释至100ug/ml，与破伤风类毒素按质量比2∶1混合均匀，制备成荚膜多糖疫苗。用于后续免疫。

实施例3罗非鱼源无乳链球菌荚膜多糖疫苗免疫试验

1、免疫保护实验

(1)尼罗罗非鱼购自广州市中心沟水产养殖发展有限公司，规格为30±5.0g，实验前暂养两周。

(2)免疫实验时，将罗非鱼随机分为2组，即PBS组、荚膜多糖疫苗组。每组15尾，每组设三个平行。

荚膜多糖组腹腔注射100μl与破伤风类毒素混合的荚膜多糖疫苗，PBS组注射100μl的灭菌PBS。

2、免疫程序

对罗非鱼进行两次免疫，初次免疫和加强免疫都使用荚膜多糖疫苗。

初次免疫时，每尾鱼腹腔注射100μl疫苗。两周后，每尾鱼腹腔注射100μl疫苗进行加强免疫。

初免后第2和4周，每组选3尾鱼采血，室温放置2h后，4℃、8000×rpm离心10min，收集上清，分装后-80℃保存，用于免疫指标的测定。

3、免疫保护率测定

(1)加强免疫两周后，用LD50剂量进行细菌攻毒实验，每尾鱼腹腔注射100ul无乳链球菌菌液(1×10⁸CFU/ml)。攻毒后，每天观察罗非鱼的状况，及时捞出死鱼，并记录14天内的死亡情况。连续观察14天，停止观察，实验结束。

根据下述公式计算罗非鱼的相对保护率(RPS)：

RPS＝(1-免疫组累积死亡率/对照组累积死亡率)×100％。

(2)攻毒后罗非鱼死亡情况如图1所示。

结果显示，初次免疫后第四周，用无乳链球菌进行攻毒。罗非鱼从攻毒后第1天开始就出现死亡，死亡主要集中在攻毒后的前3天。

此外，攻毒罗非鱼表现出一些患链球菌病的临床症状，如眼球突出且浑浊，离群独游和身体蜷曲等。

荚膜多糖蛋白作为抗罗非鱼无乳链球菌病疫苗用于注射免疫可获得69.48％±6.24％的免疫保护率。

4、Elisa检测抗体滴度

检测方法：

(1)包被：用包被液稀释重组CBP蛋白至200μg/ml，加入96孔酶标板内，100μl/孔，4℃包被过夜。

(2)洗涤：弃去96孔中的包被液，用低盐Buffer清洗5次，3min×5次，每次250μl/孔，移液枪轻轻吹打后，用200rpm的速度缓和振荡，拍干。

(3)封闭：加入1％BSA进行封闭，250μl/孔，22℃，封闭2h。按上述条件进行洗涤，拍干。

(4)一抗反应：将采集的罗非鱼抗血清用PBS按2倍逐级稀释(如稀释倍数：2、2²、2³、2⁴、2⁵、2⁶、2⁷、2⁸等)，按100μl/孔加入，22℃，孵育3h。按上述条件进行洗涤，拍干。

(5)二抗反应：将鼠抗鱼IgM用PBS稀释10倍，按100μl/孔加入，22℃，孵育2h；洗涤，拍干。

(6)三抗反应：将羊抗鼠IgG-HRP标记的抗体用PBS稀释5000倍，按100μl/孔加入，22℃孵育2h；洗涤，拍干。

(7)显色：将TMB底物溶液按100μl/孔加入，室温孵育；10min后，加入反应终止液50μl/孔终止反应。

(8)读数：将此96酶标板置于酶标仪上进行读数，测定450nm处的吸光值，即OD₄₅₀。

若试验组的读数大于或等于对照组的两倍，则记为阳性，否则为阴性。抗体滴度以阳性结果的最大稀释倍数表示。

结果如图2所示。免疫后血清抗体效价出现不同程度的增长，且在第四周达到峰值，抗体效价增长了32倍。