芜菁花叶病毒的逆转录环介导等温扩增快速检测方法

芜菁花叶病毒的逆转录环介导等温扩增快速检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种芜菁花叶病毒的逆转录环介导等温扩增快速检测方法，根据芜菁花叶病毒核酸序列，设计了一套特异引物（F3、B3、FIP、BIP，如SEQIDNO.1～4所示）样品提取总RNA后，进行LAMP反应，反应产物经电泳或者荧光染料的方法实现芜菁花叶病毒的检测。本发明的方法，对TuMV的检测特异性强，具有快速、灵敏、稳定、高效，仪器要求简易，操作简便，成本低，易于在基层推广使用的特点。
【专利说明】芜菁花叶病毒的逆转录环介导等温扩增快速检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种采用反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)技术检测芜菁花叶病毒(TuMV)的方法，属于生物技术病毒检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002]芜菁花叶病毒(Turnipmosaicvirus, TuMV)为世界性分布的病毒,是危害十字花科蔬菜的主要病毒，属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus),病毒粒子呈弯曲线形，长约720nm，宽约15~20nm，由95%的外壳蛋白和5%的RNA构成，病毒核酸为单链正义RNA,约由10000个核苷酸组成。TuMV可由包括桃姆(Myzuspersicae)和甘蓝虫牙(Brevicorynebrassicae)在内的89种姆虫以非持久方式传播,也可通过摩擦接种传播。TuMV的寄主范围非常广泛，可侵染43科156属的318种植物，在自然条件下主要侵染十字花科植物和观赏性物种。1921年美国Gardner等首次报道TuMV侵染白菜，国内凌立和杨演在1941年报道四川油菜花叶病是由TuMV引起。目前，TuMV在全球均有分布，尤其是在温带和热带地区危害严重。据在28个国家和地区的报道，TuMV已成为世界范围内危害大田蔬菜最严重的病毒之一。据调查，我国白菜因TuMV危害，平均每年造成5%的产量损失，有些年份减产达10%以上，病害严重的地块几乎绝收。
[0003]环介导恒温核酸扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)最早是由NotomiT等在2000年发明的， 是一种基于高灵敏链置换技术的恒温核酸扩增方法，其工作原理为:针对靶基因的6个区域设计了 4个特异引物，利用一种链置换DNA聚合
酶-Bst (Bacillusstearothermophilus)DNApolymerase 在恒温(65°C )的条件下反应
I小时即可完成核酸扩增反应，反应产物既可通过电泳紫外观察，亦可通过荧光染色直接目测。该方法操作简便，无需特殊仪器(PCR仪)，而检测结果准确，是一种快捷而有效的检测方法。目前已广泛应用于人类和动植物各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病检测和快速诊断。该方法应用范围广泛，适于基层实验室进行快速检测。本发明根据芜菁花叶病毒保守区设计了 LAMP引物，采用一步法反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)建立了一种快速、灵敏、高度特异的检测芜菁花叶病毒的方法，为该病毒的快速检测提供了新的手段。
[0004]目前在芜菁花叶病毒的检测上，较常用的方法有两种，一种是分子生物学检测方法，其中以PCR最为常见，但是PCR需要30-35个循环反应(较费时)及特殊的仪器(PCR仪)且操作程序繁琐复杂、时间长，对检测人员较高的技术要求，大大限制了作为快速诊断方法的使用和推广；另一种是血清学检测方法，常见的有ELISA，血清学检测方法除了在灵敏度上存在不足外，其检测的特异性也受到限制。而LAMP方法很好的克服了当前这两类方法的不足(反应时间短，无需特殊仪器，检测灵敏度高，特异性好)，目前尚未见利用LAMP技术检测芜菁花叶病毒的报道。LAMP方法既保证了检测的灵敏性和特异性，同时又简化了操作，节省了成本，为今后该病害的调查提供了一种简单而有效的方法。

【发明内容】
[0005]针对上述现有技术，本发明为芜菁花叶病毒的检测提供了一种快速、特异、简便、灵敏、稳定的检测方法——芜菁花叶病毒的逆转录环介导等温扩增快速检测方法。
[0006]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0007]芜菁花叶病毒的逆转录环介导等温扩增快速检测方法，包括以下步骤:
[0008](I)引物设计:[0009]根据NCBI上已报道的芜菁花叶病毒核酸序列，设计I套特异引物，引物序列如下(5， -3，):
[0010]F3:TGCCACGATATGGTCTTC ;如 SEQIDN0.1 所示；
[0011]B3:TGTTCTCTACCGTTGTACC ;如 SEQIDN0.2 所示；
[0012]FIP: CACGTATTGGAGTTCTAGAAGTCAT-AGCGCAATTTAACCGACA ;如 SEQIDN0.3 所示；
[0013]BIP: CGAGAGAGGCACACATCCAG-AACGTTTCCATCCAAGCC ;如 SEQIDN0.4 所示；
[0014](2)植物总RNA提取:
[0015]取0.1g新鲜植物叶片在液氮中研磨至粉末,采用RNAsimpleTotalRNAKit提取样品总RNA，通过抽提RNA产物加入DEPC-ddH20溶液，_80°C保存备用；
[0016](3) RT-LAMP 反应:
[0017]反应体系(25yL)如下:10XThermopolbuffer2.5μ L (20mMTris-HCl, IOmMKCl,2MmMgS04, IOmM(NH4)2SO4,0.l%TritonX-100),引物(F3 和 B3) 0.2 μ Μ,引物(FIP 和 BIP)
1.0 μ M, dNTPsl.0mM, MgCl24mM,200U/μ LM-MLVl μ L, BstDNApolymerase (NEB) 1.5 μ L,模板 RNA2.0yL；
[0018]反应条件:63°C恒温 Ih ；80°C 5min ；
[0019](4)检测:
[0020]电泳检测:取10 μ L产物经1.5%琼脂糖凝胶在0.5 X TBE缓冲液和155V电压条件下电泳25min,在0.5 μ g/mL的溴化乙锭(EB)中染色IOmin,染色后于凝胶成像系统中观察，在感染芜菁花叶病毒的样品中可以观察到明亮的呈弥散状的核酸泳带；
[0021]或:
[0022]荧光染料检测:LAMP反应结束后，向其产物中加入SYBRGreenI (I: 1000) 2.5 μ 1，5min后察结果，感染芜菁花叶病毒的样品变成绿色，而未感染样品及空白对照保持染料的橙色。
[0023]本发明的有益效果是:根据芜菁花叶病毒核苷酸序列设计LAMP引物，通过摸索优化条件实现了该病毒的快速检测，为该病害的调查提供了一种简便有效的方法，极大地提高了检测效率，降低了检测成本。
[0024]本发明建立了一种芜菁花叶病毒的逆转录环介导等温检测方法，本发明针对目的基因TuMV的6个区域设计了 4条特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温63°C左右，几十分钟即可实现核酸的高效扩增；4条引物对靶序列的6个特异序列区域的识别，保证了LAMP扩增的高度特异性。样品提取总RNA后，进行RT-LAMP反应，反应产物经电泳或者加入荧光染料SYBRGREEN I直接观察的方法实现芜菁花叶病毒的检快速测。提供的方法对TuMV的检测特异性强，具有快速、灵敏、稳定、高效，仪器要求简易，操作简便，成本低，易于在基层推广使用的特点。【专利附图】

【附图说明】
[0025]图1是RT-LAMP引物筛选结果电泳图，其中M:Trans2KPIusDNAMaker, 1-4:分别为四套引物检测TuMV感病样品，5-8:依次为四套引物的阴性对照。
[0026]图2是RT-LAMP引物筛选结果荧光染料图，1-4:分别为四套引物检测TuMV感病样品，5-8:依次为四套引物的阴性对照。
[0027]图3是RT-LAMP反应体系优化结果电泳图，其中M:Trans2KPIusDNAMaker, 1、3、5:分别为A、B、C体系检测TuMV感病样品，2、4、6:分别为A、B、C体系的阴性对照。
[0028]图4是RT-LAMP反应体系优化结果荧光染料图，1、3、5:分别为A、B、C体系检测TuMV感病样品，2、4、6:分别为A、B、C体系的阴性对照。
[0029]图5是RT-LAMP特异性检测结果电泳图，其中M:Trans2KPIusDNAMaker, 1、2、3为田间感染TuMV萝卜样品，4、5、6、7分别为BBWV、CMV、TMV、TRV感病样品，8:阴性对照。
[0030]图6是RT-LAMP特异性检测结果荧光染料图，其中1、2、3为田间感染TuMV萝卜样品，4、5、6、7分别为BBWV、CMV、TMV、TRV感病样，8:阴性对照。
[0031]图7是RT-LAMP灵敏性检测结果电泳图，其中M:Trans2KPIusDNAMaker, 1-8分别用RNA稀释KT1-KT8倍做模板，9:阴性对照。
[0032]图8是RT-LAMP灵敏 性检测结果荧光染料图，其中1_8分别用RNA稀释1(^-10.8倍做模板，9:阴性对照。
【具体实施方式】
[0033]下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0034]以下的实施例便于更好的理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下属实施例中所用的实验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0035]材料与试剂
[0036]健康萝卜样品，感病萝卜样品采自于中国临沂，采集样品保存于_80°C冰箱中。
[0037]主要试剂:
[0038]BstDNApolymerase购自北京纽英伦NEB生物技术公司；
[0039]植物总RNA提取试剂盒，MgCl2购自北京天根生化科技有限公司；
[0040]M-MLV反转录酶，dNTPs购自TaKaRa公司；
[0041]SYBRGreen I 购自 Invitrogen 公司。
[0042]实施例1:建立芜菁花叶病毒的逆转录环介导等温扩增检测方法
[0043]以感染芜菁花叶病毒的萝卜样品为检测对象，以健康萝卜样品为阴性对照。
[0044]1、引物设计:
[0045]根据NCBI上已报道的芜菁花叶病毒核酸序列，利用LAMP引物设计软件PrimerExplorer V4设计了 8套特异引物,根据LAMP弓丨物设计原则初步筛选出4套引物，引物序列如下(5’ -3’):
[0046]第一组引物:
[0047]F3:TGCCACGATATGGTCTTC ;如 SEQIDN0.1 所示；
[0048]B3:TGTTCTCTACCGTTGTACC ;如 SEQIDN0.2 所示；[0049]FIP: CACGTATTGGAGTTCTAGAAGTCAT-AGCGCAATTTAACCGACA ;如 SEQIDN0.3 所示；
[0050]BIP: CGAGAGAGGCACACATCCAG-AACGTTTCCATCCAAGCC,如 SEQIDN0.4 所示。
[0051]第二组引物:
[0052]F3:ATTGAGAACGGAACCTCC ;如 SEQIDN0.5 所示；
[0053]B3:GACCATATCGTGGCATGT ;如 SEQIDN0.6 所示；
[0054]FIP:GCGGTTTGATCGGGAATTCCA-CATAAACGGAATGTGGGTGA ;如 SEQIDN0.7 所示；
[0055]BIP:AACCCACATTTAGGCAGATAATGG-ATGGTCGGTCTTGGTTAC ;如 SEQIDN0.8 所示。
[0056]第三组引物:
[0057]F3:TCATTGACCACGCCAAAC ;如 SEQIDN0.9 所示；
[0058]B3:CGTATTGGAGTTCTAGAAGTCAT ;如 SEQIDN0.10 所示；
[0059]FIP:CGGTCTTGGTTACGCTTTTCAATG-TAGGCAGATAATGGCCCAT ;如 SEQIDN0.11 所示；
[0060]BIP:CCATACATGCCACGATATGGTC-TTCATAGAAATCAAACGCGTATC ;如 SEQIDN0.12 所示。
[0061]第四组引物:
[0062]F3:AAACCGCTCATTGACCAC ;如 SEQIDN0.13 所示；
[0063]B3:GAAGTCATTTCATAGAAATCAAACG ;如 SEQIDN0.14 所示；
[0064]FIP:TTCAATGTACGCTTCAGCTACG-CCAAACCCACATTTAGGC ;如 SEQIDN0.15 所示；
[0065]BIP:GCGTAACCAAGACCGACCAT-CGTATCGAGCTAAGCTCATG ;如 SEQIDN0.16 所示。
[0066]2、植物总RNA提取:
[0067]取0.1g新鲜植物叶片在液氮中研磨至粉末,采用RNAsimpleTotalRNAKi提取样品总RNA，通过抽提RNA产物加入DEPC-ddH20溶液，_80°C保存备用。
[0068]3、RT-LAMP反应及LAMP弓丨物的筛选:
[0069]反应体系(25μ L)如下:10 X Thermopolbuff er2.5μ L (20mMTris_HCl，IOmMKCl,2MmMgS04, IOmM (NH4)2SO4,0.l%TritonX-100),四组引物中引物(F3 和 Β3)0.2μΜ，四组引物中引物(FIP 和 BIP) 0.8 μ M，dNTPsl.0mM, MgCl23mM, 200U/ μ LM-MLV0.5 μ L,BstDNApolymerase (NEB) 1.5 μ L,模版 RNA2.0 μ L。
[0070]反应条件:63°C恒温 Ih ；80°C 5min。
[0071]4、检测:
[0072]电泳检测:取10 μ L产物经1.5%琼脂糖凝胶在0.5 X TBE缓冲液和155V电压条件下电泳25min,在0.5 μ g/mL的溴化乙锭(EB)中染色IOmin,染色后于凝胶成像系统中观察，在感染芜菁花叶病毒的样品中可以观察到明亮的呈弥散状的核酸泳带。
[0073]或:荧光染料检测:LAMP反应结束后，向其产物中加入SYBRGreenI (I: 1000) 2.5 μ 1，5min后察结果，感染芜菁花叶病毒的样品变成翠绿色，而未感染样品及空白对照保持染料的橙色。
[0074]5、结果分析
[0075]电泳检测:在以感染芜菁花叶病毒样品RNA为模板的四组引物中，可以观察到第一组引物呈弥散状的核酸泳带，第二组引物核酸电泳带不明显，而第三和第四组引物则没有弥散状核酸电泳带，在以健康样品RNA为模板的四组引物中均无核酸电泳条带，阴性对照也无核酸电泳带(图1);
[0076]荧光染色:在以感染芜菁花叶病毒样品RNA为模板的四组引物中，可以观察到第一组引物呈翠绿色，第二组引物翠绿色很浅，而第三和第四组引物和未感染样品保持染料的橙色(图2)。
[0077]实施例2 =RT-LAMP检测体系的优化
[0078]通过实例I可以筛选出最优的引物为第一组引物，但是第一组引物的核酸电泳条带不是十分明显，所以通过对构建体系的主要影响的两个因素Mg2+浓度和内外引物浓度比筛选、确定最优检测体系。反应体系(25 μ L):
[0079]A: 10 X Thermopolbuffer2.5 μ L ( 20mMTr i s-HCl, IOmMKCl，2MmMgS04，IOmM (NH4) 2S04,0.l%TritonX-100)，第一组引物中引物(F3 和 B3) 0.2 μ M，第一组引物中引物(FIP 和 BIP) 1.0 μ M，dNTPsl.0mM, MgCl24mM, 200U/ μ LM-MLV1.0 μ L，BstDNApolymerase(NEB) 1.5 μ L,模版 RNA2.0μ L ；
[0080]B: 10 X Thermopolbuffer2.5 μ L ( 20mMTr i s-HCl, IOmMKCl，2MmMgS04，IOmM (NH4) 2S04,0.l%TritonX-100)，第一组引物中引物(F3 和 B3) 0.2 μ M，第一组引物中引物(FIP 和 BIP) 0.8 μ M，dNTPsl.0mM, MgCl23mM, 200U/ μ LM-MLV1.0 μ L，BstDNApolymerase(NEB) 1.5 μ L,模版 RNA2.0μ L ；
[0081]C: 10 X Thermopolbuffer2.5 μ L ( 20mMTri s-HCl, IOmMKCl，2MmMgS04，IOmM (NH4) 2S04,0.l%TritonX-100)，第一组引物中引物(F3 和 B3) 0.2 μ M，第一组引物中引物(FIP 和 BIP) 0.8 μ M，dNTPsl.0mM, MgCl24mM, 200U/ μ LM-MLV1.0 μ L，BstDNApolymerase(NEB) 1.5 μ L，模版 RNA2.0 μ L。
[0082]反应条件:63°C恒温 Ih ；80°C 5min。
[0083]RT-LAMP结果用1.5%的琼脂糖凝胶电泳以及加入SYBRGreen I后直接用肉眼观察两种方法来分析。通过图3可以看出，A体系中TuMV样品呈明亮的弥散状核酸电泳带，B体系中TuMV样品核酸电泳带弥散状不明显，C体系中TuMV样品呈明亮的弥散状核酸电泳带但稍弱于A体系，对照中均无核酸电泳带；通过图4可以看出，A、C体系中TuMV样品呈典型的翠绿色，B体系中的TuMV样品翠绿色稍浅，对照均呈橙色。以上结果说明A体系为最优体系。
[0084]实施例3:本发明中RT-LAMP检测方法的特异性和稳定性
[0085]按上述实施例2反应A体系及反应条件，同时对田间健康植株、TuMV, BBWV, CMV,TMV,TRV感病样品进行检测，检验RT-LAMP方法的特异性及稳定性。以提取的健康植株、感染了 TuMV、BBWV、CMV、TMV、TRV田间样品叶片中提取的RNA为检测模板进行RT-LAMP扩增反应，RT-LAMP结果用1.5%的琼脂糖凝胶电泳以及加入SYBRGreen I后直接用肉眼观察两种方法来分析。通过图5、6可以看出，仅在TuMV反应管中出现了阳性反应出现特异性地翠绿色荧光，其他反应管均为阴性，并且田间的3个TuMV感病样品均呈阳性。结果说明本发明中的RT-LAMP方法特异性强，稳定性高，能够特异性地检测TuMV，与其它病毒无交叉反应。
[0086]实施例4:本发明中RT-LAMP检测方法的灵敏性
[0087]样品:TuMVRNA(原始浓度 20ng/ μ L)
[0088]样品处理:将TuMVRNA做I(T1-K)-8的倍比稀释。
[0089]按上述实施例2反应A体系及反应条件，以稀释后的RNA来做RT-LAMP的模板进行RT-LAMP扩增反应，RT-LAMP结果用1.5%的琼脂糖凝胶电泳以及加入SYBRGreen I后直接用肉眼观察两种方法来分析。通过图7、8可以看出，在稀释10_8倍时还能检测到，并呈现特异的翠绿色荧光。结果说明本发明中的RT-LAMP方法灵敏性高，能够检测到10_8的模板。
[0090]RT-LAMP检测方法不需要昂贵的仪器设备、操作程序简单，而且有快速高效、高特异性、高灵敏性的特点，其应用范围越来越广泛，已经在病原微生物检测中发挥出极大的优势。用本实验中描述的RT-LAMP方法检测芜菁花叶病毒可以节省大量的时间，而且操作简单。总之，本发明建立了一套快速、简便、特异、灵敏的检测芜菁花叶病毒的方法。因此，有理由相信RT-LAMP作为一种分子生物学的快速检测方法，将会有更广阔的的应用前景。
【权利要求】
1.芜菁花叶病毒的逆转录环介导等温扩增快速检测方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)引物设计: 根据NCBI上已报道的芜菁花叶病毒核酸序列，设计特异引物，引物序列如下:
F3:TGCCACGATATGGTCTTC ;如 SEQIDN0.1 所示；
B3:TGTTCTCTACCGTTGTACC ;如 SEQIDN0.2 所示；
FIP: CACGTATTGGAGTTCTAGAAGTCAT-AGCGCAATTTAACCGACA ;如 SEQIDN0.3 所示；
BIP: CGAGAGAGGCACACATCCAG-AACGTTTCCATCCAAGCC ;如 SEQIDN0.4 所示； (2)植物总RNA提取: 取0.1g新鲜植物叶片在液氮中研磨至粉末,采用RNAsimpleTotalRNAKit提取样品总RNA,通过抽提RNA产物加入DEPC-ddH20溶液，_80°C保存备用； (3)RT-LAMP 反应: 反应体系(25yL)如下:10 X Thermopolbuff er2.5μ L (20mMTris-HCl, IOmMKCl,2MmMgS04, IOmM(NH4)2SO4,0.l%TritonX-100),引物(F3 和 B3) 0.2 μ Μ,引物(FIP 和 BIP)1.0 μ M, dNTPsl.0mM, MgCl24mM,200U/μ LM-MLVl μ L, BstDNApolymerase (NEB) 1.5 μ L,模板 RNA2.0yL；
反应条件:63°C恒温Ih ；80°C 5min ； (4)检测: 电泳检测:取10 μ L产物经1.5%琼脂糖凝胶在0.5 X TBE缓冲液和155V电压条件下电泳25min,在0.5 μ g/mL的溴化乙锭(EB)中染色IOmin,染色后于凝胶成像系统中观察，在感染芜菁花叶病毒的样品中可以观察到明亮的呈弥散状的核酸泳带； 或.荧光染料检测=LAMP反应结束后，向其产物中加入SYBRGreenI (I: 1000) 2.5 μ I, 5min后察结果，感染芜菁花叶病毒的样品变成绿色，而未感染样品及空白对照保持染料的橙色。
2.芜菁花叶病毒的逆转录环介导等温扩增快速检测引物，其特征在于:包括以下四条引物，序列如下:
F3:TGCCACGATATGGTCTTC ;如 SEQIDN0.1 所示；
B3:TGTTCTCTACCGTTGTACC ;如 SEQIDN0.2 所示；
FIP: CACGTATTGGAGTTCTAGAAGTCAT-AGCGCAATTTAACCGACA ;如 SEQIDN0.3 所示；
BIP: CGAGAGAGGCACACATCCAG-AACGTTTCCATCCAAGCC ;如 SEQIDN0.4 所示。
【文档编号】C12N15/11GK103498011SQ201310488797
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年10月17日 优先权日:2013年10月17日
【发明者】竺晓平, 李刚, 赵黎明, 李现道 申请人:山东农业大学, 山东烟草研究院有限公司