病原生物的多种分析检测的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请是国际申请日为2003年12月2日的国际申请PCT/EP2003/013530进入中 国、申请号为200380105073. 7的题为"病原生物的多种分析检测"的发明专利申请的分案 申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及检测病原微生物的技术领域。更具体地，本发明涉及通过从所述病原 生物扩增和检测特定核酸序列检测临床样品中病原生物导致的感染的领域。
【背景技术】
[0003] 病原细菌，尤其导致脓毒的病原细菌的感染主要发生在医院的重病监护室（I⑶） 并且是严重的。感染患者的细菌在多数情况下是未知的并且不能从症状确定。每种细菌需 要施用特定抗生素的不同疗法。目前，在常规诊断中，使用包括用血液或其他体液样品培养 细菌（如果存在）来检测病原细菌，尤其革兰氏阳性细菌。这种培养保持在有利于细菌生 长的条件下约3天。在该期间内，细菌的数目从而它们的核酸增加。之后，将培养基裂解。 裂解混合物用作随后生化或免疫学分析的样品。整个方法花费至少约4天直到清楚病原细 菌对样品造成的感染。病原细菌的感染对于受感染的人是非常严重的。在感染的第一天， 必须开始治疗，该治疗优选施用适于特别影响具体感染细菌的抗生素。否则，患者受该感染 的侵袭太严重而可能在弄清该感染之前死亡。另一方面，同时施用几种广谱抗生素以防止 全身性事件必须避免使患者虚弱。因此当前的方法对于常规ICU诊断是不能令人满意的。
[0004] 很久以来，在本领域中已经公知通过基于核酸的杂交使用特定杂交探针鉴定病原 生物如病原细菌或真菌。例如，EP0 131 052公开了方法和探针，其中直接从培养基检测 生物的某些种类或某一群体的核糖体核糖核酸（rRNA)序列。检测核糖体靶序列特别有用， 因为这些序列在体内扩增，导致各自测定的高度灵敏性。
[0005] 利用PCR技术改进了对病原生物的基于核酸序列的检测。对于病原真菌如念珠菌 (Candida)和曲霉菌（Aspergillus)的检测，例如，W097/07238公开了一种方法，该方法使 用一般性引物扩增所有类型的真菌核糖体18SrDNA序列并随后将其与真菌种类特异的探 针杂交。
[0006] 作为分析核糖体基因序列的备选方案，非编码但是转录的核糖体间隔区DNA序 列，像位于16S和23SrRNA基因之间的ITS-1区已经被用于检测和鉴定一些病原生物（见， 例如，EP0 452 596)。
[0007] 在另一背景中，通过与等位基因特异的扩增方法相当的依赖靶标的 扩增区分革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌组（Klausegger，A.，等人，J.Clin. Microbiol. 37(1999)464-466)。基于它们的 16Sr_DNA序列，Klausegger等人研究的种在 16SrRNA基因的给定位置不同，因为所有研究的革兰氏阴性细菌都在某一核苷酸位置含有 一个G-残基，而所有研究的革兰氏阳性细菌在所述核苷酸位置总是含有一个C-残基。因 此，分别使用有差别的互补3'-末端C-残基或互补G-残基的引物，可以扩增革兰氏阳性或 革兰氏阴性序列起源的DNA。
[0008] 利用动态实时PCR得到了进一步发展。在这种类型的测定中，在每轮PCR中监视 PCR产物的形成。通常在热循环仪中测量扩增，该热循环仪具有额外的检测方法用以监视 扩增反应期间的焚光信号。一个典型的实例是RocheDiagnosticsLightCyeler?(目录 号20110468)。在LightCycler?以及目前通过商业途径可得到的其他实时PCR仪器中， 通过荧光标记的杂交探针检测扩增产物，这些探针仅当结合靶核酸时发出荧光信号，或者 在一些情况中通过结合双链DNA的荧光染料检测扩增产物。为所要分析的所有反应确定 限定的信号阈值，并且为靶核酸以及对照核酸如标准或管家基因确定达到该阈值所需的循 环数（Cp)。可以基于为靶核酸和对照核酸所得到的Cp值确定靶分子的绝对或相对拷贝数 (RocheDiagnosticsLightCycler?操作手册（目录号 20110468))。
[0009] 对于扩增DNA的检测存在不同形式：
[0010] a)DNA结合染料形式
[0011]因为双链扩增产物的量通常超过所要分析的样品中最初存在的核酸的量，所以可 以使用双链DNA特异染料，当用适宜波长激发时该染料仅当结合双链DNA时表现出增强的 荧光。该方法在EP0 512 334中描述。优选地，仅使用像例如，SYBli?GreenI的染料， 它们不影响PCR反应的效率。本领域中公知的所有其他形式需要适当设计荧光标记的杂交 探针，该探针仅当结合其靶核酸时发出荧光。
[0012] b)TaqMan? 探针
[0013] 用两种组分标记单链杂交探针。根据荧光共振能量转移，当第一种组分（所称作 的荧光剂）被适当波长的光激发时，所吸收的能量被转移到第二种组分（所称作的淬灭 剂）。在PCR反应的退火步骤，杂交探针结合靶DNA并在延伸期间被聚合酶，例如Taq聚合 酶的5'_3'外切核酸酶活性降解。结果，所激发的荧光组分和淬灭剂在空间上相互分开，从 而可以测量第一种组分的荧光发射（EPB0 543 942和US5, 210, 015)。
[0014] c)分子信标
[0015] 这些杂交探针也被第一种组分和淬灭剂标记，标记物优选位于至少部分自身互 补探针的不同末端。由于该探针的二级结构的结果，溶液中两种组分在空间上接近。杂 交到靶核酸后，两种组分相互分开，从而用适当波长的光激发后，可以测量第一种组分（US 5, 118, 801) 〇
[0016] d)FRET杂交探针
[0017] 荧光共振能量转移（FRET)杂交探针试验形式特别用于所有种类的同质 (homologous)杂交测定（Matthews，J.A.和Kricka，L.J.，AnalBiochem169(1988) 1-25)。 其特征是同时使用两种单链杂交探针，并且这两种探针与（扩增的）靶核酸的相同链的相 邻部位互补。用不同荧光组分标记两种探针。当用适当波长的光激发时，根据荧光共振能 量转移原理，第一种组分将吸收的能量转移到第二种组分，从而仅当两种杂交探针结合到 所要检测的靶分子的相邻位置时可以测量第二种组分的荧光发射。
[0018] 当与靶序列退火时，杂交探针必须以头到尾的排列相互非常接近。通常，第一种探 针的标记的3'末端和第二种探针的标记的5'末端之间的缺口尽可能小，S卩1-5个碱基。这 容许FRET供体化合物和FRET受体化合物紧密接近，通常相距10-100埃。细节是熟知的并 且在例如EP0 070 687中公开。
[0019] 备选地，为了监视FRET受体组分的荧光的增加，还可能监视FRET供体组分的荧光 降低，将其作为杂交事件的定量测量。
[0020] 具体地，FRET杂交探针形式可用于实时PCR中以检测扩增的靶DNA。在实时PCR 领域中所有公知的检测形式中，FRET-杂交探针形式已经被证明是高度灵敏、精确和可靠的 (TO97/46707 ;W0 97/46712 ;W097/46714)。然而，适宜FRET杂交探针序列的设计有时受到 所要检测的靶核酸序列的特定特征的限制。
[0021] 作为使用两种FRET杂交探针的备选方案，还可能使用荧光标记的引物和仅一种 标记的寡核苷酸探针（Bernard，P.S.，等人，Anal.Biochem. 255 (1998) 101-7)。在这点上， 可以任意用FRET供体或FRET受体化合物标记引物。
[0022] FRET杂交探针（所称作的FRET-Hybprobes或FRET探针）也可用于熔解曲线分析 (W097/46707;W0 97/46712 ;W0 97/46714)。在这种测定中，首先在典型PCR反应中用适宜 的扩增引物扩增靶核酸。扩增反应期间杂交探针可以已经存在或者随后加入。PCR反应完 成后，样品的温度组成性地增加。只要杂交探针结合到靶DNA，就可检测到荧光。在熔解温 度，杂交探针从它们的靶标释放，荧光信号立即降低到背景水平。用适宜的荧光对温度-时 间图监视该降低，从而可以计算一阶导数函数的负数。然后将相应于这种函数的所得最大 值的温度值作为所述FRET杂交探针对的确定的熔解温度。
[0023] 靶核酸内点突变或多态性导致靶核酸和FRET探针之间小于100%的互补性，从而 导致熔解温度降低。这使得能够通过FERT-Hybprobe杂交一般性检测序列变体池（pool)， 而随后，通过实施熔解曲线分析区分所述池的不同成员。分子信标可以代替FRET杂交探针 用于熔解曲线分析。
[0024] 当可以利用实施PCR和同质实时PCR熔解曲线分析时，使用双链DNA结合染料如 SybrGreen?〗，或者备选地，特别设计的与不同但是类似的靶序列杂交的杂交探针，可以区 分不同的物种或菌株类型。
[0025] 在第一种情况中，必须确定所产生的双链PCR产物的熔解温度。然而，该方法只有 有限应用，因为微小序列变异仅导致微小的熔解温度差异，其不能被有效监视。Woo,T.H.， 等人，J.Microbiol.Methods35 (1999) 23-30公开了一个成功的实例，他们进行了双曲钩端 螺旋体（Leptospirabiflexa)的16SrDNA序列的扩增并用SybrGreen?I作为DNA结合 染料进行熔解曲线分析以便从来自不同钩端螺旋体种的DNA的非特异扩增产物区分双曲 钩端螺旋体株。
[0026] 备选地，可以以这种方式使用杂交探针从而确定探针/靶核酸杂交体的熔解温 度。例如，Espy，M.J.，等人，J.Clin.Microbiol. 38(2000)795-799 公开了通过扩增单纯疱 疹序列并随后用FRET杂交探针分析序列以区分I型HSV和II型HSV基因型，从而诊断单 纯疱疹感染。
[0027] 此外，W001/48237提出通常将扩增和依赖温度的杂交联合以检测不同的病原物 种。然而W001/48237没有教导能够排外性检测病原生物而且不检测任何非病原生物的的 任何方法或条件。
[0028] 甚至当前所用的包括特定细菌种的体外扩增和所述细菌的随后检测的方法也不 能用于需要紧急诊断，例如，ICU中的情形，因为对于每种细菌，必须进行扩增反应和检测反 应。这需要从每个患者抽取大量样品体积，如血液。在ICU中，不能从严重感染的患者得到 大的样品体积。
[0029] 从而本领域中需要提供特别用于在尽可能小体积中检测相关目标病原生物的方 法。具体地，本领域中需要能够检测所有相关病原革兰氏阳性细菌但同时不检测类似的非 病原革兰氏阳性细菌的方法。具体地，需要确定哪种病原属和/或种存在于样品中。
【发明内容】
[0030] 通过本申请中公开和要求的方法和化合物解决了上面公开的问题。
[0031] 通常，本发明涉及从病原的预定组鉴定病原生物的方法，该方法包括
[0032] a)分离含