尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性测定试剂盒及其方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于生命科学领域，涉及一种试剂盒，具体涉及一种尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性测定试剂盒及其方法。
【背景技术】
[0002]尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶是生物体糖原合成过程中的关键酶。在葡萄糖合成糖原前催化葡萄糖活化，将1-磷酸葡萄糖与UTP分子合成为UDP-葡萄糖(UDPG)。
[0003]目前尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的测定方法主要是酶偶联法，提取方法不尽相同，很多文献报道的提取方法繁琐，成分复杂，测定体系大，操作不够简便快捷。现需要专门研制一种试剂盒，可以简便、快速、准确的对尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶进行测定。
【发明内容】
[0004]为了克服现有技术的缺陷，本发明旨在提供一种尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性测定试剂盒及其方法，可快速准确的对尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性进行测定。
[0005]为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现:
尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性测定试剂盒，包括以下试剂:
提取液，50mL X 1瓶，4°C保存，由一定量的Tr i s、蒸馏水、HC1、乙二胺四乙酸二钠盐、DTT和蔗糖混匀后制成；
试剂一，液体25mL X 1瓶，4°C避光保存，由一定量的所述提取液、蒸馏水、MgCl2、UDPG混匀后制成；
试剂二，粉剂X 1瓶，_20°C避光保存，由一定量的NADP组成；
试剂三，粉剂X 1瓶，_20°C避光保存，由一定量的6-磷酸葡萄糖脱氢酶组成；
试剂四，粉剂X 1瓶，_20°C避光保存，由一定量的磷酸葡萄糖变位酶组成；
试剂五，液体5mLX 1瓶，4°C保存，由一定量的PPi与蒸馏水溶解后制成。
[0006]进一步的，所述提取液，是由63mL蒸馏水溶解0.38g Tris，加HC1调pH为7.5后，取其中50mL该混合溶液，加入18.6mg乙二胺四乙酸二钠盐、15.4mg DTT和5g蔗糖充分混匀后制成；
进一步的，所述试剂一，是由剩余13mL上述混合溶液再加入13mL蒸馈水、10.2mg MgCb和16mg UDPG混匀后制成；
进一步的，所述试剂二中，NADP的质量为21mg;
进一步的，所述试剂三中，6_磷酸葡萄糖脱氢酶的质量为12.5mg；
进一步的，所述试剂四中，磷酸葡萄糖变位酶的质量为5mg;
进一步的，所述试剂五中，PPi的质量为44.6mg，蒸馈水的体积为5mL。
[0007]尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGP)可逆催化反应生成1磷酸葡萄糖，在磷酸葡萄糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶作用下将NADP转化为NADPH，340nm的吸光值增加速率反映了 UGP活性。
[0008]—种采用上述试剂盒且基于分光光度法的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性测定方法，包括以下步骤:
步骤1仪器和用品的准备；
天平、低温离心机、研钵、紫外分光光度计、1 mL石英比色皿；
步骤2试剂的配制；
所述试剂二在临用前加5mL蒸馏水充分溶解，制成试剂二水溶液；
所述试剂三在临用前加5 mL蒸馏水充分溶解，制成试剂三水溶液；
所述试剂四在临用前加5 mL蒸馏水充分溶解，制成试剂四水溶液；
步骤3样本中粗酶液的提取；
1)组织:按照质量(g):提取液体积(mL)为1:(5?10)的比例加入所述提取液，冰浴匀浆后于4°C，12000rpm离心lOmin，取上清，即粗酶液，并置于冰上待测；
2)细胞:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为(500?1000 ): 1的比例，冰浴超声波破碎细胞，然后4°C，12000rpm离心lOmin，取上清，即粗酶液，并置于冰上待测；
3)液体:直接检测；
步骤4尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性的测定操作；
1)分光光度计预热30min，调节波长至340nm，蒸馈水调零；
2)取lmL石英比色皿，依次加入500yL所述试剂一、lOOyL所述试剂二水溶液、lOOyL所述试剂三水溶液、lOOyL所述试剂四水溶液、lOOyL所述试剂五和lOOyL所述粗酶液，充分混匀，记录340nm处30s的吸光值AjP330s的吸光值Α2，ΔΑ=Α2-Αι ；
步骤5尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性的计算；
1)按照组织样本蛋白浓度计算:
酶活单位定义:每毫克组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADP定义为一个酶活力单位； UGP(U/mg prot)=AA^(eXd)XV^^(V#XCpr)^T=321.54X ΔΑ + Cpr;
2)按照组织样本质量计算:
酶活单位定义:每克组织每分钟消耗1 nmol的NADP定义为一个酶活力单位； UGP(U/g)=AA^(eXd)XV^^(ff XV样+%?) +T=321.54X ΔA+W;
3)按照细胞数量计算:
酶活单位定义:每104个细胞每分钟消耗1 nmol的NADP定义为一个酶活力单位；UGPCU/104。611)=厶八+(￡\(1)\￥反总 + (%\细胞数量 + %总)+T = 321.54ΧΔΑ+细胞数量；
4)按照液体体积计算；
酶活单位定义:每毫升液体每分钟消耗1 nmol的NADP定义为一个酶活力单位； UGP(U/mL)= Δ A+ (ε X d) X細+乂样+Τ=321.54 X Δ A;
其中，VM^=lmL，表示反应体系总体积；
ε=6.22X 103 L / mol /cm，表示NADPH的摩尔消光系数；
d=1 cm，表示比色皿光径；
^m=l mL，表示加入提取液体积；
V样=0.lmL，表示加入样本体积；
T=5min，表示反应时间； w表示样本鲜重，单位为g ；
Cpr表示样本蛋白浓度，单位为mg/mL。
[0009]进一步的，步骤三中，冰浴超声波破碎细胞的方法为将功率设置为300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min。
[0010]本发明的有益效果是:
1、使用本发明的试剂盒测定尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶是所用到的仪器和用品相对较为普遍，对测定条件的要求也较低，符合普通实验室的测定条件。
[0011 ] 2、本发明的方法在现有的酶偶联法基础上，将提取液成分及提取步骤简化，提取液成分及浓度的调整达到了提取更加充分的效果，并且在低温保存时间延长。
[0012]3、本发明的测定体系较小，所需样本量以及测定试剂量少，适用于珍贵样本测定。
[0013]4、本发明的检测过程中大部分试剂使用体积一致，且检测时间较短，达到了测定过程的简单化和快捷化效果。
[0014]5、本发明的方法大大降低了检测成本，并且检测结果灵敏可靠。
[0015]上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明。本发明的【具体实施方式】由以下实施例详细给出。
【具体实施方式】
[0016]下面将结合实施例，来详细说明本发明。
[0017]一种尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性测定试剂盒，包括以下试剂:
提取液，50mL X 1瓶，4°C保存，由0.38g Tris与63mL蒸馏水溶解，加HC1调pH为7.5后配制成混合溶液，取其中50mL该混合溶液，加入18.6mg EDTA.2Na、15.4mg DTT和5g蔗糖充分混勾后制成；
试剂一，液体25mL X 1瓶，4°C避光保存，由剩余13mL上述混合溶液再加入13mL蒸馏水、10.2mg MgCh和 16mg UDPG混匀后制成；
试剂二，粉剂X 1瓶，_20°C避光保存，由2 lmg NADP组成；
试剂三，粉剂X 1瓶，_20°C避光保存，由12.5mg 6-磷酸葡萄糖脱氢酶组成；
试剂四，粉剂X 1瓶，_20°C避光保存，由5mg磷酸葡萄糖变位酶组成；
试剂五，液体5mLX 1瓶，4°C保存，由44.6mg PPi与5mL蒸馏水溶解后制成。
[0018]尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGP)可逆催化反应生成1磷酸葡萄糖，在磷酸葡萄糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶作用下将NADP转化为NADPH，340nm的吸光值增加速率反映了 UGP活性。
[0019]—种采用上述试剂盒且基于分光光度法的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性测定方法，通过如下三种实施例来说明。
[0020]实施例一
步骤1仪器和用品的准备；
天平、低温离心机、研钵、紫外分光光度计、1 mL石英比色皿；
步骤2试剂的配制；
所述试剂二在临用前加5mL蒸馏水充分溶解，制成试剂二水溶液； 所述试剂三在临用前加5 mL蒸馏水充分溶解，制成试剂三水溶液；
所述试剂四在临用前加5 mL蒸馏水充分溶解，制成试剂四水溶液；
步骤3组织样本中粗酶液的提取；
按照质量(g):提取液体积(mL)为1:(5?10)的比例加入所述提取液，冰浴匀浆后于4°C，12000rpm离心lOmin，取上清，即粗酶液，并置于冰上待测；
步骤4尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性的测定操作；
1)分光光度计预热30min，调节波长至340nm，蒸馈水调零；
2)取lmL石英比色皿，依次加入500yL所述试剂一、lOOyL所述试剂二水溶液、lOOyL所述试剂三水溶液、lOOyL所述试剂四水溶液、lOOyL所述试剂五和lOOyL所述粗酶液，充分混匀，记录340nm处30s的吸光值AjP330s的吸光值Α2，ΔΑ=Α2-Αι ；
步骤5按照组织蛋白浓度计算尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性；
酶活单位定义:每毫克组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADP定义为一个酶活力单位； UGP(U/mg prot)=AA^(eXd)XV^^(V#XCpr)^T=321.54X ΔΑ + Cpr;
其中，VM^=lmL，表示反应体系总体积；
ε=6.22X 103 L / mol /cm，表示NADPH的摩尔消光系数；
d=1 cm，表示比色皿光径；
V样=0.lmL，表示加入样本体积；
T=5min，表示反应时间；
Cpr表示样本蛋白浓度，单位为mg/mL。
[0021]
实施例二
步骤1仪器和用品的准备；
天平、低温离心机、研钵、紫外分光光度计、1 mL石英比色皿；
步骤2试剂的配制