3MH‑EGCG纳米粒溶液体系及其制备方法与流程

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种EGCG的纳米粒溶液体系及其制备方法。

背景技术：

EGCG结构式如下：

EGCG(表没食子儿茶素没食子酸酯)是一种被广泛研究的具有潜在抗癌活性的化学成分，在肿瘤形成的各个阶段都有抑癌活性。绝大多数体外研究发现，EGCG在相对较高的浓度条件下才能作用于相关分子靶点及影响与疾病相关的细胞进程。在体外研究中EGCG的浓度相当高，比EGCG经口服进入人体后在血液中的浓度高出1-2个数量级；其次EGCG容易自身氧化，如EGCG在37℃下一天损失可达10％。因此，提高EGCG稳定性和生物利用度是将EGCG开发为防癌治癌制品的关键之一。

β-LG(β-乳球蛋白)由162个氨基酸残基组成，是一种高度结构化的蛋白质，它的三维结构在pH中性条件下为8条反平行链组成的β-桶状结构，在桶外含有一个3个转角的α螺旋。β-LG可以直接结合一些生物活性的分子，组装成纳米粒。

中国专利授权公告号CN103877588B是我们2014年的研究成果，公开了通过将EGCG与β-LG组装成EGCG-β-LG纳米粒溶液体系的制备方法，但这种纳米粒还是需要在高浓度的EGCG时才能有较好的抗癌活性，然而，高浓度的EGCG可导致肝毒性。

通过大量的实验筛选，我们发现3-巯基-1-己醇(3MH，是一种食品香料添加剂)与EGCG和β-LG可组装成纳米粒。由于3MH的结构与氨基酸有一定的相似性，可与β-LG较好结合，且其具有较强的还原性，可以保护EGCG免受氧化降解。

技术实现要素：

针对现有的EGCG不稳定性以及生物利用度低的现状，本发明目是提供一种能提高EGCG稳定性和生物利用度的一种EGCG纳米粒溶液体系并提供了该溶液体系的制备方法。

为实现发明目的，本发明采取如下的技术方案：

3MH-EGCG纳米粒溶液体系，含有由EGCG，3-巯基-1-己醇和β-乳球蛋白形成的3MH-EGCG-β-LG纳米粒，溶液为pH6.5-7.0缓冲溶液，所述的EGCG的浓度为0.5-1g/L，3-巯基-1-己醇的浓度为0.025-0.1g/L，β-乳球蛋白的浓度为1g/L。

进一步的，所述的EGCG的浓度为0.75g/L，3-巯基-1-己醇的浓度为0.05g/L，β-乳球蛋白的浓度为1g/L。

进一步的，所述的3MH-EGCG-β-LG纳米粒的平均粒径为15-45nm。

进一步的，所述的pH6.5-7.0缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、醋酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液或酒石酸缓冲溶液。

本发明EGCG纳米粒溶液体系通过在β-LG和EGCG形成纳米体系中加入3MH，利用3MH的较强还原性以及其结构本身与氨基酸结构类似的特性，以保护EGCG免受氧化降解，从而提高EGCG的作用效率，使EGCG在体内外的抗癌活性大大提高。

本发明的另一目的是提供3MH-EGCG纳米粒溶液体系的制备方法，采取如下的技术方案：

3MH-EGCG纳米粒溶液体系的制备方法，包括如下步骤：

1)将β-LG和3-巯基-1-己醇(3MH)溶于pH6.5-7.0缓冲溶液中，得β-LG浓度为1-3g/L、3MH浓度为0.05-0.2g/L的β-LG+3MH溶液；

2)将EGCG溶于pH6.5-7.0缓冲溶液或纯水中，得EGCG浓度为1-2g/L的EGCG溶液；

3)将β-LG+3MH溶液加热到70-90℃，然后加入EGCG溶液，超声混合均匀后得充分混合的溶液体系；

4)将上述充分混合的溶液体系冷却至4-25℃，得3MH-EGCG-β-LG纳米粒溶液体系。

作为本发明的EGCG纳米粒溶液体系的制备方法的改进点：

作为优选，所述步骤1)中β-LG浓度为2g/L、3MH浓度为0.1g/L。

作为优选，所述步骤2)中EGCG浓度为1.5g/L。

作为优选，所述步骤3)中加热的温度为75℃。

作为优选，所述EGCG、3MH与β-LG的浓度比值为15:1:20。

作为优选，所述的pH6.5-7.0缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液。

本发明EGCG纳米粒溶液体系的制备方法通过热效应使β-LG结构的二聚体分离形成单体，3MH、EGCG与蛋白肽链上的基团之间相互作用后蛋白在氢键和疏水作用下发生聚集形成纳米颗粒。

附图说明

图1 3MH-EGCG-β-LG纳米粒和EGCG-β-LG纳米粒37℃氧化降解观察图。

此图像为实施例1制备的3MH-EGCG-β-LG纳米粒和对应的不添加3MH的EGCG-β-LG纳米粒。

图2 3MH-EGCG-β-LG纳米粒中的纳米粒的粒径、形态、抗氧化保持性、EGCG释放性。此图像为实施例1制备的纳米粒的TEM图像，从中可以看出纳米粒成较规则的球状，粒度较为均一，平均粒径35.2nm。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1、3MH-EGCG-β-LG纳米粒溶液体系的制备方法，依次进行以下步骤：

1)、2gβ-LG和0.1g 3MH溶于pH 6.5磷酸盐缓冲溶液1L中，室温下摇床以200rpm/min震荡过夜使其充分溶解，得β-LG+3MH溶液。

2)、1.5g EGCG溶于pH 6.5磷酸缓冲液1L中，得EGCG溶液。

3)、将步骤1)所得的β-LG+3MH溶液加热到75℃，然后加入步骤2)所得的EGCG溶液超声波震荡(FS-2000T超声波处理器，上海生析超声仪器有限公司)混合20秒钟，得充分混合的溶液；

4)、用水浴将上述充分混合的溶液冷却到25℃，即得3MH-EGCG-β-LG纳米粒溶液体系。

实施例1得到纳米粒平均粒径35.2nm、对癌细胞增殖抑制率60-80％，对小鼠肝癌细胞Hep G2移植瘤的抑制率为51.78％；而不添加3MH，采用上述相同的步骤，制备得到EGCG-β-LG纳米粒，其平均粒径34.7nm、对癌细胞增殖抑制率26-40％、对小鼠肝癌细胞Hep G2移植瘤的抑制率为34.58％。

实施例2、3MH-EGCG-β-LG纳米粒溶液体系的制备方法，依次进行以下步骤：

1)、2gβ-LG和0.2g 3MH溶于pH 6.5磷酸盐缓冲溶液1L中，室温下摇床以200rpm/min震荡过夜使其充分溶解；得β-LG+3MH溶液。

2)、2g EGCG溶于pH 6.5磷酸缓冲液1L中，得EGCG溶液。

3)、将步骤1)所得的β-LG+3MH溶液加热到75℃，然后加入步骤2)所得的EGCG溶液，超声波震荡(FS-2000T超声波处理器，上海生析超声仪器有限公司)混合20秒钟，得充分混合的；

4)、用水浴将上述充分混合的冷却到25℃，即得3MH-EGCG-β-LG纳米粒。

此纳米粒平均粒径33.6nm、对3种癌细胞增殖抑制率55-70％；而不添加3MH，采用上述相同的步骤，制备得到对应的EGCG-β-LG纳米粒平均粒径32.4nm、对3种癌细胞增殖抑制率22-28％。

实施例3、3MH-EGCG-β-LG纳米粒的制备方法，依次进行以下步骤：

1)、2gβ-LG和0.05g 3MH溶于pH 6.5磷酸盐缓冲溶液1L中，室温下摇床以200rpm/min震荡过夜使其充分溶解；得β-LG+3MH溶液。

2)、1g EGCG溶于pH 6.5磷酸缓冲液1L中，得EGCG溶液。

3)、将步骤1)所得的β-LG+3MH溶液加热到75℃，然后加入步骤2)所得的EGCG溶液超声波震荡(FS-2000T超声波处理器，上海生析超声仪器有限公司)混合20秒钟，得充分混合的；

4)、用水浴将上述充分混合的冷却到20℃，即得3MH-EGCG-β-LG纳米粒。

此纳米粒平均粒径30.1nm、对3种癌细胞增殖抑制率53-65％；而不添加3MH，采用上述相同的步骤，制备得到对应的EGCG-β-LG纳米粒平均粒径30.4nm、对3种癌细胞增殖抑制率18-26％。

实施例4、3MH-EGCG-β-LG纳米粒的制备方法，依次进行以下步骤：

1)、2gβ-LG和0.15g 3MH溶于pH 6.5磷酸盐缓冲溶液1L中，室温下摇床以200rpm/min震荡过夜使其充分溶解；得β-LG+3MH溶液。

2)、1.8g EGCG溶于pH 6.5磷酸缓冲液1L中，得EGCG溶液。

3)、将步骤1)所得的β-LG+3MH溶液加热到75℃，然后加入步骤2)所得的EGCG溶液超声波震荡(FS-2000T超声波处理器，上海生析超声仪器有限公司)混合20秒钟，得充分混合的；

4)、用水浴将上述充分混合的冷却到20℃，即得3MH-EGCG-β-LG纳米粒。

此纳米粒平均粒径28.6nm、对3种癌细胞增殖抑制率45-52％；而不添加3MH，采用上述相同的步骤，制备得到对应的EGCG-β-LG纳米粒平均粒径27.7nm、对3种癌细胞增殖抑制率12-24％。

试验1

将实施例1得到的3MH-EGCG-β-LG纳米粒溶液体系与EGCG-β-LG纳米粒溶液体系(对照品)在37℃时10天内进行氧化降解试验，结果显示实施例1得到的3MH-EGCG-β-LG纳米粒，37℃时10天内EGCG不会氧化降解，见图1。

对实施例2～实施例4做同样的试验，结果也显示3MH-EGCG-β-LG纳米粒，37℃时10天内EGCG不会氧化降解，图略。

试验2

将上述实施例1～实施例4所得的3MH-EGCG-β-LG纳米粒溶液体系与EGCG-β-LG纳米粒(对照)按细胞增殖抑制实验方法进行人黑色素癌细胞A375、小鼠肝癌细胞Hep G2和人食管癌细胞TE-1抑制测定。

药理实验显示：3MH-EGCG-β-LG纳米粒对癌细胞的抑制作用得到很大的提升，相对EGCG-β-LG纳米粒来说，3MH-EGCG-β-LG纳米粒对人黑色素癌细胞A375、小鼠肝癌细胞Hep G2和人食管癌细胞TE-1有更大的抑制增殖作用。

实验证实，本发明制备的3MH-EGCG-β-LG纳米粒比EGCG溶液对小鼠肝癌细胞Hep G2的抑制作用比EGCG-β-LG纳米粒可提高50％以上。

实施例1所得的3MH-EGCG-β-LG纳米粒中的纳米粒的粒径、形态、抗氧化保持性、EGCG释放性，经透射电子显微镜(TEM)、HPLC测定和DPPH测定等手段进行了测定，结果见图2。

实施例1～实施例4所得的3MH-EGCG-β-LG纳米粒对人黑色素癌细胞A375、小鼠肝癌细胞Hep G2和人食管癌细胞TE-1抑制活性见表1；实施例1对小鼠荷肝癌细胞Hep G2移植瘤抑制效果见表2。

表1EGCG纳米粒对癌细胞增殖抑制率

SL1：实施例1 3MH-EGCG-β-LG纳米粒，DYSL1：对应实施例1的EGCG-β-LG纳米粒

SL2：实施例2 3MH-EGCG-β-LG纳米粒，DYSL2：对应实施例1的EGCG-β-LG纳米粒

SL3：实施例3 3MH-EGCG-β-LG纳米粒，DYSL3：对应实施例1的EGCG-β-LG纳米粒

SL4：实施例4 3MH-EGCG-β-LG纳米粒，DYSL4：对应实施例1的EGCG-β-LG纳米粒

表2纳米粒对肝癌细胞Hep G2移植瘤的抑制作用

通过上述试验表明：用3MH、β-乳球蛋白与EGCG共组装成纳米粒可以提高EGCG的生物利用度，抑制肿瘤细胞生长的活性比同计量的EGCG-β-LG纳米粒提高50％以上。

一、细胞增殖抑制实验

(1)细胞培养：将人黑色素癌细胞A375、人肝癌细胞Hep G2和人食管癌细胞TE-1接种于含有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中，在37℃、5％CO2的CO2细胞培养箱中进行培养。每2-3天进行传代。取对数生长期细胞供实验使用。

(2)MTT法检测细胞抑制率：选择对数生长期的细胞，用移液枪轻轻重复吹打形成单细胞悬液，加入含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基，调整细胞密度为10⁵个/mL；每孔180ul接种于96孔板中并于CO2培养箱中培养24h；分为空白组(只加培养基)，EGCG对照组(EGCG溶液)，EGCG-β-LG纳米粒对照组和3MH-EGCG-β-LG纳米粒组。3组样品细胞培养液中EGCG终浓度均为50ug/mL；每个样品设6个复孔并培养48h；每孔加50ul 1×MTT液，继续放置4h，使MTT还原为甲臢(Formazan)；1000g离心5min并吸出培养液，每孔加150ul DMSO，平板摇床摇匀，使其紫色结晶充分溶解，用酶标仪在490nm波长测定吸光值(A)。根据以下公式计算细胞的增殖抑制率：

二、动物实验

本实验采用清洁级ICR雄性小鼠，体重为20±2g。在标准实验动物房(SYXK(浙)2009-0122)进行饲养，饲养条件为：环境温度为22±3℃，相对湿度为50±5％，12h/h光暗交替，自由进食饮水。

①荷瘤小鼠模型的建立

将人肝癌HepG2细胞株用无菌生理盐水调整密度为1×10⁷个/mL，采用腹腔注射的方式，将0.2mL HepG2细胞悬浮液接种到原代小鼠。待第8天小鼠出现明显腹水现象时，在无菌条件下，用一次性注射器抽取小鼠血性腹水5mL，加10倍体积的生理盐水洗涤两次。并用生理盐水稀释成细胞密度为1×10⁷个/mL的细胞悬浮液。按同样的操作，传代到第三代小鼠。经过三次传代，选取生长良好的接种过A375细胞的小鼠，用无菌一次性注射器抽取小鼠血性腹水5mL，在无菌条件下用生理盐水洗涤两次，并用生理盐水稀释成细胞密度为1×10⁷个/mL的细胞悬浮液。每只小鼠右腋窝皮下注射0.2mL A375细胞悬浮液，建立HepG2人肝癌肿瘤模型。

②动物分组及给药

取40只已建立HepG2肝癌肿瘤模型的雄性小鼠，随机分为4组并进行数字编号，第1和第3组腹腔给药EGCG-β-LG–纳米粒和3MH-EGCG-β-LG–纳米粒，给药剂量相当于EGCG 10mg/kg体重，第2组给同剂量的EGCG作为对照组，第4组只给等体积的生理盐水作为模型对照组。在建模的次日每只小鼠采用腹腔给药的方式给药，采用隔日给药，共计给药四次。停止给药次日断颈处死小鼠，摘取瘤块并称重。

③肿瘤抑制率计算

对比试验：

对比例1-1

将实施例1中的0.1g 3MH改成0.3g 3MH，即从而使3MH的浓度为0.3g/L。其余内容等同于实施例1。

对比例1-2

将实施例1步骤1)和步骤2)中的pH6.5磷酸盐缓冲溶液均改成pH5.5磷酸盐缓冲溶液，其余内容等同于实施例1。

对比例2-2

将实施例1步骤1)和步骤2)中的pH6.5磷酸盐缓冲溶液均改成pH8.0磷酸盐缓冲溶液，其余内容等同于实施例1。

对比例3-1

将实施例1的步骤1)pH 6.5磷酸盐缓冲溶液的用量由1L改成5L，从而使所得的β-LG溶液中β-LG浓度变为0.4g/L、3MH浓度变为0.02g/L，其余内容等同于实施例1。

对比例3-2

将实施例1的步骤1)pH 6.5磷酸盐缓冲溶液的用量由1L改成0.2L，从而使所得的β-LG溶液中β-LG浓度变为10g/L、3MH浓度变为0.5g/L，其余内容等同于实施例1。

对比例4-1

在实施例1的步骤3)中，将β-LG溶液加热到100℃，其余内容等同于实施例1。

对比例4-2

在实施例1的步骤3)中，将β-LG溶液加热到50℃，其余内容等同于实施例1。

以上所有对比例制备的3MH-EGCG-β-LG纳米粒溶液体系，按照上述实验2的方法进行检测，结果如表3所述。对比例试验表明，本专利的工艺参数是排它性的。

表3、对比例与实施例1纳米粒细胞增殖抑制率差异(3次测定结果单位平均值)

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。