鸡β-防御素9酵母工程菌制备及其表达方法
【专利摘要】本发明公开了鸡β-防御素9酵母工程菌制备及表达方法，属于生物技术及基因工程制药【技术领域】。首先利用毕赤酵母惯用密码子优化鸡β-防御素9基因，在其前端添加Kex2酶切位点编码序列并人工合成该基因，然后将合成的β-防御素9基因序列插入酵母组成型表达载体，通过同源重组整合到甲基营养型毕赤酵母染色体中，经多次筛选得到生产鸡β-防御素9的酵母工程菌。经发酵培养，它能持续性进行蛋白高水平表达，表达产物产量高、更接近天然结构且分泌到发酵液中，也具有较强的抗食源性病原活性。将发酵液通过初步分离，经浓缩或干燥后可直接作为饲料添加剂，用于动物养殖业，降低了防御素的生产成本，提高了生产企业的经济效益。本发明为β-防御素9的工业化大规模生产和应用及开发家禽饲料抗生素添加剂替代品奠定了技术基础。
【专利说明】鸡P-防御素9酵母工程菌制备及其表达方法
【技术领域】 [0001]本发明属于生物技术及基因工程制药【技术领域】，具体涉及一种鸡P -防御素9酵母工程菌制备及其表达方法。
【背景技术】
[0002]自20世纪50年代起，抗生素的亚治疗剂量就被添加到饲料中来促进动物的生长。大量抗生素在养殖业中的滥用，已经导致耐药性细菌不断出现，一些感染性病原体甚至严重威胁到人类健康和畜牧业的发展。随着人们关注度的不断提高和抗药性病原的传播，欧洲已经开始禁止在动物饲料中使用抗生素来促进动物生长。因此，寻找一种天然的无污染的能够替代抗生素的新型饲料添加剂迫在眉睫，它既拥有抗菌功能，又能促进动物生长，以降低饲养成本。
[0003]防御素属于抗菌肽家族的一个亚族，是广泛分布于动植物界的一类富含半胱氨酸的阳离子小肽。防御素具有广谱抗微生物活性，对细菌、真菌、螺旋体、病毒等均有抗性，且病源微生物不易产生耐药性，是宿主抵抗外来致病性微生物侵袭的重要防线，同时由于其在动物体的多种不同组织器官中持续性表达，也被认为是动物先天性免疫系统的一部分，具有重要的生理学功能。其主要特征是6个半胱氨酸残基形成的3对二硫键，成熟肽大约有38-42个氨基酸，分子质量约为3-4kDa。根据空间结构的不同，防御素可以分为3大类:a -防御素、^ -防御素和0 -防御素。禽防御素属于P -防御素类，3对二硫键分别为Cys-1~Cys-5、Cys-2~Cys_4和Cys_3~Cys_6配对连接形成，富含精氨酸，具有亲水性和亲脂性、特征性(6-片层结构。迄今为止，已在鸡体内发现了 14种(6-防御素，这些鸡防御素基因被分别命名为AvBDl~14。其中鸡P -防御素9 (AvBD9)广泛分布于鸡的各类器官组织中，尤其在粘液囊、食道、嗉囊、肝脏和胃等消化系统各器官组织中表达量较高。消化道为动物机体与食源性病原接触部位，也是其侵入部位。AvBD9具有良好的生物安全性，且具有较强的抗菌活性，能够抑制或者杀死病原菌，这对鸡消化道健康，尤其对防止上消化道感染等机体局部防御和炎症中起着重要作用。在畜禽生产中可用于防治疾病，促进动物健康养殖，具有潜在的应用和开发价值，而分子重组技术是蛋白类或肽类产品开发应用的有效途径。
[0004]巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统既具有原核表达系统的表达量高、可大规模培养的优点，又具有真核表达系统的蛋白翻译后修饰、加工及折叠的优势，且外源基因的遗传稳定性较好，是目前广泛应用的真核表达系统之一。毕赤酵母表达系统具有很高的生物安全性，获得包括美国FDA在内的广泛认可。毕赤酵母自身分泌很少量的蛋白，易于异源蛋白的分离纯化，且其分泌的蛋白存在翻译后加工修饰，使之更接近于天然蛋白的构象和活性，因此更适合真核生物基因的表达。又因其表达水平稳定、发酵工艺成熟等优点，而成为目前最受欢迎的异源蛋白基因表达系统之一。醇氧化酶AOXl启动子(pAOXl)是P.pastoris表达中应用较多的启动子，其甲醇诱导性很强。但发酵过程中需要用有毒挥发性的甲醇作为诱导剂，需要碳源的转换，因而操作不方便，且外源蛋白的生产周期较长。甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(pGAP)是P.pastoris的组成型强启动子，已用来表达许多异源蛋白，并获得了与PAOXl相似的产量。此外，GAP启动子有许多优势:重组菌发酵过程简单，安全性高且不需要大量甲醇的储存与运输，更适合大规模发酵生产，具有连续培养的潜能，且降低了目的蛋白的生产成本。
[0005]酵母单细胞蛋白作为饲料具有明显的优势，如酵母干物质中蛋白质含量约50 %-60%;酵母菌中含有丰富的酶类，含有(6 -葡聚糖(57.0 %)、甘露聚糖(6.6 %)、糖蛋白(22.0%)和几丁质等活性成分；蛋白质中含有动物机体所必须的各种氨基酸，特别是植物饲料中缺乏的赖氨酸、蛋氨酸和色氨酸含量较多，生物学价值大大优于植物蛋白质，单细胞蛋白的消化率高达85%~90% ;既对动物具有促生长作用，又可提高机体免疫，对动物而言，酵母饲料是一种理想的生物活性蛋白质饲料。
【发明内容】
[0006]本发明的AvBD9基因是一种将来源于鸡的禽P -防御素9基因优化处理后的基因，其优化处理是根据毕赤酵母偏爱性密码子进行，将酵母不常用的密码子agg、cgt, ggg、ggc、gca等优化为偏爱密码子aga、ggt、get等,利用DNASTAR软件分析后得到的，并在其5/端添加Kex2酶切位点编码序列AAAAGA，经过这一处理，可使目标基因在毕赤酵母中更好的进行表达，并分泌出更接近于天然结构的活性成熟肽。
[0007]本发明旨在公开一种在酵母表达系统中表达鸡AvBD9的方法，首次实现鸡AvBD9基因在酵母中持续性高水平表达，且组成型表达，无需甲醇诱导，并将鸡AvBD9表达产物分泌到发酵液培养基中，取上清液，进行分离纯化处理，并开发出一种绿色、安全、高效的新型饲料添加剂。
[0008]本发明的能够分泌AvBD9的酵母工程菌是通过如下技术方案来实现的。
[0009]采用受体菌GSl 15、组成型表达载体质粒pGHK a ;目的蛋白的41个氨基酸的基因片段；重组质粒构建时，质粒pGHK a的EcoR I和Not I位点之间插入鸡AvBD9目的基因片段；重组质粒经Sac I和Bgl II酶切线性化，去除Amp抗性基因，电转化至高效毕赤酵母GSl 15感受态细胞；利用MD平板初筛和PCR鉴定筛选出阳性重组子，并经G418抗性筛选高拷贝重组子；在相同的条件下，对不同拷贝数的菌株分别进行培养表达外源蛋白，测定培养液中蛋白质浓度，选择出高表达菌株；再利用高表达菌株进行发酵培养，表达产物直接分泌到胞外，离心所得到的上清液中即含有表达的蛋白产物——AvBD9。
[0010]AvBD9在酵母表达系统中的表达方法,包括以下步骤:
[0011](I)目的基因AvBD9的优化设计与合成；
[0012](2)双酶切AvBD9基因与载体pGHKa，连接构建重组质粒，转化宿主菌毕赤酵母GS115 ；
[0013](3)筛选出来的重组酵母菌，经培养，离心所得上清液中即为AvBD9。
[0014]AvBD9重组工程菌，其保藏号:CGMCC No7832 ;保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址:北京市朝阳区北辰路I号院3号；保藏日期:2013-06-27 ;分类命名:巴斯德毕赤酵母；拉丁名:Pichia pastoris。
[0015]所述的发酵培养是挑取重组酵母菌单菌落接种于5mL YH)液体培养基，30°C、200rpm过夜培养，而后转接于50mL改良MD液体培养基28°C、200rpm培养2天。[0016] 所述转化宿主菌之前，先将重组质粒用Sac I和Bgl II进行酶切线性化，以去除Amp抗性基因，增加安全性。
[0017]所述目的基因AvBD9的5丨端添加Kex2酶切位点编码序列AAAAGA。
[0018]所述双酶切所用限制性内切酶为EcoR I和Not I。
[0019]本发明相对于现有技术所具有的优势及有益成果。
[0020]本发明AvBD9重组工程菌，比之现有技术，受体菌选用操作简便、快捷，稳定性好及易于高密度发酵的毕赤酵母作为基因表达宿主，不仅避免了原核表达中融合蛋白所造成的宿主表达潜能浪费和形成包涵体，而且免去移除载体蛋白的繁琐程序，并且能够进行蛋白质翻译后加工修饰。
[0021 ] 本发明所用的表达载体自身所带的信号肽能将表达产物直接分泌到培养上清中，易于分离提纯，也易于检测，而且通过AvBD9基因引入的Kex2酶切位点能够进一步提高信号肽的切割效率，产生更多接近于天然结构的成熟肽。
[0022]本发明也根据毕赤酵母的密码子偏好性，对AvBD9的编码基因进行了密码子优化，消除了 AvBD9编码基因在异源表达系统中受密码子利用影响的可能性，由此得到的最佳密码子设计的基因能增加蛋白质产量，使得蛋白生产更有效和经济。
[0023]本发明所使用的表达载体为组成型载体,可持续性分泌表达AvBD9，无需甲醇诱导，也无需生产中甲醇的储存与运输，安全性更高，为今后的分析研究和工业化大规模生产及应用奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1为AvBD9优化后基因全序列；
[0025]图2为重组质粒的PCR鉴定(M:DNA marker DL2000; 1:质粒pGHK a的PCR产物；2:重组质粒pGHK a -AvBD9的PCR产物)；
[0026]图3 为重组酵母菌株的 PCR 鉴定(M:DNA marker DL2000; 1:GS115/pGHK a 的 PCR扩增产物；2-9:GS115/pGHK a -AvBD9菌株的PCR扩增产物)；
[0027]图4为标准蛋白BSA浓度与吸光度相关性曲线；
[0028]图 5 为重组 AvBD9 的 Tricine-SDS-PAGE 分析(M:Protein marker; 1: GSl 15/pGHK a的表达上清；2，3:重组GS115/pGHK a -AvBD9的表达上清)；
[0029]图6为重组AvBD9的抑菌谱；
[0030]图7为所用表达载体质粒pGHK a。
【具体实施方式】
[0031]下面根据附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
[0032]文中所用菌株:
[0033]ATCC美国典型微生物菌种保藏中心
[0034]白色念珠菌(ATCClO23I)Candida albican (ATCC10231)
[0035]金黄色葡萄球菌(ATCC25923)Staphylococcus aureu (ATCC25923)
[0036]粪肠链球菌(ATCC29212)E.faecalis (ATCC29212)
[0037]绿胺假单胞菌Pseudomonas aeruginosa ATCC27853[0038]甲型副伤寒沙门氏菌Salmonella paratyphi A ATCC9150
[0039]鸡白痢沙门氏菌Salmonella pullorum S2
[0040]CMCC中国医学细菌保藏管理中心
[0041]大肠杆菌(CMCC44102)Escherichia coli (CMCC44102)
[0042]阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae CMCC453Ol
[0043]枸橡酸杆菌Citrobacter CMCC48017
[0044]乙型副伤寒沙门氏菌Salmonella paratyphi B CMCC50094
[0045]毕赤酵母GSl 15 购自于 Life Technologies Corporation
[0046]本发明利用毕赤酵母表达系统构建工程菌，组成型分泌表达出AvBD9蛋白，分子量约为5kDa左右，在表达上清中的比列为11.38%，对沙门氏菌、大肠杆菌等食源性病原具有较强的抑菌活性。
[0047]实施例1:
[0048]本发明中采用受体菌为毕赤酵母GS115、载体质粒为pGHKa ;目的基因为经密码子优化的41个氨基酸对应的核苷酸片段；重组质粒构建时，质粒pGHKa的EcoR I和Not I位点之间插入鸡AvBD9目的基因片段；重组质粒经Sac I和Bgl II依次酶切线性化，电转化至高效毕赤酵母GS115感受态细胞；利用MD平板初筛和PCR鉴定筛选出阳性重组子，并经G418抗性筛选高拷贝重组子，然后通过蛋白质表达水平选择出高表达菌株，再进行发酵培养，表达产物直接分泌到胞外，离心所得到的上清液中即含有表达的目的蛋白产物——AvK)90
[0049]实施例2:
[0050]鸡0 -防御素9酵母工程菌制备及表达方法的具体操作步骤如下:
[0051](l)AvBD9基因序列的密码子优化与合成，优化后的基因序列如图1所示，上行:原始序列。下行:密码子优化后序列。加粗字体:改动的碱基。下划线:限制性核酸内切酶切割位点。斜体:蛋白酶Kex2酶切位点编码序列。方框内:终止密码子；
[0052]根据GenBank公布的AvBD9基因序列(登录号:AY534894.1),参考毕赤酵母偏好密码子，在不改变氨基酸序列的前提下利用DNASTAR软件优化基因序列，并在基因的5'端添加EcoR I酶切位点和Kex2酶切位点编码序列AAAAGA，在基因的3'端添加TAA位点和Not I酶切位点，优化后的基因全长为146bp，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
[0053](2)重组表达质粒的构建与鉴定；
[0054]如图2所示，在本发明的相关实验中，用限制性内切酶EcoR I ,Not I双酶切质粒pUC57-AvBD9和载体pGHK a (如图7所示)。胶回收目的产物后经T4DNA Ligase连接，并转化E.coli DH5a，筛选阳性克隆子，以pGl和pG2为引物(pGl:5/ -GTCCCTATTTCAATCAATTGAA-3'和pG2:5' -GCAAATGGCATTCTGACATCC-3'，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)，经PCR验证后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序正确的重组质粒命名为pGHK a -AvBD9。结果表明，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，空质粒载体扩出条带约为462bp，重组表达质粒扩出条带约为572bp，与理论值相符。将含有重组表达质粒的转化菌送样测序，测序结 果表明该转化菌的质粒中确实含有目的基因片段，且读码框正确，则表达质粒pGHK a -AvBD9构建成功。
[0055](3)重组质粒电转化至毕赤酵母GSl 15 ；[0056]将含有重组质粒pGHK a -AvBD9的E.coli DH5 a重组菌大量培养，抽提质粒，并使用Sac I和Bgl II依次酶切除去Amp抗性基因，回收线性化后的目的片段。设置电转化仪的参数为1.5kV、25 ii F和186 Q，并将目的片段电击转化至毕赤酵母GSl 15感受态细胞。
[0057](4)重组酵母工程菌的筛选；
[0058]如图3所示，经MD平板初筛，挑取单菌落，用酵母细胞裂解液裂解细胞获得酵母基因组DNA，以其为模板，用引物pGl和pG2进行PCR鉴定阳性转化子，并点接于含0.5mg/mLG418的YPD平板上筛选高拷贝重组菌，然后通过蛋白质表达水平选择出高表达菌株。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，可见572bp的条带，与预期一致；而经同样处理的空载体重组菌株GS115/pGHKa可见462bp的条带。
[0059](5 )重组AvBD9的表达；
[0060]挑取重组酵母菌株，接种于含有5mL YPD培养基的三角瓶中，于30°C 200rpm培养过夜。取过夜培养物以1%的比列接种于含50mL发酵培养基的500mL三角瓶中，于280C 200rpm 培养 48h。并于 4°C 1000OXg 离心 lOmin，取上清液，即为 AvBD9。
[0061](6)表达上清蛋白浓度的测定
[0062]如图4所示，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒，以牛血清白蛋白(BSA)为标准品，测定不同蛋白浓度下的OD57tol值，以蛋白浓度为X轴，OD570nm值为Y轴，绘制标准蛋白曲线。将各重组菌株的培养上清稀释一定倍数，分别测定其蛋白浓度，比较基因拷贝数与蛋白浓度的关系，并选出闻表达菌株，如下表所不。
[0063]TablelThe concentration of proteins
[0064]
【权利要求】
1.一种优化AvBD9基因，其特征在于，其基因序列如序列表所示。
2.根据权利要求1所述的优化AvBD9基因，其特征在于，所述优化AvBD9基因是将AvBD9基因中的酵母不常用密码子替换成其惯用密码子设计基因序列，并将AvBD9基因在基因的5'端添加EcoR I酶切位点和Kex2酶切位点编码序列AAAAGA，在基因的3'端添加TAA位点和Not I酶切位点所获得的，优化AvBD9基因的基因全长为157bp。
3.—种鸡3 -防御素9毕赤酵母工程菌制备方法，其特征在于，包括步骤: (1)优化AvBD9基因获得； (2)双酶切AvBD9基因与载体pGHKa，连接构建成重组质粒，并转化至转化宿主菌毕赤酵母GS115获得重组酵母菌株。
4.根据权利要求3所述的鸡(6-防御素9毕赤酵母工程菌制备方法，其特征在于，双酶切AvBD9基因与载体pGHK a使用的限制性内切酶为EcoR I和Not I。
5.根据权利要求3所述的鸡(6-防御素9毕赤酵母工程菌制备方法，其特征在于，将步骤(2)获得的重组质粒使用Sac I和Bgl II分别酶切出去Amp抗性基因。
6.根据权利要求3所述的鸡(6-防御素9毕赤酵母工程菌制备方法，其特征在于，所述重组质粒的转化方式为电击转化。
7.—种鸡(6-防御素9毕赤酵母工程菌表达方法，其特征在于，将权利要求3所得的重组酵母菌株经过筛选，发酵培养，离心所得上清液中即为鸡P -防御素9。
8.根据权利要求7所述的鸡P-防御素9毕赤酵母工程菌表达方法，其特征在于，所述筛选是经MD平板初筛，挑取所述重组酵母菌株的单菌落，用酵母细胞裂解液裂解细胞获得酵母基因组DNA，以其为模板，用引物pG 1: 5 ' -GTCCCTATTTCAATCAATTGAA-3 '和pG2:5' -GCAAATGGCAT TCTGACATCC-3'进行PCR鉴定阳性转化子，并点接于含0.5mg/mL G418的YPD平板上筛选高拷贝重组菌。
9.根据权利要求7所述的鸡(6-防御素9毕赤酵母工程菌表达方法，其特征在于，所述的发酵培养是挑取重组酵母菌株的单菌落接种于5mL YPD液体培养基，30°C、200rpm过夜培养，而后转接于50mL MD液体培养基28°C、200rpm振荡培养2天。
10.根据权利要求9所述的鸡(6-防御素9毕赤酵母工程菌表达方法，其特征在于，所述MD培养基包括有I~3%wtD-葡萄糖、1.3~1.4%wtYNB、0.0003~0.0005% wt生物素、0.1~CL 3%wt碳酸钙。
【文档编号】C12P21/02GK103614380SQ201310488740
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年10月18日 优先权日:2013年10月18日
【发明者】祁克宗, 涂健, 张永正, 彭开松, 周秀红, 汪雪雁, 刘红梅, 张明, 陈玎玎, 付瑞燕, 薛秀恒 申请人:安徽农业大学