褐鼠 GCYB1_RAT、褐鼠 Q8CH90_ RAT、褐鼠 Q91XJ7_RAT、褐鼠 Q80WX9_RAT、褐鼠 GCYB2_RAT、褐鼠 GCYA2_RAT、家犬（Canis familiaris)Q4ZHR9_CANFA、西藏黄牛（Bos taurus)GCYBl_BOVIN、野猪（Sus scrofa) Q4ZHR7_PIG、双斑峨（Gryllus bimaculatus)Q59HN5_GRYBI、烟草天蛾（Manduca sexta) 077106_MANSE、烟草天蛾 076340_MANSE、意大利蜂（Apis mellifera)Q5UAF0_APME、意大 利蜂 Q5FAN0_APME、意大利蜂 Q6L5L6_APME、冈比亚疟蚊 str PEST(Anopheles gambiae str PEST)Q7PYK9_AN0GA、冈比亚疟蚊 str PEST Q7Q9W6_AN0GA、冈比亚疟蚊 str PEST Q7QF31_AN0GA、冈比亚疟蚊 str PEST Q7PS01_AN0GA、冈比亚疟蚊 str PEST Q7PFY2_ AN0GA、冈比亚疟蚊Q7KQ93_AN0GA、黑腹果蝇Q24086_DR0ME、黑腹果蝇GCYH_DROME、黑腹 果蝇 GCY8E_DR0ME、黑腹果蝇 GCYDA_DROME、黑腹果蝇 GCYDB_DROME、黑腹果蝇 Q9VA09_ DR0ME、拟暗果蝇（Drosophila pseudoobscura)Q29CEl_DR0PS、拟暗果蝇 Q296C7_DR0PS、拟 暗果蝇 Q296C8_DR0PS、拟暗果蝇 Q29BU7_DR0PS、海蜗牛（Aplysia californica)Q7YWK7_ APLCA、马粪海胆 Q95NK5_HEMPU、莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii)Q5YLC2_CHLRE、 鱼腥藻 Q8YUQ7_ANASP、黄杆菌 BBFL7 (Flavobacteria bacterium BBFL7) Q26GR8_9BACT、 Psychroflexus torquis ATCC700755Q1VQE5_9FLA0、海洋 γ 蛋白菌（marine gamma 口1'〇七6(*3(^61^11111)!^〇：220701￥?邗_96六丽、海洋丫蛋白菌！^〇：220701￥1'1(4_96六丽、新月柄 杆菌 Q9A451_CAUCR、隐藏嗜酸菌 JF-5(Acidiphilium cryptum JF-5)Q2DG60_ACICY、球形 红细菌 Q3J0U9_RH0S4、Silicibacter pomeroyi Q5LPV1_SILP0、脱氮副球菌（Paracoccus denitrificans)PD1222Q3PC67_PARDE,Silicibacter sp TM1040Q3QNY2_9RH0B,Jannaschia sp Q28ML8_JANSC、Magnetococcus sp MC-1Q3XT27_9PR0T、嗜肺军团菌（Legionella pneumophila)Q5WXP0_LEGPL、嗜肺军团菌 Q5WTZ5_LEGPL、嗜肺军团菌 Q5X268_LEGPA、 嗜肺军团菌Q5X2R2_LEGPA、嗜肺军团菌嗜肺亚种（Legionella pneumophila subsp pneumophi la) Q5ZWM9_LEGPH、嗜肺军团菌嗜肺亚种 Q5ZSQ8_LEGPH、嗜冷细菌（Colwel I ia psychrerythraea) Q47Y43_C0LP3、Pseudoalteromonas atlantica T6c Q3CSZ5_ALTAT、 沙雷氏菌 Q8EF49_SHE0N、Saccharophagus degradans Q21E20_SACD2、Saccharophagus degradans Q21ER7_SACD2、 Vibrio angustum S14Q1ZWE5_9VIBR、创伤弧菌（Vibrio vulnificus) Q8DAE2_VIBVU、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus) 12G01Q1VCP6_VIBAL、弧 菌（Vibrio sp)DAT722Q2FA22_9VIBR、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus)Q87NJl_ VIBPA、费氏弧菌（Vibrio f ischeri) Q5E1F5_VIBF1、创伤弧菌 Q7MJS8_VIBVY、发光细菌 (Photobacterium sp)SKA：MQ2C6Z5_9GAMM、Hahella chejuensis Q2SFY7_HAHCH、海洋螺 旋菌某种（Oceanospirillum sp)MED92Q2BKV0_9GAMM、海洋杆菌某种（Oceanobacter sp) RED65Q1N035_9GAMM、脱硫脱硫弧菌（Desulfovibrio desulfuricans) Q310U7_DESDG、奥 氏嗜热盐丝菌（Halothermothrix orenii)H 168Q2AIW5_9FIRM、腾冲嗜热厌氧菌 Q8RBX6_ THETN、Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903Q2ZH17_CALSA、丙酮丁醇梭 菌 Q97E73_CL0AB、Alkaliphilus metalliredigenes QYMF Q3C763_9CL0T、破伤风梭菌 (Clostridium tetani)Q899J9_CL0TE 和拜氏梭菌 NCIMB8052 (Clostridium beijerincki NCMB 8052) Q2WVN0_CL0BE。使用本文所述的Pfam数据库，基于属于H-NOX蛋白家族的这 些蛋白质的标识，预测这些序列编码H-NOX蛋白。
[0060] 可适合用于本文所述的药物组合物和方法的另外的H-NOX蛋白和核酸可以使用 标准方法进行鉴定。例如，基于它们的一级结构和/或预测的蛋白质二级结构与已知H-NOX 蛋白和核酸的相似性，标准序列对比和/或结构预测程序可以被用于识别另外的H-NOX蛋 白和核酸。例如，Pfam数据库使用定义的对比算法（defined alignment algorithms)和 隐蔽马尔科夫模型（例如Pfam 21.0)将蛋白质分类为家族，如H-NOX蛋白家族（Pfam-蛋白结构域家族对比和隐蔽马尔科夫模型的数据库，Copyright (C) 1996-2006The Pfam Consortium ；GNU LGPL Free Software Foundation, Inc. , 59Temple Place-Suite 330, Boston, MA 02111-1307, USA)。标准数据库，例如 swissprot-trembl 数据库（万维网地 址为 "expasy. org"，Swiss Institute of Bioinformatics Swiss-Prot group CMU-Irue Michel Servet CH_1211Geneva 4, Switzerland)，也可以被用于鉴定 H-N0X 蛋白家族的成 员。H-NOX蛋白的二级和/或三级结构可以使用标准结构预测程序的默认参数进行预测，例 如 PredictProtein (630West, 168Street，BB217, New York, N.Y. 10032, USA)。可选地，H-NOX 蛋白的实际二级和/或三级结构可以使用标准方法确定。
[0061] 在一些实施方式中，H-NOX蛋白在相应的位置上具有与腾冲嗜热厌氧菌H-NOX中 以下远侧袋残基的任何一个相同的氨基酸：Thr4、Ile5、Thr8、Trp9、Trp67、Asn74、Ile75、 Phe78、Phe82、Tyrl40、Leul44或前述两个或多个的任何组合。在一些实施方式中，基于 它们氨基酸序列的序列对比，H-NOX蛋白在与腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的Prol 15或Argl35 相应的位置上分别具有脯氨酸或精氨酸。在一些实施方式中，H-NOX蛋白具有对应于褐鼠 β 1H-N0X的Hisl05的组氨酸。在一些实施方式中，H-NOX蛋白具有，或被预测具有包含6 个α -螺旋、接着是2个β -折叠、接着是1个α -螺旋、接着是2个β -折叠的二级结构。 该二级结构对于H-NOX蛋白已经被报道。
[0062] 如果希望，新鉴定的H-NOX蛋白可以使用标准方法进行检测，以确定其是否结合 血红素。H-NOX蛋白作为O 2载体起作用的能力可以通过使用标准方法--例如本文所述的 那些一一确定H-NOX蛋白是否结合02加以检测。如果希望，本文所述突变的一个或多个可 以被引入H-NOX蛋白以优化其作为O 2载体的特性。例如，一个或多个突变可以被引入，以 改变其〇2解离常数、对氧k、血红素自氧化速率、NO反应性、NO稳定性或前述两个或多个 的任何组合。标准技术，例如本文所述的那些，可以被用于测量这些参数。
[0063] 如本文所讨论，突变H-NOX蛋白（如下文讨论的I类和II类突变）可从这些或其 它天然野生型来源序列（例如，图2-4D或8A-8DD所列的序列或本文所述的任何其它序列） 通过诱变进行衍生。如本文所使用，"从……衍生（或衍生自）"涉及一个或多个突变被引 入其中的蛋白质的来源。例如，"从哺乳动物蛋白质衍生的"蛋白质指的是将一个或多个突 变引入野生型（即，天然存在的序列）哺乳动物蛋白序列产生的目标蛋白质。 突变H-NOX蛋白
[0064] 如本文进一步讨论，H-NOX蛋白可包含一个或多个突变，例如与相应野生型蛋白 的那些相比，改变〇 2解离常数、对氧k、血红素自氧化速率、NO反应性、NO稳定性或前述 两种或多种的任何组合的突变。由于本文提供的教导，使用本文所述且普通技术人员已知 的技术，可通过随机诱变，接着经验筛选需要的或期望的解离常数、解离速率、NO反应性、 稳定性、生理相容性或前述两种或多种的任何组合，来产生工程化的H-NOX蛋白组。可选 地，诱变可以选择性地靶向特定区域或残基，例如H-NOX蛋白的实验确定或预测的三维结 构中明显的远侧袋残基（本文图IA ;并参见，例如，Boon, E.M.et al. (2005). "Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase, "Nature Chemical Biology 1:53-59,其通过引用由此并入其全部内容，特别是涉及野生型和突变H-NOX蛋 白的序列）或通过序列对比鉴定的进化上保守的残基（本文图2-4 ;并参见，例如，Boon E.M.et al. (2005). ^Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase, "Nature Chemical Biology 1:53-59,其通过引用由此并入其全部内容，特别是 涉及野生型和突变H-NOX蛋白的序列）。
[0065] 如本文所使用，"突变蛋白"意指与天然存在的蛋白质相比，具有一个或多个突变 的蛋白质。在一种实施方式中，突变蛋白具有与所有天然存在的蛋白质的序列不同的序列。 在各种实施方式中，突变蛋白的氨基酸序列与天然发生的蛋白的相应区域的序列具有至少 约下列任一同一 ,性：10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、95、97、98、99 或 99. 5%。在一 些实施方式中，突变蛋白是含有来自全长蛋白的至少约下列任何个数的连续氨基酸的蛋白 片段：25、50、75、100、150、200、300或400个。例如，可以使用带有其中指定的默认参数的 序列分析软件（例如Genetics Computer Group的序列分析软件包（Sequence Analysis Software Package), University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710University Avenue, Madison, WI 53705)测量序列同一性。该软件程序通过对各种氨基酸置换、删除和 其它修饰赋予同源性程度来匹配相似序列。
[0066] 如本文所使用，"突变"意指在天然发生的参考核酸或氨基酸序列中的改变。示例 性的核酸突变包括插入、缺失、移码突变、沉默突变、无义突变或错义突变。在一些实施方 式中，核酸突变不是沉默突变。示例性的蛋白突变包括一个或多个氨基酸的插入（如2、3、 4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的插入）、一个或多个氨基酸的缺失（如N-末端、C-末端和/或 内部残基的缺失，例如至少约下列任何个数的氨基酸的缺失：5、10、15、25、50、75、100、150、 200、300或更多个，或者大约下列任何个数的氨基酸的缺失：5、10、15、25、50、75、100、150、 200、300或400个）、一个或多个氨基酸的置换（如2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的置 换）、或前述两种或多种的组合。H-NOX蛋白的示例性功能截短包括β 1序列的残基1-385。 在一些实施方式中，与天然发生的蛋白质相比，突变蛋白具有至少一个氨基酸改变。在一些 实施方式中，突变核酸序列编码与天然发生的蛋白质相比具有至少一个氨基酸改变的蛋白 质。在一些实施方式中，核酸不是天然发生的核酸的简并版本，所述天然发生的核酸编码与 天然发生的蛋白质具有相同的氨基酸序列的蛋白质。在提到特定氨基酸突变中使用的命名 法首先确定野生型氨基酸，接着是残基编号，而最后是取代氨基酸。例如，Y140L表示在残 基编号140上的酪氨酸被亮氨酸置换。
[0067] "进化上保守的突变"是一种蛋白质中的氨基酸被同一蛋白质家族中另一种蛋白 质相应位置上的氨基酸置换。示例性的进化上保守的突变（也表示为I类突变）列于表1A。 在表1A中，突变根据人β IH-NOX的序列进行编号/注释，但对有所有H-NOX序列都是类似 的。因此，任何其它H-NOX蛋白中的对应位置可以被突变为指出的残基。例如，人β 1Η-Ν0Χ 的Phe4可以被突变为酪氨酸，由于其它H-NOX蛋白在该位置具有酪氨酸。对应的苯丙氨酸 残基可以被突变为其它任何H-NOX蛋白中的酪氨酸。在【具体实施方式】中，一个或多个突变 被限定为进化上保守的残基。在一些实施方式中，一个或多个突变可包括至少一个进化上 保守的突变和至少一个非进化上保守的突变。如果希望，鉴于本文提供的教导，这些突变 H-NOX蛋白经受对N0/02解离常数、NO反应性、稳定性和生理相容性的经验筛选。 表1A.示例性的靶向进化上保守的残基的I类H-NOX突变 F4Y Q30G 1145 Y F4L E33P 1145H H7G N61G K151E A8E C78H 1157F L9W A109F E183 F
[0068] 在一些实施方式中，所述突变为远侧袋突变，例如α-螺旋A、D、E或G中残基的突 变（Pellicena，P.等人（2004年8 月 31 日）."Crystal Structure of An Oxygen-Binding Heme Domain Related to Soluble Guanylate Cyclases, ''Proc Natl. Acad Sci USA 101 (35) : 12854-12859)。示例性的远侧袋突变（也表示为II类突变）列于表1B。在表1B 中，突变根据人βΙΗ-NOX的序列进行编号/注释，但对于所有H-NOX序列都是类似的。因 为若干取代在每个所描述的残基处提供了可行的突变，在每个指出位置的残基可以被改变 为任何其它天然或非天然存在的氨基酸（表示为"X"）。这类突变可以产生具有各种期望 亲和力、稳定性和反应性特征的H-NOX蛋白。 表1Β.示例性的靶向远侧袋残疾的II类H-NOX突变 V8X Μ73Χ Ι145Χ L9X F77X Ι149Χ F70X C78X
[0069] 在【具体实施方式】中，所述突变为血红素远侧袋突变。如本文所述，在H-NOX家族的 NO-结合成员中阻止O2结合的关键分子决定因素是血红素的远侧袋中氢键供体的缺乏。因 此，在一些实施方式中，所述突变改变H-NOX结构域和远侧袋内配体之间的氢键结合。在一 些实施方式中，所述突变破坏远侧袋的氢键供体和/或相对于对应的野生型H-NOX结构域 赋予降低的〇 2配体结合。示例性的远侧袋残基包括腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的hr4、Ile5、 Thr8、Trp9、Trp67、Asn74、Ile75、Phe78、Phe82、TyrHO 和 Leul44 以及任何其它 H-NOX 蛋 白中对应的残基。
[0070] 不在远侧袋中的残基也可影响血红素基团的三维结构；该结构再影响02和NO与 血红素基团中铁的结合。因此，在一些实施方式中，H-NOX蛋白在远侧袋之外具有一个或多 个突变。可以被突变但不在远侧袋中的残基的实例包括腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的Pr 〇115 和Argl35。在一些实施方式中，所述突变在近侧袋（proximal pocket)中，所述近侧袋包括 Hisl05,其作为连接到血红素铁的残基。
[0071] 在一些实施方式中，当存在两个或多个突变时，至少一个突变在远侧袋之中，并且 至少一个突变在远侧袋之外（例如，在近侧袋中的突变）。在一些实施方式中，所有的突变 都在远侧袋中。
[0072] 在一些实施方式中，H-NOX蛋白的氨基酸序列与由自然界中生物体产生的蛋白质 的序列不相同。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的氨基酸序列与在2006年5月21日或2006 年5月22日于任何数据库中发现的序列（例如预测为或已知为H-NOX核酸或氨基酸序列 的所有已知序列）不相同。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的氨基酸序列与在2007年5月 21日或2007年5月22日于任何数据库中发现的序列（例如预测为或已知为H-NOX核酸或 氨基酸序列的所有已知序列）不相同。
[0073] 为了降低从人以外来源衍生的H-NOX蛋白的免疫原性，H-NOX蛋白中的氨基酸可 以被突变为人H-NOX中的对应氨基酸。例如，非人H-NOX蛋白四级结构表面上的一个或多 个氨基酸可以被突变为人H-NOX蛋白中的相应氨基酸。在一些变异中，一个或多个表面氨 基酸的突变可与两个或多个远侧袋残基的突变、远侧袋外的一个或多个残基的突变（如， 近侧袋中的突变）或前述两种或多种的组合进行组合。
[0074] 示例性的突变显示于表2。此外，表2中所列残基的任何一个可以被突变为任何其 它氨基酸。本发明也涉及本文所述突变的任何组合，例如双突变、三突变或更高的多突变。 例如，本文所述突变的任何一种的组合可以在同一 H-NOX蛋白中进行。注意，在其它哺乳动 物或非哺乳动物H-NOX蛋白的等价位置上的突变也被本发明包括。如果希望，除表2中提 到的残基以外的残基也可以被突变。示例性的突变H-NOX蛋白包含一个或多个突变，其相 对于对应的野生型H-NOX结构域赋予改变的0 2或NO配体-结合，并可作为生理相容的哺 乳动物〇2血液气体载体起作用。
[0075] 在表2和所有随后的表格中，突变的残基编号表示在被描述的特定H-NOX蛋白的 序列中的位置。例如，腾冲嗜热厌氧菌I5A指的是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX第五个位置上的 异亮氨酸被丙氨酸置换。相同的异亮氨酸到丙氨酸的突变可以在任何其它H-NOX蛋白的相 应残基中进行（该残基可以是或可以不是其它H-NOX蛋白序列中的第五个残基）。由于哺 乳动物β 1H-N0X结构域的氨基酸序列最多有两个氨基酸不同，所以，当被引入野生型大鼠 β 1Η-Ν0Χ蛋白时产生期望突变H-NOX蛋白的突变也被预期当在被引入来自其它哺乳动物 如人的野生型β 1Η-Ν0Χ蛋白中时产生期望的突变H-NOX蛋白。 表2.来自腾冲嗜热厌氧菌（Tt)、嗜肺军团菌（Lp)、脱硫脱硫弧菌（Dd)、霍乱弧菌 (Vc)、点形念珠藻（Np)、肉毒杆菌（Cb)、丙酮丁醇梭菌（Ca)、大鼠、人、线虫（Ce)的示例性 H-NOX突变
【主权项】
1. 一种药物组合物，其包含（i)药学上可接受量的H-NOX蛋白，其中所述H-NOX蛋白的 〇2解离常数在血红蛋白的〇 2解离常数的2个数量级之内，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反 应性比血红蛋白的NO反应性低至少10倍，和（ii)药学上可接受的载体。
2. 权利要求1所述的药物组合物，其中所述H-NOX蛋白的0 2解离常数在20°C在约 IOOnM到约255nM之间。
3. 权利要求1和2任一项所述的药物组合物，其中所述H-NOX蛋白的0 2解离常数在 20°C小于约80nM。
4. 权利要求3所述的药物组合物，其中所述H-NOX蛋白的O2解离常数在20°C在约20nM 到约75nM之间。
5. 权利要求1-4中任一项所述的药物组合物，其中所述H-NOX蛋白的NO反应性比血红 蛋白的NO反应性低至少100倍。
6. 权利要求5中所述的药物组合物，其中所述H-NOX蛋白的NO反应性比血红蛋白的 NO反应性低至少1，000倍。
7. 权利要求1-6任一项所述的药物组合物，其中所述H-NOX蛋白的对氧k。"在20°C小 于或等于约〇. 65s'
8. 权利要求7所述的药物组合物，其中所述H-NOX蛋白的对氧k。"在20°C在约0. 21s 到约0. 65s4之间。
9. 权利要求1-6任一项所述的药物组合物，其中所述H-NOX蛋白的对氧k。"在20°C在 约I. 35s4到约2. 9sH之间。
10. 权利要求1-9任一项所述的药物组合物，其中所述H-NOX蛋白在4°C下在空气中是 稳定的。
【专利摘要】本发明涉及用于氧输送的组合物及方法。H-NOX蛋白被突变为显示出改善的或优化的血液气体O2输送动力学和热力学性质。工程H-NOX蛋白包含突变，所述突变相对于对应的野生型H-NOX结构域赋予改变的O2或NO配体-结合，并可作为生理相容的哺乳动物血液O2气体载体起作用。本发明也提供了药物组合物、试剂盒及方法，它们使用野生型或突变H-NOX蛋白，用于治疗输送O2对其有益的任何病症。
【IPC分类】A61P9-00, A61K47-48, A61K38-17, A61P25-00, A61P7-08, A61K38-16
【公开号】CN104689300
【申请号】CN201410766335
【发明人】S·P·L·卡瑞, E·M·博恩, E·魏纳特, J·A·温格, M·A·马莱塔
【申请人】加利福尼亚大学董事会
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2007年5月21日
【公告号】CA2653080A1, CA2653101A1, CN101495134A, CN101495506A, EP2032156A2, EP2032156A4, EP2032156B1, EP2040740A2, EP2040740A4, EP2040740B1, EP2463294A1, EP2463295A1, EP2463296A1, EP2463297A1, EP2474554A2, EP2474554A3, US8404631, US8404632, US20100266673, US20100285104, US20130288970, US20130289252, US20150266931, WO2007139767A2, WO2007139767A3, WO2007139791A2, WO2007139791A3