循环癌细胞的kras致癌基因检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明有关于一种循环癌细胞的KRAS致癌基因检测方法，尤指涉及一种利用加 权型酵素芯片操作平台（Weighted Enzymatic Chip Array, WEnCA)，并合并加权因素的概 念算法所成的方法，特别可用以评估标祀药物-cetuximab疗效。
【背景技术】
[0002] 对基因过渡表现（Overexpression)的分析已经导致疾病诊断的基本进步与临床 进展。而研究基因过渡表现的技术包含有北方墨点法（Northern Blot)、反转录聚合酶链锁 反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)及实时定量聚合酶 链锁反应（Real-Time PCR)。其中Northern Blot由于操作步骤十分敏琐，所需检体量又 过多，因此仅限于研究操作上，无法实际应用于临床诊断。至于RT-PCR及Real-Time PCR 由于操作步骤简便，因此在单一基因检测的应用上，使用相当广泛，例如肝炎病毒的检测及 感染症病原菌的鉴定。然而，虽然PCR序列的创作是作为整体最伟大之实验，但多数PCR技 术仍保有特定的共同问题，其主要问题包含有：其一系污染，过渡灵敏侦察的伪阳性，例如 雾式的DNA或先前的样品残余；其二是RT-PCR仅被认为半定量，因为当比较不同的样品时， 难以控制序列放大的效率；以及其三是由于所需引子（Primer)间黏合（Annearling)的干 扰，无论RT-PCR或Real-Time PCR都仅广泛应用于单一基因标的检测，当检测标的为基因 群时，则PCR相关的技术则有操作耗时、费事及高成本等缺点。
[0003] 随着近几年来生物科技的快速发展，生物芯片于临床医学诊断或药效评估上的应 用逐渐被重视，本发明的先前研究已开发并且评估一尼龙膜芯片（Membrane Array)方 法，能使用于癌症诊断，在血液检体（Peripheral Blood)中同时查出一多种mRNA标记引 物的表达水平。其分子标志的表达水平由RT-PCR与尼龙膜芯片评估，数据从RT-PCR与 尼龙膜芯片取得，且受制于线性回归分析，显示在这两个方法结果之间的高度相互关系 (r = 0. 979, P〈0. 0001)。另外，以相关衍生技术的加权化学冷光型基因芯片（Weighted Chemiluminescent Membrane Array, WCHMA)用于肺癌（Lung Cancer)患者的血液检体分析 标的治疗药物（Target Therapeutic Drug)的作用标的K-ras的异常情形，也已被接受刊 登于肺癌期刊中。
[0004] 虽然尼龙膜芯片于分子诊断及药效评估上的应用已有许多报告提出，然而，由于 原始尼龙膜芯片所使用判读方法上，对于每一基因在特定疾病的重要性皆等值的概念下， 造成检测特异性在达到一定程度之后便不易提升。另外，由于呈色型芯片（Colorimetric Biochip)操作平台所需使用的洋地黄毒（Digoxigenin)系统成本十分昂贵，导致检测成本 过高，再加上芯片操作的高技术门坎，使得即使目前已经发展及评估成熟的诊断芯片仍不 易普及于临床医学应用。故，一般无法符合使用者于实际使用时所需。
【发明内容】
[0005] 本发明的主要目的在于，克服已知技术所遭遇的上述问题并提供一种一种循环癌 细胞的KRAS致癌基因检测方法，是利用加权型酵素芯片操作平台（Weighted Enzymatic Ch i p Array，WEnCA)，并合并加权因素的概念算法所成的检测方法，可用以评估标靶药 物-cetuximab 疗效。
[0006] 为达以上的目的，本发明采用的技术方案是：一种循环癌细胞的KRAS致癌基因检 测方法，该方法至少包含下列步骤：(A )检体前处理步骤：收集待检测的检体，磁珠纯化萃 取得该检体中的讯息核醣核酸（mRNA)，将此mRNA经由反转录为互补脱氧核醣核酸（cDNA) 后，再以酵素标定成探针（Probe) ;(B)制备活化型KRAS检测芯片步骤：将包含22个目标 基因（targetgene)、一组空白对照组（Blank Control 与 Negative control)及一组内部 对照组（Internal Control)三重复点阵于一基材上，在该基材上形成被覆有标定特定核苷 酸探针序列的活化型KRAS检测芯片（Activating KRAS Chip),其中该22个目标基因系为 ATP2A2、ATP6V0B、BCL2、CALM2、CEBPB、CLSTN1、C0L4A1、CXCL11、CXCR4、CYR61、DVL3、E2F4、 ETS1、H2AFZ、L1CAM、LRP1、RAP1B、RPL30、SLC25A5、SPP1、TAF12 及 TBX19 ; (C)杂合反应步 骤：将该A步骤的探针与该活化型KRAS检测芯片进行杂合（Hybridization)反应，使该活 化型KRAS检测芯片表面的标定特定核苷酸探针序列与该A步骤的探针上的酵素进行杂合 处理，并将未反应的探针由芯片上洗净；(D)芯片呈色步骤：将该活化型KRAS检测芯片上杂 合后的探针加上呈色剂进行呈色反应（Color Development);以及（E)分析判读步骤：擷取 该活化型KRAS检测芯片呈色反应后的影像，并对呈色反应后的影像结果进行自动化分析， 将分析后所得的侦测值以基因加权计算方式，依据每个基因对于疾病形成或抗药性发生的 重要性给予个别加权分数（Weighted score),再经由阳性反应（Positive reaction)基因 点乘上基因点的加权值而得到芯片的总分（Total Score)。
[0007] 于本发明上述实施例中，该活化型KRAS检测芯片上所有的基因位点呈数组排列 状。
[0008] 于本发明上述实施例中，该活化型KRAS检测芯片的内部对照组为β -肌动蛋白 (β -actin)〇
[0009] 于本发明上述实施例中，该检体为血液、体液、细胞培养或组织细胞。
[0010] 于本发明上述实施例中，本循环癌细胞的KRAS致癌基因检测方法在评估标靶药 物-cetuximab疗效中的应用。
[0011] 于本发明上述实施例中，该步骤（F)给予该22个目标基因总加权分数为58,当 中 ATP2A2、CXCR4、RAP1B、ATP6V0B、CYR61 与 RPL30 加权分数为 4 分；BCL2、DVL3、SLC25A5、 CALM2、E2F4 与 SPP1 加权分数为 3 分；CEBPB、ETS1、TAF12、CLSTN1、H2AFZ 与 ΤΒΠ 9 加权分 数为2分；以及C0L4A1、L1CAM、CXCL11与LRP1加权分数为1分。
[0012] 于本发明上述实施例中，该步骤（F)是以接受者操作特性曲线（Receiver Operating Characteristic Curve, ROC Curve)方式算出该活化型KRAS检测芯片的阳性反 应的边界值（cutoff value)。
[0013] 于本发明上述实施例中，该阳性反应的边界值为20。
[0014] 于本发明上述实施例中，该基材为玻璃（glass)、聚碳酸酯（polycarbonate, PC) 或尼龙膜（Nylon Membrane)。
【附图说明】
[0015] 图1是本发明的流程方块示意图。
[0016] 图2是本发明的活化型KRAS检测芯片示意图。
[0017] 图3是本发明活化型KRAS检测芯片的基因位置排列示意图。
[0018] 图4是本发明的基因加权示意图。
[0019] 图5是本发明癌症组织反应后的芯片影像不意图。
[0020] 标号说明：
[0021] 活化型KRAS检测芯片1 基材10
[0022] 目标基因11 核苷酸探针序列111
[0023] 空白对照组12 内部对照组13
[0024] 步骤 S111 ~S115
【具体实施方式】
[0025] 请参阅图1至图4所示，分别为本发明的流程方块示意图、本发明的活化型KRAS 检测芯片示意图、本发明活化型KRAS检测芯片的基因位置排列示意图、及本发明的基因 加权示意图。如图所示：本发明为一种循环癌细胞的KRAS致癌基因检测方法，可用以评 估标祀药物-cetuximab疗效，利用加权型酵素芯片操作平台（Weighted Enzymatic Chip Array, WEnCA)，并合并加权因素的概念算法所成的方法，其至少包括下列步骤：
[0026] (A)检体前处理步骤S111 :收集一待检测的检体，于检体中加入裂解缓冲液打 破细胞，萃取得讯息核醣核酸（mRNA)，经由加入磁珠 （Magnetic Particles)与细胞内的 RNA结合，将磁珠上的核酸与裂解缓冲液冲洗分离，继而洗提（Elute)出磁珠上的mRNA，并 将此纯化而得的mRNA经由反转录为互补脱氧核醣核酸（cDNA)后，再以酵素标定成探针 (Probe)，其中，该检体为血液、体液、细胞培养或组织细胞等；
[0027] ⑶制备活化型KRAS检测芯片步骤S112 :如图2所示，将包含数个目标基因 (target gene) 11、一组空白对照组（Blank Control 与 Negative control) 12 及一组内部 对照组（Internal Control) 13三重复点阵于一基材10上，在该基材10上形成被覆有标定 特定核苷酸探针序列111的活化型KRAS检测芯片（Activating KRAS Chip) 1，其中，该基材 为玻璃（glass)、聚碳酸酯（polycarbonate, PC)、或尼龙膜（Nylon Membrane);
[0028] (C)杂合反应步骤S113 :将上述探针与该活化型KRAS检测芯片进行杂合 (Hybridization)反应，使该活化型KRAS检测芯片表面的标定特定核苷酸探针序列与该 探针上的酵素进行杂合处理，并将未反应的探针由芯片上洗净；
[0029] (D)芯片呈色步骤S114 :将该活化型KRAS检测芯片上杂合后的探针加上二氨基联 苯胺（Diaminobenzidine, DAB)呈色剂进行呈色反应（Color Development);以及
[0030] (E)分析判读步骤S115 :擷取该活化型KRAS检测芯片呈色反应后的影像，并对呈 色反应后的影像结果进行自动化分析，将分析后所得的侦测值以基因加权计算方式，依据 每个基因对于疾病形成或抗药性发生的重要性给予个别加权分数（Weighted score)，再经 由阳性反应（Positive reaction)基因点乘上基因点的加权值而得到芯片的总分（Total Score)。如是，藉由上述揭露的流程构成一全新的循环癌细胞的KRAS致癌基因检测方法。
[0031] 本发明在判读时，可对芯片上每一目标基因不同的重要性给予不同程度的加权 (Lung Cancer Ref),另以生物素-抗生物素蛋白（Biotin-Avidin)呈色系统取代原洋地 黄毒（Digoxigenin)系统，建立全新的WEnCA操作平台，另由于此方法易于结合流体控制 平台，以自动化操作系统进行，使得检测时间大幅度降低，并减少