解红细胞的上清液；
[0042] 4)用2倍体积的XR-I缓冲液洗涤在步骤1中用到的每体积的全血，漩涡振荡以完 全悬浮细胞；
[0043] 5)4°C下450g离心lOmin，并再次去掉上清；
[0044] 6)往成团的白细胞中加入XR-II溶解缓冲液/2 -巯基乙醇，漩涡振荡充分混匀。 500μ1以下的全血就加入400μ1XR-II溶解缓冲液，如果在步骤1中用到的是0. 5~ 1. 0ml的血液，则加650μ1XR-II溶解缓冲液。在加入XR-II溶解缓冲液之后，样品应保存 于一 70°C的条件下；
[0045] 7)加入等体积的70%乙醇，漩涡振荡混匀；
[0046] 8)把所有的样品（包括所有的沉淀）加到一个固定在一个2ml收集试管上的 Mu-Pu RNA分离柱上。10, 000g离心的15s，弃去流出液体；
[0047] 9)重复步骤7、8;
[0048] 10)用移液枪吸750 μ 1 RNA洗涤缓冲液I直接加到自旋柱上洗涤柱子。如上方法 离心并弃去2ml收集管；
[0049]11)把柱子装到提供的一干净的新2ml收集试管上，加入500 μ 1用乙醇稀释的 RNA洗涤缓冲液II，离心，弃去流出液，重复使用该收集试管；
[0050]12)加入400 μ1 Wash solution，14000g离心2min ;
[0051] 13)再用500μ1的RNA洗涤缓冲液II洗涤柱子，离心并弃去流出液。然后用一个 空的收集试管，极速离心空柱子lmin以甩干Mu-Pu柱基质；
[0052] 14)洗脱RNA。把柱子转移到一干净的1. 5ml离心管（试剂盒无提供）并用50~ 100μ1的DEPC-水（由试剂盒提供）洗脱RNA。确保加入的DEPC-水是直接加在柱基质上， 极速离心lmin;
[0053] 15)加入 100μ1Enzyme Incubation Buffer和 15μ1DNase I，14000g离心 lmin；
[0054] 16)将收集管中的溶液重新移入柱，室温放置15min;
[0055] 17)将收集到的RNA保存在_70°C冰箱中，待用。
[0056] 3、RNA样品的质量分析（NanoDroplOOO分光光度计）
[0057] NanoDroplOOO分光光度计检测RNA样品，RNA-seq测序的样品要求：0D260/0D280 为 1. 8-2. 2〇
[0058] 将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer检测RNA样品质量，在凝胶成像仪上观测、拍照，保存图像，一般认为 28S: 18S彡2可以初步判定总RNA质量较好。
[0059] 4、miRNA的提取和标记
[0060] 1)用Ambion公司的miRNAs抽提试剂盒抽提获得miRNA，具体操作按照相应说明 书。样品用T4RNA连接酶标记步骤依照Thomson的方法。miRNA标记方法大致如下：1. 4μg miRNA和 500ng5' -磷酸盐-胞啼啶-尿啼啶cy3_3'（Dharmacon，Chicago，USA)及 2 单 位T4RNAligase(NEB，Ipswich，USA)，于4°C孵育2小时。每份miRNA样品均设等量的相 应阴性对照。
[0061] 2)标记的RNA用0. 3M醋酸钠和2. 5倍体积的乙醇进行沉淀，再用15μ1 含3XSSC、0. 2%SDS和15%甲酰胺的杂交液重悬，所有的杂交重复两次，杂交用 LifterSlipTM(Erie，PAUSA)以保证杂交液在芯片和盖片之间均匀流动。
[0062] 3)将杂交室放在杂交仪BioMixerTMII上（CapitalBioCorp，Beijing，China)于 42 °C水浴过夜，用洗液洗两遍。
[0063] 5、miRNA芯片操作：
[0064] miRNA芯片，采用博奥生物有限公司的miRNA表达谱芯片（单通道芯片），按照说 明书的指示进行miRNA表达谱的检测。
[0065] 6、结果：
[0066] 分析miRNA芯片表达谱的检测结果，可知miRNA-4252在缺血性脑卒中患者血液和 健康人的血液中的表达存在显著差异，与健康人的血液相比，在缺血性脑卒中患者血液中 的miRNA-4252的水平显著升高。
[0067] 实施例2QPCR验证差异表达的miRNA-4252
[0068] 1、根据miRNA芯片的检测结果选择miRNA-4252进行大样本QPCR验证。按照实施 例1中的样本收集方式选择缺血性脑卒中患者血液样本和健康人血液样本各80例。
[0069] 2、RNA提取过程同实施例1。
[0070] 3、逆转录：
[0071] 1)将 10pg-lμg的总RNA模板与 2μ1 10X缓冲液、2μ1dATP(lOmM)、0· 5μ1 polyA多聚酶、0. 5μ1核糖核酸酶（RNase)抑制剂和无核糖核酸酶水（RNasefreewater) 混合，体积最后为20μ1，37°C孵育lh。
[0072] 2)反应管中加入ΙμL0.5yg/ylOligo(dT)特异性RT引物，70°C孵育 5min。
[0073] 3)立即冰上孵育至少2min，打断RNA和引物的二级结构。
[0074] 4)将上述 20μ1 反应混合物与 4μ1 5X缓冲液、1μ1dNTP(10mM)，0· 5μ1M-MLV 逆转录酶，〇. 5μ1核糖核酸酶（RNase)抑制剂，10μ1polyA反应混合液和4μ1无核糖核 酸酶水（RNasefreewater)混合，42°C孵育lh〇
[0075] 4、QPCR反应：
[0076] 1)引物设计
[0077] 扩增miRNA-4252 的引物
[0078] 正向引物：GGCCACTGAGTCAGCACCA(SEQIDN0. 2)
[0079] 反向引物：GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQIDΝ0· 3)
[0080] 扩增U6snRNA的引物
[0081] 正向引物：CTCGCTTCGGCAGCACA(SEQIDΝ0· 4)
[0082] 反向引物：AACGCTTCACGAATTTGCGT(SEQIDNO. 5)
[0083] 2)按照表1配制PCR反应体系：
[0084] 其中，SYBRGreen聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。
[0085] 表1PCR反应体系
[0086]
[0087] 3)PCR反应条件：95°ClOmin，（95°C15s，60°C60s)X45 个循环。以SYBRGreen 作为荧光标记物，在LightCycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，以U6snRNA作为参照 基因，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，AACT法进行相对定量。
[0088] 5、结果
[0089] 如图1所示，与健康人的血液相比，缺血性脑卒中患者血液中的miRNA-4252的表 达水平显著升高，与miRNA芯片结果一致。
[0090] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进 和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. miRNA-4252在制备诊断缺血性脑卒中的产品中的应用，其特征在于，所述 miRNA-4252 选自以下组中的至少一种：miRNA-4252 初始miRNA、miRNA-4252 前体miRNA、 成熟miRNA-4252 ;所述miRNA-4252初始miRNA能在人细胞内被剪切并表达成成熟 miRNA-4252 ;所述miRNA-4252前体miRNA能在人细胞内被剪切并表达成成熟miRNA-4252。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miRNA-4252是成熟miRNA-4252。3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述诊断缺血性脑卒中的产品包括芯片 或试剂盒；其中，所述芯片包括固相载体以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述 寡核苷酸探针包括特异性地对应于权利要求1所述的miRNA-4252的部分或全部序列；所述 试剂盒包括用于检测权利要求1所述的miRNA-4252的表达水平的试剂。4. 权利要求1所述的miRNA-4252在高通量测序平台中的应用，其特征在于，通过高通 量检测miRNA-4252的表达水平，分析获知所述miRNA-4252的表达异常与缺血性脑卒中的 发生和发展相关。5. -种诊断缺血性脑卒中的产品，其特征在于，所述产品能够通过检测miRNA-4252的 表达水平来诊断缺血性脑卒中。6. 根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述产品包括芯片或试剂盒。其中，所述 芯片包括固相载体；以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括 特异性地对应于权利要求1所述的miRNA-4252的部分或全部序列；所述试剂盒包括用于检 测权利要求1所述的miRNA-4252的表达水平的试剂。7. 根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述试剂盒包括SYBRGreen聚合酶链式 反应体系、用于扩增miRNA-4252和内参的引物对；所述SYBRGreen聚合酶链式反应体系包 含：PCR缓冲液、dNTPs、SYBRGreen荧光染料。8. 根据权利要求7所述的产品，其特征在于，所述扩增miRNA-4252的引物对序列如下： 正向引物序列为 5' -GGCCACTGAGTCAGCACCA-3'，反向引物序列为 5' -GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。9. 根据权利要求7所述的产品，其特征在于，所述内参为U6snRNA，扩增内参 的引物对序列如下：正向引物序列为5' -CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物序列为 5' -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。10. 根据权利要求6-9任一项所述的产品，其特征在于，所述试剂盒还包括M-MLV逆转 录体系，所述M-MLV逆转录体系包括T重复寡核苷酸Oligo-dT、逆转录反应液、M-MLV逆转 录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs。
【专利摘要】本发明公开了一种miRNA标记物，该miRNA标记物是miRNA-4252。通过检测miRNA-4252的表达水平可用于诊断患者是否患有缺血性脑卒中。经实验证明，miRNA-4252可有效区分缺血性脑卒中患者和健康人。在此基础上，miRNA-4252可以用于制备诊断缺血性脑卒中的产品。本发明大大能提高了缺血性脑卒中诊断的敏感性和特异性，实现缺血性脑卒中的早期诊断。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105349666
【申请号】CN201510853891
【发明人】杨承刚, 孙耀兰
【申请人】北京泱深生物信息技术有限公司
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年11月30日