专利名称：利用冷冻相分离制备多糖玻璃体微粒的方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物技术领域的制剂制备方法，尤其是一种利用冷冻相分离制备多糖玻璃体微粒的方法。
背景技术：
基因重组技术用于治疗蛋白的表达和生产的20多年以来，到目前为止，已有30多个蛋白药物产品投入临床使用，近200个在审批和研发过程中，涌现出一批诸如安进(Amgen)、基因技术(Genentech)等一批新的大型医药公司。相对于蛋白大分子药物本身的快速发展，其剂型技术进展缓慢。一方面，蛋白大分子药物口服不吸收、体内半衰期短，需要注射给药；另一方面，许多何尔蒙、细胞因子类的蛋白药物药物治疗周期长，长期而频繁地注射成为必须，也影响患者顺应性的主要原因。缓释蛋白药物的剂型的研发，由于在制备微粒过程导致活性的损失诸如W/O/W法等。发展制备具有活性保护的蛋白微粒势在必行。而葡聚糖和PEG是常用来蛋白药物的冻干保护剂和分离纯化蛋白的试剂。Hennink利用修饰的葡聚糖制备蛋白缓释微球的报道，但是作者用到强氧化剂如过硫酸钾、过硫酸铵等，及聚合物引发剂使葡聚糖分子发生交联，这些难免不与蛋白发生反应，导致蛋白的失活或增加免疫原性。到目前还未见在水性环境下，不用交联剂或固化剂制备聚合物的微粒方法报道。
经对现有技术文献的检索发现，[Van T.S.R.，Van S.M.J.，Van N.C.F.andHennink W.E.GEL COMPOSITION COMPRISING CHARGED POLYMERS.PublicationNumberWO/2005/110377，International Application No.PCT/NL2005/000365.]，(Van T.S.R.，Van S.M.J.，Van N.C.F.and Hennink W.E.离子型聚合物的凝胶组合物，公开号为，WO/2005/110377，国际申请号PCT/NL2005/000365)。Van T.S.R.等人在该专利报道了利用相反的离子电荷交联制备成凝胶的药物载体。该专利利用在水溶性的两种带相反电荷的相互作用制备载蛋白质和多肽药物。但是蛋白质和多肽药物也都带电荷，载药的胶材料也带电荷，电荷只有正负两种，成胶的材料那么就不可避免的与蛋白或多肽发生交联。交联后的蛋白质和多肽也不可避免的失活和增加免疫原性。
发明的内容本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种利用冷冻相分离制备多糖玻璃体微粒的方法。使其制备的微粒表面光滑圆整，均匀度好，颗粒规整无粘连，在完全无有机溶剂和不加任何交联剂及聚合物引发剂，以避免这些对药物的治疗的作用影响。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明将含有多糖的两种或多种聚合物水溶液冷冻，在降温过程中发生相分离并使多糖成为分散相，然后冻干并除去连续散相得到多糖玻璃体微粒。不需使用有机相(或称油相)乳化，不需使用交联剂、固化剂、表面活性剂稳定，不存在水-油、水-气等强界面张力的界面。
本发明具体包括以下步骤①将聚乙二醇(PEG)或和多糖溶于水中通过控制浓度形成均相溶液；②将生物活性物质加入其中，或与多糖、聚乙二醇一并加入；③将完成步骤②的溶液在降温过程中，避免速冻条件下冷冻；④将完成步骤③的样品冻干；⑤将完成步骤④的样品用溶剂洗涤除去PEG连续相获得多糖分散相颗粒。
所述的PEG，其分子量为1,000-30,000；以6,000到10,000、为佳。
所述的PEG，其重量百分比浓度为0.2％-50％之间；以1％-20％为佳。
所述的多糖，其分子量为10,000-2,000,000；以50,000-500,000为佳。
所述的多糖，其的重量百分比浓度为1％-50％；以1％-20％为佳。
所述的多糖，以葡聚糖为佳；所述的PEG，用于除去PEG连续相的有机溶剂是溶解PEG而不溶解多糖的溶剂。
所述的降温过程，是指使样品温度从单一相水溶液到两相或多相的相转化温度以上降低到冰点以下的过程，而相转化温度则随亲水性聚合物的种类和浓度而变化。
所述的多糖和所述的PEG的重量比在1∶1和1∶200的范围内；以1∶4到1∶80为佳。
所述的多糖分散相颗粒，含有缓冲物质、盐类和小分子糖类物质，其浓度为多糖的重量百分比的0.1-10％。
所述的缓冲物质为Mg(OH)2、ZnCO3、及MgCO3，盐类为Zn(AC)2、ZnCl2、CaSO4、MgSO4，小分子糖类为海藻糖、蔗糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇。
所述的多糖分散相颗粒，可以用来微囊化结构脆弱的治疗物质--诸如蛋白质、多肽、基因物质、抗体、疫苗、病毒和脂质体等可被担载于多糖微粒之中；所述的多糖分散相颗粒，可以用于其所担载的治疗物质的缓释微球剂型和吸入剂型；所述的缓释微球剂型，载有治疗物质的多糖微粒分散在可降解高分子微球的基质中；通过将多糖微粒分散在可降解高分子溶液中形成初乳(S/O)，再分散在水相中形成复乳即水/油/固体(S/O/W)的方法，或者通过将多糖玻璃体微粒分散在油溶的可降解高分子溶液中形成初乳(S/O)，再分散在另一油相中形成复乳即油/油/固体(S/O/O)的方法，；所述的吸入剂型，为载有治疗物质的多糖本身，其粒径为1μm-5μm。
本发明采用常规的配制聚合物的溶液方法。先分别将葡聚糖和PEG溶解于水中形成溶液，再把两种溶液相混形成均相。然后冷冻该均相溶液，再冻干去除连续相，得多糖微粒。在控制浓度下，PEG和多糖可以混溶，而在冷冻时发生相分离，然后冻干，用溶剂去连续相收集微粒。
提供一种不用过硫酸钾或者过硫酸铵强氧化剂，及聚合物引发剂及固化剂制备各种粒径(0.1μm-10μm)的微粒方法。采用本发明方法制备的微粒表面光滑圆整，颗粒规整无粘连，粒径可以根据需要进行调控从0.1μm到10μm。
本发明选择了合适的亲水性聚合物均相水溶液冷冻法制备多糖微粒，可以在完全无有机溶剂和不加任何交联剂及聚合物引发剂。可以避免这些对药物的治疗的作用影响，尤其是那些物理化学性质不稳定的，如生物大分子药物蛋白药物、多肽等。微粒的表面光滑圆整，颗粒规整无粘连，粒径可以根据需要进行调控从0.1μm到10μm，径距分布较窄，其冻干粉剂为白色细腻，疏松，不塌陷，不粘连，再分散性良好。可以运用到各种药物缓释微球的制备及疫苗的佐剂。
具体实施例方式
一、空白多糖玻璃体制备1.制备PEG和多糖水溶液用超纯水分别制备8％的PEG和8％的多糖水溶液，精确称取8克PEG和8克多糖水分别放在100毫升的烧杯里加水92克，然后把两个烧杯放在加热的磁力搅拌30min，待PEG和8％的多糖全部溶解取下来冷却待用。
2.制备PEG和多糖均相共水溶液将步骤1.的多糖和PEG水溶液按照体积比分别为1∶5、1∶10、1∶20、1∶40在西林瓶旋涡30s-60s充分混匀，形成均相溶液；或称取按照多糖和PEG的质量比为1∶5、1∶10、1∶20、1∶40在西林瓶先混匀再加水，使之溶解形成均相溶液。
3.冷冻PEG和多糖均相共水溶液将制备PEG和多糖均相共水溶液在降温过程中发生相分离，使多糖成为分散相，PEG成为连续相。但是避免速冻条件下冷冻过夜。
4.将完成步骤3的样品在真空冷冻干燥机冻干；5.将完成步骤4的样品用二氯甲烷洗涤三次除去PEG连续相获得多糖分散相颗粒。
二、载药多糖玻璃体制备1.制备PEG和多糖水溶液2.制备PEG和多糖均相共水溶液均按照空白多糖玻璃体制备方法。
3.把药物和多糖溶液混合均匀，或把药物和PEG和多糖均相共水溶液混合均匀制备载药的PEG和多糖均相共水溶液4.冷冻多糖、药物和PEG均相共水溶液将制备多糖、药物和PEG均相共水溶液在降温过程中发生相分离，使药物通过优先分配到多糖分散相里，PEG成为连续相。但是避免速冻条件下冷冻。
然后按照制备空白多糖玻璃体制备方法得到载药多糖玻璃体。
应用制备的载药多糖玻璃体可以直接用于吸入剂型，保护结构脆弱的生物试剂如蛋白质和多肽等药物；载药的多糖玻璃体还可以分散在可降解高分子溶液中再分散在水相中(S-O-W)的方法，或者通过将多糖微粒分散在可降解高分子溶液中再分散在另一油相中(S-O-O)的方法制备缓释微球。
本发明的优点完全避免了使用有机溶剂、高剪切力、界面、和交联剂等，在温和的条件下把生物活性物质，如蛋白质、多肽、疫苗、DNA、RNA、病毒和脂质体载入多糖玻璃体，能够长期保持活性。大大的减少保存的费用和提高疗效。同时制备的多糖玻璃体的粒径小，活性高，因此在制备成其它剂型如缓释微球，可以减少突释和不完全释放。
实施例一多糖玻璃体制备(1)在25℃下配制成8％的Dex70,000和8％的PEG8,000溶液；按照取0.500gDex70,000；2.500gPEG8,000，即1∶5(w/w)在25℃下配制成溶液，旋涡30s-60s充分混匀，在-26℃冰箱预冻一晚，再在真空干燥24小时，用滴管取二氯甲烷3ml-4ml滴入西林瓶，旋涡5min，在12000RPM离心5min，去上清液，来回三次，在真空干燥挥尽二氯甲烷，收集微粒，取少量的在显微镜下观察，或把它混悬在二氯甲烷中用PCS粒度散射仪测定其粒径。粒径在2μm-10μm，平均粒径为5.7μm。
(2)在25℃下配制成8％的Dex70,000和8％的PEG8,000溶液；按照取0.250gDex70,000；2.500gPEG8,000，即1∶10(w/w)在25℃下配制成溶液，旋涡30s-60s充分混匀，在-26℃冰箱预冻一晚，再在真空干燥24小时，用滴管取二氯甲烷3ml-4ml滴入西林瓶，旋涡5min，在12000RPM离心5min，去上清液，来回三次，在真空干燥挥尽二氯甲烷，收集微粒，取少量的在显微镜下观察，或把它混悬在二氯甲烷中用PCS粒度散射仪测定其粒径。粒径在1μm-5μm，平均粒径为2.652μm。
(3)在25℃下配制成8％的Dex70,000和8％的PEG8,000溶液；按照取0.125gDex70,000；2.500gPEG8,000，即1∶20(w/w)在25℃下配制成溶液，旋涡30s-60s充分混匀，在-26℃冰箱预冻一晚，再在真空干燥24小时，用滴管取二氯甲烷3ml-4ml滴入西林瓶，旋涡5min，在12000RPM离心5min，去上清液，来回三次，在真空干燥挥尽二氯甲烷，收集微粒，取少量的在显微镜下观察，或把它混悬在二氯甲烷中用PCS粒度散射仪测定其粒径。粒径在0.5μm-5μm，平均粒径为1.562μm。
(4)在25℃下配制成8％的Dex70,000和8％的PEG8,000溶液；按照取0.080g Dex70,000；3.200g PEG8,000，即1∶40(w/w)在25℃下配制成溶液，旋涡30s-60s充分混匀，在-26℃冰箱预冻一晚，再在真空干燥24小时，用滴管取二氯甲烷3ml-4ml滴入西林瓶，旋涡5min，在12000RPM离心5min，去上清液，来回三次，在真空干燥挥尽二氯甲烷，收集微粒，取少量的在显微镜下观察，或把它混悬在二氯甲烷中用PCS粒度散射仪测定其粒径。粒径在0.3μm-5μm，平均粒径为309nm。
实施例二制备载药多糖玻璃体制备载牛血清白蛋白多糖玻璃体1.制备牛血清白蛋白、PEG和多糖水溶液用超纯水分别制备8％的PEG和8％的多糖水溶液，精确称取8克PEG和8克多糖水分别放在100毫升的烧杯里加水92克，然后把两个烧杯放在加热的磁力搅拌30min，待PEG和8％的多糖全部溶解取下来冷却待用。用电子天平精确称取800毫克牛血清白蛋白溶于7.2毫升水中待用。
2.牛血清白蛋白、PEG和多糖均相共水溶液将1.的多糖、牛血清白蛋白和PEG水溶液按照体积比分别为1∶1∶5、1∶1∶10、1∶1∶20、1∶1∶40在西林瓶旋涡30s-60s充分混匀，形成均相溶液；或称取按照多糖和PEG的质量比为1∶1∶5、1∶1∶10、1∶1∶20、1∶1∶40在西林瓶先混匀再加水，使之溶解形成均相溶液。
3.冷冻牛血清白蛋白、PEG和多糖均相共水溶液将制备牛血清白蛋白、PEG和多糖均相共水溶液在降温过程中发生相分离，使多糖成为分散相，PEG成为连续相。但是避免速冻条件下冷冻过夜。
4.完成步骤3的样品在真空冷冻干燥机冻干；5.完成步骤4的样品用二氯甲烷洗涤三次除去PEG连续相获得载牛血清白蛋白多糖玻璃体。
得到的载牛血清白蛋白多糖分散相玻璃体的粒径大都在300nm-5μm，得到这些玻璃体光滑圆整，粒径分布均匀。可以使牛血清白蛋白的结构得到好的保护，避免了在剂型制备过程失活。
实施例三制备载药多糖玻璃体制备载肌红蛋白多糖玻璃体1.制备肌红蛋白、PEG和多糖水溶液用超纯水分别制备8％的PEG和8％的多糖水溶液，精确称取8克PEG和8克多糖水分别放在100毫升的烧杯里加水92克，然后把两个烧杯放在加热的磁力搅拌30min，待PEG和8％的多糖全部溶解取下来冷却待用。用电子天平精确称取10毫克牛血清白蛋白溶于990毫升水中待用。
2.肌红蛋白、PEG和多糖均相共水溶液将1.的多糖、肌红蛋白和PEG水溶液按照体积比分别为1∶1∶5、1∶1∶10、1∶1∶20、1∶1∶40在西林瓶旋涡30s-60s充分混匀，形成均相溶液；或称取按照多糖和PEG的质量比为1∶10∶50、1∶10∶100、1∶10∶200、1∶10∶400在西林瓶先混匀再加水，使之溶解形成均相溶液。
3.肌红蛋白、PEG和多糖均相共水溶液将制备肌红蛋白、PEG和多糖均相共水溶液在降温过程中发生相分离，使多糖成为分散相，PEG成为连续相。但是避免速冻条件下冷冻过夜。
4.完成步骤3的样品在真空冷冻干燥机冻干；5.完成步骤4的样品用二氯甲烷洗涤三次除去PEG连续相获得载肌红蛋白多糖玻璃体。
得到的载牛肌红蛋白多糖分散相玻璃体的粒径大都在300nm-5μm，得到这些玻璃体光滑圆整，粒径分布均匀。可以使肌红蛋白的结构得到好的保护，避免了在剂型制备过程失活。
权利要求
1.一种利用冷冻相分离多糖玻璃体微粒的制备方法，其特征在于，将含有多糖的两种或多种聚合物水溶液冷冻，在降温过程中发生相分离并使多糖成为分散相，然后冻干并除去连续散相得到多糖玻璃体微粒。
2.根据权利要求1所述的利用冷冻相分离多糖玻璃体微粒的制备方法，其特征是，具体包括以下步骤①将聚乙二醇PEG或和多糖溶于水中通过控制浓度使它们形成均相溶液；②将活性物质加入其中，或与多糖、聚乙二醇一并加入，或生物活性物质也不加；③将完成步骤②的溶液在降温过程中，避免速冻条件下冷冻；④将完成步骤③的样品冻干；⑤将完成步骤④的样品用溶剂洗涤除去PEG连续相获得多糖分散相颗粒。
3.根据权利要求1或者2所述的利用冷冻相分离多糖玻璃体微粒的制备方法，其特征是，所述的PEG，其分子量为1,000-30,000；其重量百分比浓度为0.2％-50％.
4.根据权利要求1所述的利用冷冻相分离多糖玻璃体微粒的制备方法，其特征是，所述的PEG，用于除去PEG连续相的有机溶剂是溶解PEG而不溶解多糖的溶剂。
5.根据权利要求1或者2所述的利用冷冻相分离多糖玻璃体微粒的制备方法，其特征是，所述的多糖，为葡聚糖，淀粉；其分子量为10,000-2,000,000；其的重量百分比浓度为1％-50％。
6.根据权利要求1或者2所述的利用冷冻相分离制备多糖玻璃体微粒的方法，其特征是，所述的降温过程，是指使样品温度从单一相水溶液到两相或多相的相转化温度以上降低到冰点以下的过程，而相转化温度则随亲水性聚合物的种类和浓度而变化。
7.根据权利要求1或者2所述的利用冷冻相分离制备多糖玻璃体微粒的方法，其特征是，所述的多糖和所述的PEG的重量比在1∶1和1∶200的范围内。
8.根据权利要求1或者2所述的利用冷冻相分离多糖玻璃体微粒的制备方法，其特征是，所述的多糖分散相颗粒，含有缓冲物质、盐类和小分子糖类物质。
全文摘要
一种利用冷冻相分离多糖玻璃体微粒的制备方法。本发明将含有多糖的两种或多种聚合物水溶液冷冻，在降温过程中发生相分离并使多糖成为分散相，然后冻干并除去连续散相得到多糖玻璃体微粒。①将聚乙二醇PEG或和多糖溶于水中通过控制浓度形成均相溶液；②将蛋白质等药物加入其中，或与多糖、聚乙二醇一并加入；③将完成步骤②的溶液在降温过程中，避免速冻条件下冷冻；④将完成步骤③的样品冻干；⑤将完成步骤④的样品用溶剂洗涤除去PEG连续相获得多糖分散相颗粒。本发明制备的微粒表面光滑圆整，均匀度好，颗粒规整无粘连，在完全无有机溶剂和不加任何交联剂及聚合物引发剂，以避免这些对药物的治疗的作用影响。
文档编号A61K47/36GK1887276SQ200610029130
公开日2007年1月3日 申请日期2006年7月20日 优先权日2006年7月20日
发明者金拓, 袁伟恩, 吴飞 申请人:上海交通大学