用于氧输送的组合物及方法
【专利说明】用于氧输送的组合物及方法 本申请是申请日为2007年5月21日、申请号为200780027798. 7、题为"用于氧输送的 组合物及方法"的专利申请的分案申请。 相关申请的交叉引用
[0001] 本申请要求 2006 年 5 月 22 日由 Michael A. Marietta、Stephen P. L. Cary、 Elizabeth M. Boon 和 Jonathan A. Winger 提交的题目为 "Engineering H-NOX Proteins for Therapeutic Nitric Oxide and Oxygen Delivery" 的美国临时申请序列号 60/921,505(美国案件号B06-084)的权益。该美国临时申请于2007年5月1日从2006年 5月22日提交的美国实用申请序列号11/440, 588转化为临时申请，其公开内容通过引用被 各自由此并入。 关于联邦资助研宄或开发的声明
[0002] 本研宄由资金号DE-AC03-76SF资助。美国政府在授予本申请的任何专利中可能 具有权利。
技术领域
[0003] 本申请涉及H-NOX蛋白和使用它们输送氧的方法。H-NOX蛋白提供了一种新的治 疗工具，用于向人类输送O 2，并用于兽医的目的向动物输送〇2。 发明背景
[0004] 当前的血库系统具有内在的风险和严重的局限性。血液分型错误、免疫原性、细菌 试剂的传播、和诸如Hiv-I和肝炎的病毒感染将威胁生命的危险摆在输血患者的面前。此 外，受限的供血者可用性、对特殊血型的需求、红细胞短暂的保存期、和对冷冻的需要都限 制了患者输血的可达性。稳定的血液代用品的开发能消除目前血库系统的风险，并在大多 数情况下提高患者输血的可用性。因此，向器官和组织输送氧气（O 2)以缓解由于失血或缺 氧引起的症状是主要的治疗目标。
[0005] 在美国，没有基于血红蛋白的疗法被批准用于人类。潜在的疗法包括多种人 工 O2载体（由 Spahn，D.R.等人（2005)，"Artificial 02carriers:status in 2005，" Curr. Pharm. Des. 11(31) :4099-4114综述），例如工程改造的血红蛋白（例如，美国专利号 6, 022, 849)。然而，一些潜在的血液代用品，如基于血红蛋白的血液代用品，由于它们与一 氧化氮（NO)的反应性而受限。具体而言，NO在体内多种重要过程的调控中作为化学信使 发挥作用，包括神经传导、炎症、血小板凝集和胃肠及血管平滑肌紧张度的调节。NO直接与 结合到血红蛋白的O 2反应，形成高铁血红蛋白和硝酸盐。血红素铁和NO都通过结合的氧 原子被氧化，并且反应发生地如此迅速以至于没有观察到〇 2被NO代替（参见，例如美国专 利号 6, 455, 676)。
[0006] 由于NO被持续地产生并消耗，体内有天然的NO周转（turnover)。当给予无细胞 的血红蛋白时，NO产生与消耗之间的平衡通过与无细胞的血红蛋白的反应而被改变。NO与 结合到血红蛋白的O 2之间的氧化反应是不可逆的，导致N0、0 2和血红蛋白的破坏。因为亚 硝酰血红蛋白解离的半衰期是5-6小时，NO结合到没有O2结合的血红蛋白在生理时标中是 有效不可逆的，由此有效失活作为无细胞O2载体的血红蛋白。
[0007] -旦NO分子与血红蛋白反应，它被从信号分子库中消除，由此引起某些不利状 况。例如，NO与血红蛋白（有或没有O 2结合）的结合可以阻止血管舒张并潜在地导致高血 压，这有时在某些细胞外血红蛋白溶液给药后被观察到。
[0008] 介导某些炎症反应也需要N0。例如，由内皮产生的NO抑制血小板凝集。结果，由 于NO被无细胞的血红蛋白（具有或没有O 2结合）结合，血小板凝集可能增加。随着血小板 凝集，它们释放有效的血管收缩化合物，如血栓烷AjP血清素。这些化合物可与由血红蛋白 清除引起的降低的NO水平协同起作用，以产生显著的血管收缩。除了抑制血小板凝集，NO 也抑制中性粒细胞（neutrophil)附着于细胞壁，该附着反过来可导致细胞壁损伤。内皮细 胞壁损伤已经在某些血红细胞溶液输注中观察到。
[0009] 基于血红蛋白的血液代用品的另一个主要缺点是它们对O2的尚亲和性。该尚亲 和性限制了血红蛋白在期望的位置（如外周组织）以临床有用的速率释放氧气的能力。可 选地，在到达微血管床之前由主动脉中较低亲和性的基于血红蛋白的血液代用品引起的O 2 释放可能由于高氧性血管收缩反应而引起血管收缩（Winslow假设）。此外，基于血红蛋白 的血液代用品受到无细胞的血红蛋白从血浆中快速清除的限制，所述清除是由于从血浆中 清除无细胞的血红蛋白的血红蛋白受体的存在所致。无细胞的血红蛋白也可能引起肾脏中 毒，可能是由于肾小球中的NO耗尽，引起收缩和后续的机能障碍。
[0010] 由于目前血液代用品的局限性和捐献血液的长期缺乏，仍对其它或替代性的用于 输送氧的疗法存在显著的兴趣和需要。具体而言，具有较低NO反应性和/或较长的血浆保 留时间的血液代用品是期望的。也需要O2结合解离常数或解离速率（off rate)适合于具 体临床或工业应用的氧载体。其中〇2载体是期望的示例性工业应用包括细胞在培养基中 的生长，这通常被到达细胞的〇 2量限制。 发明概述
[0011] 本发明部分基于这样惊人的发现：野生型和突变H-NOX蛋白具有比血红蛋白低得 多的NO反应性，并因此是理想的O 2载体。如果希望，突变可以被引入H-NOX蛋白，以改变 它们对〇2和NO配体的结合，以进一步优化H-NOX蛋白作为0 2载体的应用。
[0012] 一方面，本发明以突变H-NOX蛋白为特征。因此，在一些实施方式中，本发明提供 了具有至少一个突变的分离的H-NOX蛋白，与相应野生型H-NOX蛋白的O 2解离常数或NO反 应性比较，所述突变改变了 O2解离常数或NO反应性。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白 的〇2解离常数在血红蛋白的〇 2解离常数的2个数量级之内，并且突变H-NOX蛋白的NO反 应性比血红蛋白的NO反应性低至少10倍。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的O 2解离 常数在20°C下在约2nM到约50 μ M之间，在20 °C下在约50nM到约10 μ M之间，在20°C下 在约20nM到约2 μΜ之间，在20°C下在约IOOnM到约1. 9 μΜ之间，在20°C下在约150nM到 约1 μΜ之间，或者在20°C下在约IOOnM到约255nM之间。在一些实施方式中，突变H-NOX 蛋白的O2解离常数在20°C下小于约80nM，例如在20°C下在约20nM到约75nM之间。在一 些实施方式中，突变H-NOX蛋白的NO反应性比血红蛋白的NO反应性低至少100倍，例如， 比血红蛋白的NO反应性低至少1000倍。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的NO反应性 在 20°C下小于约 700s-1，例如，在 20°C下小于约 600s'500s'400s'300s'200s'100s' 75s \50s \25s \20s \l0s \50s \3s \2s \l. 8s \l. 5s \l. 2s \l. Os \〇. 8s \〇. 7s 1 或0· 6s'在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白对氧的kQff(k解离）在20°C下在约0· Ol到约 20084之间，例如在约LOs η到约16. Os η之间。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的0 2 解离常数在20°C下在约IOOnM到约1.9μΜ之间，并且突变H-NOX蛋白对氧的、"在20°〇下 在约I. 35s4到约14. 5s4之间。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在 37°C下小于约Ih'在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白对氧的匕"在20°〇下在约1.35s 4 到约14. 5s4之间，并且突变H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在37°C下小于约lh'在一些 实施方式中，突变H-NOX蛋白对氧的、"在20°C下在约I. 35s η到约14. 5s η之间，并且突 变H-NOX蛋白的NO反应性在20°C下小于约700s4 (例如，在20°C下小于约600s'500s' IOOs4、20s4或I. 8s _〇。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在37°C 下小于约ItT1，并且突变H-NOX蛋白的NO反应性在20°C下小于约700s4 (例如，在20°C下 小于约 600s \500s \100 s 1JOs 1 或 I. 8s 〇。
[0013] 在一些实施方式中，本发明的特征在于具有至少一个突变的分离的H-NOX蛋白， 与相应野生型H-NOX蛋白相比，所述突变改变对氧的匕"或NO反应性。在一些实施方式 中，突变H-NOX蛋白对氧的1^在20°C在约0.0 ls ―1到约200s ―1之间，并且突变H-NOX蛋白 的NO反应性比血红蛋白的NO反应性低至少10倍。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白在 20°C具有小于或等于约0. 65s4 (例如，在20°C在约0. 21s4到约0. 65s η之间）的对氧的 Ictjff。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白由腾冲嗜热厌氧菌（T. tengcongensis)蛋白衍生 并在20°C具有约1.35 ?Γ1到约18JT1的对氧Iitjff。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的NO 反应性比血红蛋白的NO反应性低至少100倍，例如，比血红蛋白低至少1000倍。在一些实 施方式中，突变H-NOX蛋白的NO反应性在20°C小于约700s 4,例如在20°C小于约600s' 500s \400s \300s \200s \100 s \75s \50s \25s \20s \l0s \50s \3s \2s \l. 8s \ I. 58'1. 2s'l. Os'O. Ss'O. 7s4或0. 6s '在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的02解 离常数在20°0在约111]\1到约11111之间，在20°0在约211]\1到约5(^]\1之间，在20°0在约5〇11]\1 到约10 μΜ之间，或在20°C在约IOOnM到约1.9 μΜ之间。在一些实施方式中，突变H-NOX 蛋白的血红素自氧化速率在37°C小于约Ih'在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的02解 离常数在20°C在约IOOnM到约1.9 μΜ之间，并且突变H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在 37°C小于约Ih'在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的O2解离常数在20°C在约IOOnM到 约1. 9 μ M之间，并且突变H-NOX蛋白的NO反应性在20°C小于约700s4 (例如在20°C小于 约600s'500s'IOOs-1JOs-1或I. 8s-1)。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的血红素自 氧化速率在37°C小于约ItT1，并且突变H-NOX蛋白的NO反应性在20°C小于约700s- 1 (例如 在20°〇小于约 6008'5008'10(^1、2(^1或1.88-1)。
[0014] 在多种实施方式中，本发明的特征在于具有至少一个突变的分离的H-NOX蛋白， 与相应的野生型H-NOX蛋白的O 2解离常数或NO反应性相比，所述突变改变O2解离常数或NO 反应性。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的02解离常数在血红蛋白的O2解离常数的2 个数量级之内，并且突变H-NOX蛋白的NO反应性比血红蛋白的NO反应性低至少10倍。在 一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的O 2解离常数在20°C在约IOOnM到约255nM之间。在一 些实施方式中，突变H-NOX蛋白的O2解离常数在20°C小于80nM，例如在20°C在约20nM到 约75nM之间。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的NO反应性比血红蛋白的NO反应性低 至少100倍，例如比血红蛋白低至少1000倍。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白在20°C 具有小于或等于约0. 65s4 (例如，在20°C在约0. 21s4到约0. 65s H之间）的对氧k。在 一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的对氧匕"在20°C在约I. 35s η到约2. 9s η之间。在一 些实施方式中，突变H-NOX蛋白的对氧匕"在20°C在约5. 8s η到约19s 4之间。在一些实 施方式中，突变H-NOX蛋白在4°C下在空气中是稳定的。
[0015] 在一些实施方式中，本发明的特征在于具有至少一个突变的分离的H-NOX蛋白， 与相应的野生型H-NOX蛋白相比，所述突变改变对氧的、"或NO反应性。在一些实施方式 中，突变H-NOX蛋白的对氧的匕"在20°C小于或等于约0. 65s 4，且突变H-NOX蛋白的NO反 应性比血红蛋白的NO反应性低至少10倍。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的对氧Ii tjff 在20°C在约0. 21s_1到约0. 65s η之间。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的NO反应性 比血红蛋白的NO反应性低至少100倍，例如比血红蛋白的NO反应性低至少1000倍。在 一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的NO反应性在20 °C小于约700 S-1，例如在20 °C小于约 600s \500s \400s \300s \200s \100 s \75s \50s \25s \20s \l0s \50s \3s \2s \ I. 8s'L 5s'L 2s'L Os'O. 8s'(λ 7s4或(λ 6s ' 在一些实施方式中，突变 H-NOX 蛋白 的O2解离常数在20°C在约IOOnM到约1. 9 μΜ之间。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白 的血红素自氧化速率在37°C小于约Ih'在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的O 2解离常 数在20°C在约IOOnM到约1.9 μΜ之间，并且突变H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在37°C 小于约lh'在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的O2解离常数在20°C在约IOOnM到约 1.9μΜ之间，并且突变H-NOX蛋白的NO反应性在20 °C小于约700s4 (例如在20 °C小于约 eOOs'SOOs'lOOs-^Os'l. 8s4或0. 7)。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的血红素 自氧化速率在37°C小于约ItT1，并且突变H-NOX蛋白的NO反应性在20°C小于约700s- 1 (例 如在 20°C小于约 600s'500s'100s'20s'L 8s-1 或 0· 7)。
[0016] 在多种实施方式中，本发明的特征在于分离的H-NOX蛋白，所述蛋白选自腾冲 嗜热厌氧菌H-NOX I5A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX I5L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX I5L-P115A、 腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F-Y140L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F-Y140H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F-N74A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9Y、腾冲嗜热厌 氧菌H-NOX W9N、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX N74E、腾冲嗜热厌 氧菌H-NOX N74A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX N74H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX N74A-Y140H、 腾冲嗜热厌氧菌H-NOX F78Y-Y140F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX P115A、腾冲嗜热厌氧菌 H-NOX R135Q、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140H、腾冲嗜热 厌氧菌H-NOX Y140A、腾冲嗜热厌氧菌I75F-His6、腾冲嗜热厌氧菌I75F、腾冲嗜热厌氧 菌 L144F_His6、腾冲嗜热厌氧菌 L144F、L2F9W-F142Y、脱硫脱硫弧菌（D. desulfuricans) H-NOX(728-899)、脱硫脱硫弧菌H-NOX Y139L、β 1 (1-385)、β 1 (1-385)Ι145Υ、β 1 (1-385) Ι145Η、β 1(1-194)、β 1(1-194) Ι145Υ、0ia_194)L9W-I145Y、β 2(1-217)、β 2(1-217) Ι142Υ、肉毒梭菌（C. botulinum)H-N0X(l-175)、肉毒梭菌 Η-Ν0Χ(1-186)、丙酮丁 醇梭菌 (C. acetobutylicum) Η-Ν0Χ (1_197)、丙酮丁 醇梭菌 Η-Ν0Χ (1_183)和线虫（C. elegans) H-NOX GCY-35(l-252)。在一些实施方式中，β 1或β 2蛋白衍生自褐鼠（R. norvegicus)或 智人（H. sapiens) β 1 或 β 2 蛋白。
[0017] 在多种实施方式中，本发明的特征在于分离的H-NOX蛋白，所述蛋白选自腾冲 厌氧嗜热菌H-NOX Ι5Α、腾冲厌氧嗜热菌H-NOX I5L、腾冲厌氧嗜热菌H-NOX I5L-P115A、 腾冲厌氧嗜热菌H-NOX W9F-Y140L、腾冲厌氧嗜热菌H-NOX W9F-Y140H、腾冲厌氧嗜热菌 H-NOX W9F-N74A、腾冲厌氧嗜热菌H-NOX W9Y、腾冲厌氧嗜热菌H-NOX W9N、腾冲厌氧嗜热 菌H-NOX W9H、腾冲厌氧嗜热菌H-NOX N74E、腾冲厌氧嗜热菌H-NOX N74A、腾冲厌氧嗜热菌 H-N0XN74H、腾冲厌氧嗜热菌H-NOX N74A-Y140H、腾冲厌氧嗜热菌H-NOX F78Y-Y140F、腾冲 厌氧嗜热菌H-NOX P115A、腾冲厌氧嗜热菌H-NOX R135Q、腾冲厌氧嗜热菌H-NOX Y140H、腾 冲厌氧嗜热菌H-NOX Y140A、腾冲厌氧嗜热菌I75F-His6、腾冲厌氧嗜热菌I75F、腾冲厌氧 嗜热菌L144F_His6、腾冲厌氧嗜热菌L144F、嗜肺军团菌（L. pneumophilia) 2F9W-F142Y、脱 硫脱硫弧菌 H-NOX (728-899)、脱硫脱硫弧菌 H-NOX Y139L、β I (1-385) 1145H、β 1 (1-194)、 β I (1-194)Ι145Υ、β I(1-194)L9W-I145Y、β 2(1-217)、β 2(1-217)Ι142Υ、肉毒梭菌 H-NOX (1-175)、肉毒梭菌H-NOX (1-186)、丙酮丁醇梭菌H-NOX (1-197)、丙酮丁醇梭菌 Η-Ν0Χ(1-183)和线虫H-NOX GCY-35(l-252)。在一些实施方式中，β?或β2蛋白衍生自 褐鼠或智人β 1或β2蛋白。
[0018] 在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白的02解离常数在智人（Homo sapiens)血红蛋白α的O 2解离常数的2个数量级之内，例如O2解离常数在智人血红蛋白 α的O2解离常数的0. 1到10倍之间，或在0. 5到2倍之间。在分离的H-NOX蛋白的一些 实施方式中，H-NOX蛋白的NO反应性比智人血红蛋白α的NO反应性低至少10倍，例如比 智人血红蛋白α的NO反应性低至少100倍或1000倍。在分离的H-NOX的一些实施方式 中，与其从中衍生的H-NOX蛋白比较，所述H-NOX蛋白包含一个或多个突变（例如1、2、3、4、 5、6、7、8、9或10个突变）。在分离的H-NOX蛋白的多个实施方式中，与其从中衍生的H-NOX 蛋白相比，所述H-NOX蛋白包含少于20、15、12、10、9、8、7、6、5、4、3或2个突变。在分离的 H-NOX蛋白的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白具有至少一个远侧袋突变（distal pocket mutation)。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白具有至少一个不在远侧袋 中的突变。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白具有至少一个突变，其 中对应于腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的Ile5、Trp9、Asn74、Proll5或Argl35或β 1 (1-385)的 1145的残基被任何其它氨基酸代替。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，所述H-NOX 蛋白具有至少两个突变，其中至少一个突变是对应于腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的Ile5、Trp9、 Asn74、Proll5或Argl35或M(l-385)的1145的残基被任何其它氨基酸代替。在分离的 H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白中的突变对应于腾冲嗜热厌氧菌的Ι5Α突变、I5L 突变、W9F突变、Y140F突变、Υ140Η突变、W9F Υ140Η双突变或F78Y Y140F双突变，或β 1 的1145Υ突变。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白中的突变对应于腾冲 嗜热厌氧菌的W9Y突变、W9H突变、W9N突变、N74H突变、N74E突变、N74A突变、P115A突变、 R135Q突变、I5L P115A双突变、N74A Y140H双突变或W9F N74A双突变。在分离的H-NOX 蛋白的一些实施方式中，与相应的野生型蛋白相比，所述H-NOX蛋白中的至少一个C-末端 氨基酸（例如至少约50个连续的C-末端氨基酸或约25个到约200个连续的C-末端氨基 酸）已经被移除。
[0019] 在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白衍生自哺乳动物蛋白 (如人类蛋白，如β 1)。在分离的H-NOX蛋白的各种实施方式中，所述H-NOX蛋白衍生自细 菌蛋白（如腾冲嗜热厌氧菌蛋白）。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，所述H-NOX蛋 白被共价结合到另一个分子或部分，例如聚乙二醇。血红素可以结合或可以不结合到H-NOX 蛋白。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，氧被结合至H-NOX蛋白。在分离的H-NOX 蛋白的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白是融合蛋白，其包括H-NOX结构域和另一蛋白的部 分或全部，如白蛋白（如人血清白蛋白）。
[0020] 在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧 菌H-NOX Y40L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX F78Y/Y140L、野生型腾冲嗜热厌氧菌H-NOX或嗜 肺军团菌2H-N0X F142Y。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不是 褐鼠 β2(1-217)、褐鼠 β 1(1-194)、褐鼠 β 1 (1-385)或褐鼠 β 1(1-385)1145Y。在分离 的H-NOX蛋白的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F、腾冲 嗜热厌氧菌H-NOX Y140F或智人β1Η-Ν0Χ(1-385)Ι145Υ。在分离的H-NOX蛋白的一些 实施方式中，所述H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Υ140Η、智人ΜΙ140Υ或智人 β 1Ι145Υ。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧 菌H-N0XY140F、野生型嗜肺军团菌2Η-Ν0Χ、智人β 1Η-Ν0Χ Ι140Υ、野生型智人β 1Η-Ν0Χ、 褐鼠 sGC β 1Η-Ν0Χ (1-385)、褐鼠 sGC β 1Η-Ν0Χ (1-385) 1145Υ、褐鼠 sGC β 1Η-Ν0Χ H105G、褐 鼠 sGC0 1H-NOX H105F、褐鼠 sGC0 1H-NOX Ι145Υ、野生型褐鼠 βΙΗ-ΝΟΧ、野生型黑腹果蝇 (D.melangaster) β 1Η-Ν0Χ、野生型黑腹果蝇CG14885-PA Η-Ν0Χ、野生型线虫GCY-35H-N0X、 野生型点形念珠藻（1口11]1〇1：丨；1^01'1116)!1-^1)(、野生型新月柄杆菌（(1(^68〇6111：118)!1-腸父、 野生型沙雷氏菌（S. oneidensis)H-NOX或野生型丙酮丁醇梭菌Η-Ν0Χ。在分离的H-NOX 蛋白的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌