人为操作差异所产生的误 差，进而突破芯片检测技术在商品化过程所面临的瓶颈。
[0032] 为进一步了解循环癌细胞的KRAS致癌基因检测方法于临床医学检测上可作为检 测循环癌细胞的KRAS致癌基因的实用性，本发明于一用以检测KRAS突变（KRAS mutation) 的较佳实施例中，是取得210个临床病理科确认为非小细胞肺癌（Non-small-cell lung carcinoma)及180个大肠直肠癌（Colorectal Cancer, CRC)患者的末梢血液检体，以 上述建构的活化型KRAS检测芯片1利用本方法（配合WEnCA操作平台）的灵敏度（ Sensitivity)、特异性（Specificity)及准确性作为检体中KRAS突变的检测。
[0033] 上述建构的活化型KRAS检测芯片1，如图2所示，是选定与非小细胞肺癌及大肠 直肠癌相关的目标基因，将包含22个目标基因11、该空白对照组12及该内部对照组13三 重复点阵于该基材1〇(如：尼龙膜）上，基因位点排列顺序如图3所示的数组排列状，其 中该 22 个目标基因 11 为 ATP2A2、ATP6V0B、BCL2、CALM2、CEBPB、CLSTN1、C0L4A1、CXCL11、 CXCR4、CYR61、DVL3、E2F4、ETS1、H2AFZ、L1CAM、LRP1、RAP1B、RPL30、SLC25A5、SPP1、TAF12 及TBX19,且该内部对照组13为β-肌动蛋白（β-actin)。上述22个目标基因及内部对 照组β-肌动蛋白的核苷酸探针序列，其序列内容说明书最后显示的基因序列表。
[0034] 实验数据Ν = 200癌症组织，其中包含100个KRAS突变（mutation)癌症组织与 100个野生（wild type)癌症组织，本发明首先整理芯片上22个目标基因点检测具活化型 Κ-ras突变的癌症组织（K_ras mutation cancer tissue)中过渡表现的比例。在这100个 KRAS突变癌症组织中，可将基因加权分数分为四个等级，基因点在80个以上的癌组织中呈 现过渡表现者，加权分数为4 ;在70~80个癌组织中呈现过渡表现者，加权分数为3 ;过渡 表现仅在60~70个癌组织中存在的基因点，加权分数为2 ;若仅能50~60个癌组织中测 得过渡表现的基因点，加权分数为1。如图4所示，该22个目标基因总加权分数为58 ;其 中 ATP2A2、CXCR4、RAP1B、ATP6V0B、CYR61 与 RPL30 加权分数为 4 分；BCL2、DVL3、SLC25A5、 CALM2、E2F4与SPP1加权分数为3分；CEBPB、ETS1、TAF12、CLSTN1、H2AFZ与TBX19加权分数 为2分；以及C0L4A1、L1CAM、CXCL11与LRP1加权分数为1分。经由反应后芯片上阳性反应 的基因数，乘上加权值之后，先计算出每一反应后的芯片的总分，而后同样以组织是否实际 具有可测得的突变点作为标准参考值。并利用接受者操作特性曲线（Receiver Operating Characteristic Curve, ROC Curve)方式算出该活化型KRAS检测芯片的阳性反应的边界 值（cutoff value)为20,此芯片在组织中的检测结果，其灵敏度与准确性可达96%，特异 性亦可达97%。
[0035] 本发明以活化型KRAS检测芯片与直接定序法检测肿瘤组织中KRAS突变，实验数 据N = 210非小细胞肺癌与180大肠直肠癌的病人，如表1所示，可知道与目前常用的直接 定序法结果比较后发现，活化型KRAS检测芯片对于检测肿瘤组织中KRAS突变的灵敏度与 特异性均大于90%，且P值< 0.001。
[0036] 表 1
[0037]
[0038] 上表1中95% CI代表95 %信赖区间。
[0039] 请参阅图5所示，为本发明癌症组织反应后的芯片影像示意图。如图所示：为上述 癌症组织反应后的芯片影像图，包含图中左侧的带有K-ras基因突变的癌症组织（cancer tissue with K-ras mutation),以及右侧的带有野生K-ras基因的癌症组织（cancer tissue with wild type K-ras)。经结果显示可知，带有K-ras基因突变的癌症组织于芯 片反应结果为阳性（Positive)，而带有野生K-ras基因的癌症组织于芯片反应结果为阴性 (Negative)〇
[0040] 本发明于另一用以检测治疗F0LF0X_4plus Cetuximab后是否会复发（Relapse) 的较佳实施例中，是取210大肠直肠癌病人（colorectal cancer patients)为实验数据n， 其结果如下表2-表4所示，当活化型KRAS检测芯片结果为阴性，则表示病人复发的机率较 低。
[0041] 表 2
[0042]
[0045] 表 4
[0046]
[0047] 据此，本发明系揭露可提供一快速、精确、灵敏、低成本、大量分析且易于结合自动 化的WEnCA操作平台的方法，可进行快速生物检体检测分析，完成传统生医检测上所无法 达成的目标。由于本发明不需大型离心机，因此易于在各个实验操作，并易于自动化，且采 用包含Poly-T引子的磁珠以利萃取的mRNA纯度更高，使反应后的芯片背景值降低，准确度 高。此外，本发明以Biotin-Avidin取代Digoxigenin，不仅使用的酵素成本低，且以DAB作 为呈色剂的稳定度亦高，颜色容易保存；再者，本发明亦在最后的结果判读上以基因加权计 算值的决定方式，配合ROCCurve决定阳性判读标准，经上述临床测试结果显示本方法的准 确度系能更准确地辅助疾病的诊断。因此本发明可于临床上提高诊断灵敏性、特异性及准 确性的同时，加上若结合自动化操作系统更可使检测时间大幅降低，并减少人为操作误差， 以达突破芯片检测技术在商品化过程所面临的瓶颈。
[0048] 综上所述，本发明的一种循环癌细胞的KRAS致癌基因检测方法，可有效改善 现有技术的种种缺点，其利用加权型酵素芯片操作平台（Weighted Enzymatic Chip Array, WEnCA)，并合并加权因素的概念算法，可用以评估标革E药物-cetuximab疗效，提供 一快速、精确、灵敏、低成本、大量分析且易于自动化的WEnCA操作平台的方法，以进行快速 生物检体检测分析，完成传统生医检测上所无法达成的目标，进而使本发明能产生更进步、 更实用、更符合使用者所须，确已符合发明专利申请的要件，依法提出专利申请。
[0049] 惟以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，当不能以此限定本发明实施的范围； 故，凡依本发明申请专利范围及发明说明书内容所作的简单的等效变化与修饰，皆应仍属 本发明专利涵盖的范围内。
[0050] 文中提及的22个目标基因及内部对照组β-肌动蛋白的核苷酸探针序列：
[0051]
【主权项】
1. 一种循环癌细胞的KRAS致癌基因检测方法，其至少包含下列步骤： (A) 检体前处理步骤：收集待检测的检体，磁珠纯化萃取得该检体中的讯息核醣核酸， 将此讯息核醣核酸经由反转录为互补脱氧核醣核酸后，再以酵素标定成探针； (B) 制备活化型KRAS检测芯片步骤：将包含22个目标基因、一组空白对照组及一组 内部对照组三重复点阵于一基材上，在该基材上形成被覆有标定特定核苷酸探针序列的 活化型KRAS检测芯片，其中该22个目标基因为ATP2A2、ATP6V0B、BCL2、CALM2、CEBPB、 CLSTN1、C0L4A1、CXCL11、CXCR4、CYR61、DVL3、E2F4、ETS1、H2AFZ、L1CAM、LRP1、RAP1B、RPL30、 SLC25A5、SPP1、TAF12 及TBX19 ; (C) 杂合反应步骤：将A步骤的探针与该活化型KRAS检测芯片进行杂合反应，使该活 化型KRAS检测芯片表面的标定特定核苷酸探针序列与该A步骤的探针上的酵素进行杂合 处理，并将未反应的探针由芯片上洗净； (D) 芯片呈色步骤：将该活化型KRAS检测芯片上杂合后的探针加上呈色剂二氨基联苯 胺进行呈色反应；以及 (E) 分析判读步骤：擷取该活化型KRAS检测芯片呈色反应后的影像，并对呈色反应后 的影像结果进行自动化分析，将分析后所得的侦测值以基因加权计算方式，依据每个基因 对于疾病形成或抗药性发生的重要性给予个别加权分数，再经由阳性反应基因点乘上基因 点的加权值而得到芯片的总分。2. 如权利要求1所述的循环癌细胞的KRAS致癌基因检测方法，其特征在于，所述活化 型KRAS检测芯片上所有的基因位点呈数组排列状。3. 如权利要求1所述的循环癌细胞的KRAS致癌基因检测方法，其特征在于，所述活化 型KRAS检测芯片的内部对照组为β-肌动蛋白。4. 如权利要求1所述的循环癌细胞的KRAS致癌基因检测方法，其特征在于，所述检体 为血液、体液、细胞培养或组织细胞。5. 如权利要求1所述的循环癌细胞的KRAS致癌基因检测方法，其特征在于，所述步骤 (F)系给予该22个目标基因总加权分数为58,当中ATP2A2、CXCR4、RAP1B、ATP6V0B、CYR61 与RPL30加权分数为4分；BCL2、DVL3、SLC25A5、CALM2、E2F4与SPP1加权分数为3分； CEBPB、ETS1、TAF12、CLSTN1、H2AFZ与ΤΒΠ9 加权分数为 2 分；以及C0L4A1、L1CAM、CXCL11 与LRP1加权分数为1分。6. 如权利要求1所述的循环癌细胞的KRAS致癌基因检测方法，其特征在于，所述步骤 (F)以接受者操作特性曲线方式算出该活化型KRAS检测芯片的阳性反应的边界值。7. 如权利要求6所述的循环癌细胞的KRAS致癌基因检测方法，其特征在于，所述阳性 反应的边界值为20。8. 如权利要求1所述的循环癌细胞的KRAS致癌基因检测方法，其特征在于，所述基材 为玻璃、聚碳酸酯或尼龙膜。9. 如权利要求1所述的循环癌细胞的KRAS致癌基因检测方法在评估标靶药 物-cetuximab疗效中的应用。
【专利摘要】一种循环癌细胞的KRAS致癌基因检测方法，该方法至少包含检体前处理步骤、制备活化型KRAS检测芯片步骤、杂合反应步骤、芯片呈色步骤、以及分析判读步骤，而该活化型KRAS检测芯片包含将22个目标基因(target？gene)、一组空白对照组(Blank？Control与Negative？control)及一组内部对照组(Internal？Control)三重复点阵于一基材上，在该基材上形成被覆有标定特定核苷酸探针序列的活化型KRAS检测芯片(Activating？KRAS？Chip)。藉此，利用加权型酵素芯片操作平台(WEnCA)，并合并加权因素的概念算法，可用以评估标靶药物-cetuximab疗效，提供一快速、精确、灵敏、低成本、大量分析且易于自动化的WEnCA操作平台的方法，以进行快速生物检体检测分析，完成传统生医检测上所无法达成的目标。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105483209
【申请号】CN201410481668
【发明人】王照元, 黄旼仪, 林绣茹, 颜里真, 张家源
【申请人】辅英科技大学附设医院
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年9月19日