水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次； b、 弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经1000 Orpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清； c、 将b中上清进行醇沉，上清即得粗制中药黄酮； d、 将c中粗制中药黄酮进行减压真空浓缩，浓缩物用次灭菌注射用水稀释清洗，再次进 行减压真空浓缩，如此三次后，最后经0.22um滤膜过滤除菌，然后经冷冻真空干燥即得到中 药黄酮。
[0018] 所述的一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的法氏囊素通过以 下步骤制得：将法氏囊组织剔除筋膜和脂肪组织，PH7.2灭菌冷PBS洗净，按1:1比例加入 pH7.2灭菌冷PBS，在组织匀浆机中进行高速匀浆，匀浆液中加入占2.5%重量的胰蛋白酶，反 复冻融3次，12000rpm离心20min，弃沉淀，上清用1000 da截留分子量的超滤膜进行超滤，膜 下液经0.22um滤膜过滤除菌，滤过液即为法氏囊素粗提液，粗提液经冷冻真空干燥得到法 氏囊素。
[0019] 所述的一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的卵黄抗体采用禽 流感高效浓缩灭活疫苗免疫蛋鸡，分离卵黄，酸化提取后经真空冷冻干燥制得。
[0020] 所述的一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的每份免疫增强剂 含有中药黄酮16~24g、卵黄抗体7~9g和法氏囊素8~12mg。
[0021 ]本发明中桑米特家畜水包油包水佐剂由珠海国年生物科技有限公司生产销售。
[0022] 本发明具有以下有益效果： 1.本发明所制备的稀释液接种鸡胚后，可提高鸡胚耐受病毒的能力，延长死亡时间，BP 延长了病毒增殖时间，与现有技术相比提高了病毒滴度8倍以上。
[0023] 2.本发明采用了新的疫苗佐剂，所制备的疫苗具有油包水、水包油双重特性，兼具 了疫苗的缓释作用以及水溶性免疫增强剂、卵黄抗体等共同作用的优点。
[0024] 3.本发明采用了有效的免疫增强剂，大幅度提高了机体的免疫力，提高体液免疫 能力，刺激机体广生尚效的中和抗体，提尚了机体预防疾病的能力。
【具体实施方式】
[0025]为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解， 这些实施例仅用于说明本发明而不用于限止本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实 验方法，通常按常规实验方法进行。
[0026] 实施例1 一种禽流感病毒稀释液，该病毒稀释液每1000 ml磷酸缓冲液中含有:氨基酸组合6g(甘 氨酸〇.6g、烟酰胺1.8g、亮氨酸2.4g、抗坏血酸1.2g)、复方中药黄酮15g、脂质体15g，该稀释 液pH为6.9。
[0027] -种禽流感病毒稀释液的制备方法，其步骤是： (1)磷酸缓冲溶液的配制:按上述磷酸盐缓冲液配方准确称取氯化钠 Sg，氯化钾0.2g， 磷酸氢二钠1.15g，磷酸二氢钾0.2g，氯化钙0.1 g，含6个结晶水的氯化镁0.1 g溶于1000ml双 蒸水中，无菌条件下通过0.22μπι滤膜，过滤除菌备用。
[0028] (2)复方中药黄酮的制备 a、按黄连30份、苦参20份、椿白皮10份、白薇20份、龙胆草10份和夏枯草20份称取所述 中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90°C，并保 持在90°C，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次。
[0029] b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经1000 Orpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上 清。
[0030] c、将b中上清进行醇沉，上清即得粗制中药黄酮； d、将c中粗制中药黄酮进行减压真空浓缩，浓缩物用次灭菌注射用水稀释清洗，再次进 行减压真空浓缩，如此三次后，最后经〇. 22um滤膜过滤除菌，然后经冷冻真空干燥即得到中 药黄酮。
[0031 ] (3)脂质体制备 按大豆卵磷脂3重量份和甘氨胆酸1重量份称取大豆卵磷脂和甘氨胆酸，用氯仿进行溶 解，并使其混合均匀，并通过减压法去除溶液中氯仿，制备脂质体膜;配制PH值为7.0~8.0、 浓度为〇. lm/1的枸橼酸和枸橼酸钾缓冲溶液，将该缓冲溶液加入到脂质体膜溶液中，脱水 后用匀浆机制备成脂质体。
[0032] (4)病毒稀释液配制 按上述优选稀释液组分数准确称取甘氨酸〇.6g、烟酰胺1.8g、亮氨酸2.4g、抗坏血酸 1.2g、复方中药黄酮15g、脂质体15g，按比例溶解于步骤(1)中的1000 ml磷酸缓冲溶液中，充 分混匀，用酸或碱调节pH至6.9，无菌条件下通过0.22μπι滤膜，过滤除菌后置4°C保存备用。
[0033] 实施例2 一种禽流感病毒稀释液，该病毒稀释液每1000 ml磷酸缓冲液中含有:氨基酸组合Sg(甘 氨酸1.6g、烟酰胺1.6g、亮氨酸2.4g、抗坏血酸2.4g)、复方中药黄酮18g(从黄连20份、苦参 15份、椿白皮10份、白薇25份、龙胆草15份和夏枯草15份中提取得到）、脂质体20g(按实施例 1制得），该稀释液PH为7.2。
[0034] -种禽流感病毒稀释液的制备方法，其步骤同实施例1。
[0035] 实施例3 一种禽流感病毒稀释液，该病毒稀释液每1000 ml磷酸缓冲液中含有：氨基酸组合IOg (甘氨酸2.5g、烟酰胺3.0g、亮氨酸3.0g、抗坏血酸1.5g)、复方中药黄酮5g(从黄连35份、苦 参5份、椿白皮15份、白薇10份、龙胆草20份和夏枯草15份中提取得到）、脂质体10g(按实施 例1制得），该稀释液pH为7.5。
[0036] -种禽流感病毒稀释液的制备方法，其步骤同实施例1。
[0037] 实施例4:采用上述稀释液稀释病毒接种鸡胚与常用稀释液稀释病毒接种鸡胚各 项指标的比较。
[0038] 1)取实施例2得到的禽流感病毒稀释液。
[0039] 2)常用病毒稀释液及其配制，即生理盐水，按常规技术进行配制。
[0040] 3)鸡胚接种与培养繁殖 (1) 接种鸡胚的选择:选择发育良好的9日龄SPF鸡胚，2000枚； (2) 接种:将本例（1)中的2000枚9日龄SPF鸡胚分为2组，第一组采用本发明病毒稀释液 进行操作接种，第二组采用常规技术配制的病毒稀释液进行病毒稀释和接种，两组稀释倍 数相同。
[0041 ] ( 3)孵育和观察、收获、病毒悬液检验。
[0042] 4)两组方法接种鸡胚后死亡集中时间与数量，见表1。
[0043] 第一组:为本发明组，采用9日龄鸡胚接种。
[0044] 第二组:为常规技术稀释液组，采用9日龄鸡胚接种。
[0045] 5)两组方法接种鸡胚后病毒收获量及其病毒含量，见表2。
[0046]综上所述，与传统技术相比，采用本发明方法可提高病毒含量8倍以上，同时还提 高了鸡胚液收获量30%~40%。
[0047]实施例1和3中得到的稀释液进行实施例4相同的试验，其最终结果也能够达到与 实施例4相同的技术效果，可提高病毒含量8倍以上，同时还提高了鸡胚液收获量30%~40%。 [0048]实施例5中药黄酮的制备 a、 按金钱草10~30份，穿心莲10~30份，地锦草20~40份，金银花10~20份，白头翁10 ~30份，半边莲10~30份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量 15倍的纯化水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次； b、 弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经1000 Orpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清； c、 将b中上清进行醇沉，上清即得粗制中药黄酮； d、 将c中上清进行减压真空浓缩，浓缩物用次灭菌注射用水稀释清洗，再次进行减压真 空浓缩，如此三次后，最后经0.22um滤膜过滤除菌，然后经冷冻真空干燥即得到中药黄酮。 [0049]实施例6法氏囊素的制备 a、取健康法氏囊组织，将法氏囊组织剔除筋膜和脂肪组织，pH7.2灭菌冷PBS洗净。 [0050] b、称量法氏囊重量，按I: I(W: V)比例加入pH 7.2灭菌冷PBS，在组织匀浆机中进行 高速匀浆。
[00511 C、匀浆液中加入2.5%的胰蛋白酶，反复冻融3次，12000rpm离心20min，弃沉淀。
[0052] d、上清用1000 da截留分子量的超滤膜进行超滤，膜下液即为法氏囊素粗提液。 [0053] e、将d中粗提液通过0.22um滤膜过滤除菌，然后经冷冻真空干燥即得到法氏囊素。
[0054] 实施例7卵黄抗体制备 a、用禽流感高效浓缩灭活疫苗免疫健康蛋鸡。免疫程序为首次胸部肌肉免疫0.5ml/ 只；首免一周后进行二次免疫，胸部肌肉免疫I .Oml/只；二次免疫后两周进行三次免疫，胸 部肌肉免疫1.0ml/只。
[0055] b、三次免疫后两周开始监测高免蛋抗体效价，当高免蛋中抗猪繁殖与呼吸综合征 病毒卵黄抗体琼