miR‑194‑5p的应用的制作方法

本发明涉及增生性玻璃体视网膜病变(pvr)的研究，尤其是涉及一种mir-194-5p作为增生性玻璃体视网膜病变的治疗药物的应用。
背景技术：
：增生性玻璃体视网膜病变(pvr)是指孔源性视网膜脱离后玻璃体腔内和视网膜表面的膜增生和收缩的病变，这些增生的膜可以牵拉和重新打开已经修复的裂孔，造成新的裂孔并且扭曲和遮挡黄斑，同时pvr也是最常见的导致视网膜脱离手术失败的原因，据报道其发生率为5.1％～11.7％，在最终失败的视网膜脱离手术中，75％的病因都归因于pvr，因此其也是致盲的主要原因。文献报道仅有11～25％的pvr患者经治疗后视力能够达到0.2以上。但是迄今为止对pvr的发病机制的研究仍不明确，临床上没有可用的有效治疗药物，仍主要通过玻璃体切除手术治疗，但手术较为复杂，且手术也不能彻底解决问题，术后容易复发，往往经过多次手术，患者的视功能仍逐渐下降甚至丧失，而且手术费用也很昂贵，给患者及家属带来沉重的心理负担及经济损失，因而深入研究pvr的发病机制，探寻安全有效的靶向药物治疗方法，来辅助视网膜脱离手术的成功，对于pvr的治疗具有重要的临床意义和社会价值。在增生性玻璃体视网膜病变的发病机制中，上皮-间质化(emt)被认为是最重要的机制之一。emt是指上皮细胞通过特定程序逐步转化成为具有间质表型细胞的生物学过程，如失去典型的上皮样形态，而转变为纤维样形态，并失去细胞之间的紧密连接，上皮细胞标记物如zo-1，e-cad等表达下降，而间质细胞标记物如a-sma，fn，vimentin等表达增加，细胞的增生、迁移能力增强，在多种纤维化疾病中有着重要的作用。rpe细胞在多种细胞因子的作用下发生emt是pvr的重要病理过程。zeb1是emt最主要的转录因子之一，zeb家族是脊椎动物中一类e盒结合锌指蛋白，有zeb1/tcf8和zeb2/sip1两个成员，分别由zfhx1a和zfhx1b编码，主要结构特点是其n端和c端都有c2h2锌指簇和位于中间的一段同源结构域(homeodomain,hd)，另外还有smad结合域(smadbindingdomain,sbd)和ctbp相互作用结构域(c-terminalbindingproteininteractiondomain,cid)，因此，zeb1和zeb2有相似的dna结合特异性，即每个锌指簇能够独立结合靶基因转录调控区启动子的e盒核心元件5′-cacct(g)-3′，调节靶基因的转录；同源结构域虽不能结合dna，但在蛋白质-蛋白质相互作用中起重要作用。此外，zeb家族激活或抑制基因转录是通过招募其辅激活因子p300、pcaf(p300/cbp结合因子)或辅抑制因子ctbp而起作用的。与emt密切相关的上皮和间质标志物有多种，如e-cadherin、vimentin、n-cadherin等，其中，e-cadherin是细胞紧密连接的中心复合物，作为上皮细胞的连接蛋白维持上皮的完整性，其表达的降低或缺失与肿瘤细胞的分化、分期、侵袭、转移以及预后密切相关。因此，e-cadherin是一种典型的肿瘤侵袭抑制分子，是emt最主要的标志物之一。e-cadherin的转录抑制因子主要有两大类：一类是碱性螺旋-环-螺旋结构，如twist1、twist2、e12/e47等；另一类是锌指蛋白，如snail、slug、zeb1、zeb2、klf8(krüppel-likefactor8)等。e-cadherin失调的重要机制之一是其转录水平受抑。zeb1同其他转录因子(snail、slug和e12/e47)能够直接结合e-cadherin启动子的e盒，抑制e-cadherin转录。有研究还发现，e-cadherin的表达特异性地受zeb1表达水平的影响：当zeb1表达水平高时，e-cadherin的表达受到抑制；当用sirna抑制zeb1表达时，zeb1对e-cadherin的抑制作用解除。另外，还有研究显示，能够诱导非小细胞肺癌emt的4个主要的转录因子(zeb1、sip1、snail和slug)中，zeb1引起vimentin升高和e-cadherin降低的效应更明显，形成更显著的间质表型。zeb1是e-cadherin最主要的转录抑制因子之一。lkb1基因是一种保守的抑癌基因，其编码产物是一种丝氨酸-苏氨酸激酶。lkb1参与细胞凋亡、细胞周期阻滞、细胞极性、染色体重组和新陈代谢等生物过程，并且也能调控肺癌的起始、分化和转移。lkb1基因失活很可能与肺癌细胞侵袭、转移、emt有关。zeb1表达和lkb1呈负相关，lkb1沉默或突变可促使zeb1诱发emt。zeb1直接抑制sema3f的表达。sema3f是导向蛋白家族(semaphorin)3的成员之一，也是一种有强大抗血管生成和抗转移活性的分泌性导向蛋白，zeb1水平与sema3f表达情况呈显著的负相关关系，zeb1过表达或抑制表达都会相应地影响sema3f的表达情况；zeb1通过抑制sema3f表达引起hif-1α升高，hif-1α又抑制e-cadherin表达导致细胞间黏附性降低发生emt。转化生长因子β(transforminggrowthfactorβ，tgf-β)在多种肿瘤组织中均有广泛表达，并且生物学作用复杂，如在肿瘤发生早期，tgf-β作为肿瘤抑制因子，促使肿瘤细胞生长停滞和诱导凋亡。在肿瘤发展后期，当细胞对tgf-β抑制生长的敏感度降低时，肿瘤细胞能发生emt，甚至继续恶化。肺癌细胞和基质细胞均能分泌tgf-β，并且其表达水平与癌症分期有关，而且，tgf-β能够刺激肺癌的侵袭和转移，是emt的关键诱导因子之一，可由smad通路及多条非smad通路共同调节emt相关的靶基因，如zeb1、snail等。在经典的tgf-β/smad信号途径中，tgf-β受体接受信号刺激后，使smad家族蛋白成员(主要是smad3)磷酸化而激活，激活后的smad蛋白一方面可以通过抑制分化抑制因子2(inhibitorofdifferentiation2,id2)从而抑制e2a。e2a是碱性螺旋-环-螺旋转录因子家族的成员，有e12和e47两个亚型，e12/e47可以抑制e-cadherin表达，另一方面smad可以诱导ets1(e26transformationspecific-1)表达，ets1己经证实为促癌和促肿瘤血管生成的转录因子，e2a与ets1可协同促进zeb1转录。发生emt的细胞也具有干细胞样的特性。emt的主要诱导因子tgf-β可能与干细胞途径wnt、ras、notch、hedgehog等共同影响诱导emt。emt相关的转录因子zeb1/2、snail、twist等可以作为smads的辅因子，与smads相互作用，形成emt促进smad蛋白复合物(emtpromotingsmadcomplexes,epsc)，从而抑制上皮基因，激活间质基因表达。tgf-信号激活后促进zeb1表达，从而抑制e-cadherin。环氧合酶2(cyclooxygenase-2,cox-2)是前列腺素(prostaglandin,pg)合成过程中一个关键的限速酶，可以将花生四烯酸代谢成pge2、pgd2、txa2等前列腺素产物。cox-2高表达，代谢产物pge2水平也升高，而pge2可以诱导炎症反应，活化表皮生长因子受体，zeb1表达升高，促进emt，pge2对zeb1的上调、e-cadherin的下调有剂量效应。在cox-2依赖的通路中，zeb1与pge2有直接的正相关关系，zeb1通过影响pge2的自分泌或旁分泌抑制e-cadherin的表达，从而引起emt。与zeb1相关的信号转导途径中，tgf-β信号研究得较多，并且tgf-β本身也是emt的诱导因子。另外，还有wnt/β-catenin、成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor,fgf)、notch等。显然zeb1是emt发生发展及其emt相关的信号。而本发明正是以mir-194-5p直接作用于zeb1。技术实现要素：本发明的目的就是为了探讨mir-194-5p抑制emt的机制，并提供mir-194-5p作为pvr治疗药物的应用。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：本发明所述的mir-194-5p基因号是mimat0000460，序列为uguaacagcaacuccaugugga，如seqidno.1所示。本发明发现在体外tgfβ诱导的emt细胞模型以及体内sd大鼠pvr模型中，mir-194-5p都能够有效地抑制pvr。在体外模型中，本发明利用10ng/ml的tgfβ在arpe19细胞中诱导emt，用化学合成的mir-194-5pagomir转染视网膜色素上皮细胞(arpe19)，可以降低emt相关基因a-sma、zeb1等的表达，而升高上皮相关基因zo-1等的表达，同时还能保护emt引起的紧密连接的破坏及组织细胞骨架的重构。在体内试验中，本发明利用玻璃体腔注射8ul的arpe19细胞(2.4*106)的血小板富集血浆(prp)悬液的方法成功诱导pvr模型，再通过玻璃体腔注射mir-194-5p的agomir进行治疗，与生理盐水对照组相比，发现h-89能够保护由于pvr造成的sd大鼠的erg下降以及视网膜结构的破坏。通过荧光素酶活性实验分析，发现mir-194-5p能够与zeb1的3‘-非翻译区直接互补，发挥抑制emt的作用。本发明的第一方面，提供了在体外的细胞模型中，mir-194-5p能够抑制arpe19细胞发生emt过程模拟的pvr过程。本发明的第二方面，提供了在体内的sd大鼠pvr模型中，mir-194-5p能够抑制pvr的症状，并延缓其进展。本发明的第三方面，揭示了mir-194-5p能够直接靶向zeb1的3‘非翻译区，下调zeb1，从而发挥作用。本发明的第四方面，提供了mir-194-5p作为pvr治疗药物的依据，提供了一种通过玻璃体腔注射化学合成的mir-194-5p的agomir进行pvr治疗的手段，所述的mir-194-5p的agomir的形式是胆固醇修饰而成。本发明的第五方面，提供一种增生性玻璃体视网膜病变的治疗药物，主要成分为mir-194-5p或mir-194-5p的agomir。本发明首次发现了mir-194-5p在体外以及体内的pvr模型中对pvr的抑制作用，mir-194-5p能够靶向zeb1，抑制pvr发病过程中如emt等引起的emt相关的基因表达水平改变以及紧密连接的破坏等。这些结果首次mir-194-5p可以玻璃体腔注射，作为pvr治疗的药物。与现有技术相比，本发明具有以下优点：目前pvr的治疗仍以玻璃体切除手术为主，但是手术费用昂贵，要反复手术；而mir-194-5p的agomir小分子化合物价格便宜，容易获得；而mir-194-5p能够在体内体外均有效抑制pvr的依据，同时通过玻璃体腔注射进行眼局部用药，可以避免全身用药带来的潜在风险。附图说明图1：转染psuper-mir-194-5p的arpe19细胞划痕0小时、24小时和48小时的显微镜图；图2：psuper空载体的arpe19细胞划痕0小时、24小时和48小时的显微镜图；图3：荧光定量pcr检测显示mir-194-5p抑制tgfβ1诱导的emt相关标记物zo-1在mrna水平的变化结果；图4：荧光定量pcr检测显示mir-194-5p抑制tgfβ1诱导的emt相关标记物zeb1在mrna水平的变化结果；图5：荧光定量pcr检测显示mir-194-5p抑制tgfβ1诱导的emt相关标记物vimintin在mrna水平的变化结果；图6：westernblot检测图谱；图7：westernblot检测显示mir-194-5p抑制tgfβ1诱导的emt相关标记物zeb1在蛋白水平的变化；图8：westernblot检测显示mir-194-5p抑制tgfβ1诱导的emt相关标记物nectin-1在蛋白水平的变化；图9：westernblot检测显示mir-194-5p抑制tgfβ1诱导的emt相关标记物zo-1在蛋白水平的变化；图10：免疫荧光显示mir-194-5p抑制tgfβ1诱导的emt相关标记物在细胞原位的变化结果；图11：免疫荧光显示mir-194-5p抑制tgfβ1诱导的emt相关标记物在细胞原位的变化结果；图12：荧光素酶报告系统分析mir-194-5p与zeb1的3‘-utr区相互作用结果；图13：免疫荧光显示mir-194-5p抑制大鼠pvr模型zeb1的表达结果；图14：mir-194-59抑制大鼠pvr模型的眼底照片。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例中，arpe19细胞购自atcc，培养基为dmem：f12培养基，含10％血清和1％p/s。培养环境是37℃、5％co2和95％空气。tgfβ1或者tgfβ2购买自r&d公司。h-89购自selleck公司，使用浓度为5-50um。反转录试剂盒是primescripttmrtmastermix(购自takara公司)，pcr试剂盒是superrealpremixplus(sybrgreen)(购自天根公司)。所用引物由苏州金维智公司合成。transwell小室，8um孔径(购自康宁公司)。细胞分别为转染psuper-mir-194-5p和psuper空载体的arpe19细胞。实施例1过表达mir-194-5p能够抑制tgfβ1诱导的细胞迁移的验证1、细胞处理：将细胞接种在96孔板中，转染空载体psuper和psuper-194-5p各0.1ug采用lipo2000转染试剂进行转染。2、划痕：用10ul移液枪枪头在细胞上呈“一”字划痕，然后用pbs清洗3次洗掉浮起的细胞。加入对应处理的培养基继续进行培养。3、拍照：在显微镜下分别在划痕0小时，24小时和48小时的时间点进行拍照。4、数据分析：用imagej软件进行划痕宽度的测量，获得宽度数据，然后再利用graphpadprism软件进行统计分析及作图。划痕0小时、24小时和48小时时，转染psuper-mir-194-5p的arpe19细胞和psuper空载体的arpe19细胞的显微镜图如图1、图2所示，从图1、图2可以看出，由图1、2我们可以看出经tgfβ1处理后，转染空载体arpe19细胞的增殖迁移能力明显增强，48小时后划痕距离减少，转染psuper-mir-194-5p细胞的增殖迁移能力下降特别明显，说明过表达1mir-194-5p能够抑制tgfβ1诱导的迁移。实施例2荧光定量pcr检测显示mir-194-5p抑制tgfβ1诱导的emt相关标记物在mrna水平的变化：将正常对照、tgfβ处理的转染psuper-mir-194-5p和psuper空载体的arpe19细胞分别用1mltrizol收集在1.5ml管中，进行抽提总rna。经过逆转录和实时定量pcr分析，采用半定量的方法计算。主要步骤如下：1.向trizol收集的样品中，加入五分之一200ul体积的氯仿，剧烈混匀后，以12000rpm的转速4℃离心10分钟。2.离心后，将上清转移到新的离心管中，注意不要取到中间的蛋白层，加入等体积的异丙醇。3.12000rpm的转速4℃离心10分钟，弃去上清，将沉淀用75％的乙醇洗1-2次。4.将沉淀室温干燥后，用适量的20uldepc水溶解。5.nanodrop定量，并计算反转录所需的体积。6.rna反转录：(1)20ul的体系，1000ng的rna，取4ul的takara的逆转录试剂supermix，再加ddh2o补到20ul.(2)反转录程序：37℃15分钟，85℃5秒，然后可于-20℃冰箱保存备用。7.定量pcr(1)将rna反转录后得到的cdna10倍稀释作为为模板，设计引物如表1。(2)利用天根公司的sybrgreen实时荧光定量pcr检测试剂盒，q-pcr的体系为20ul,2ul的cdna模板，1ul的引物，10ul的2xpcrmix，7ul的ddh2o，检测目的基因的表达量。pcr扩增条件如下：94℃变性10分钟，进入循环(95℃5sec，60℃60sec)，一共40个循环，并收集溶解曲线。(3)数据分析，采用2-△△ct法进行处理，以gapdh做为内参。实验结果如图3、4、5所示，图3、4、5分别为荧光定量pcr检测显示mir-194-5p抑制tgfβ1诱导的emt相关标记物zo-1、zeb1、vimintin在mrna水平的变化结果；说明psuper-mir-194-5p能够有效地抑制arpe19细胞的增殖迁移。通过图3、4、5可以看出，经tgfβ1处理有，与转染空载体相比，转染psuper-194-5p细胞紧密连接蛋白zo-1升高，zeb1和vimintin的mrna下降。表1q-pcr中所用到的引物序列gapdh-forwardaggtcggtgtgaacggatttggapdh-reversetgtagaccatgtagttgaggtcazo-1-forwardattgtcgtcgcatgtagatcczo-1-revrsegggttcataggtcagattaggca-sma-forwardaatgcagaaggagatcacgga-sma-reversetcctgtttgctgatccacatcnectin-1-forwardcggatggacgtgaagctcnectin-1-reversecaggctgtagttgatgggtcvimentin-forwardcgtgaataccaagacctgctcvimentin-reverseggaaaagtttggaagaggcag实施例3westernblot检测显示mir-194-5p抑制tgfβ1诱导的emt相关标记物在蛋白水平的变化：将正常对照、tgfβ处理的转染psuper-mir-194-5p和psuper空载体的arpe19细胞进行蛋白抽提。1、蛋白的提取：将细胞接种在6cm的细胞培养皿中，经相应的处理后，加150μl含有proteaseinhibitorcocktail的ripa裂解液，用细胞刮收集细胞到新的ep管中，放冰上孵育30分钟，10000rpm，4℃离心15分钟，轻轻吸出上清至干净的离心管中，-80℃保存备用。2、蛋白浓度的测定：蛋白定量采用bca定量法，具体方法如下：配制标准蛋白溶液2μg/μl,-20℃保存备用；根据标准品和样品的数目配制工作液，试剂a和试剂b按50:1的体积比充分混匀，现配现用；工作液总体积＝(标准品个数+待测样品个数)×(2个复孔数)×(200μl工作液)。将标准品按0μl、1μl、2μl、4μl、8μl、16μl的体积加到酶标孔中，每孔加入200μl的bca工作液，制作标准曲线；待测样品每孔加入2μl，再加入200μl的bca工作液，37℃孵育30分钟；用多功能酶标仪测定560nm处的吸光度值。3、蛋白样品的准备：根据准备上样的蛋白量和蛋白浓度，加入5×loadingbuffer，混合后于100℃加热10分钟，使其充分的变性，4℃，12000rpm，离心2分钟，除去沉淀，-80℃贮存备用。4、sds-page电泳：分离胶的制备：10％的分离胶(10ml)配制方法如下：30％聚丙烯酰胺3.3ml，ddh2o2.7ml，1mtris(ph8.8)3.8ml，10％sds0.1ml，10％过硫酸铵0.1ml，temed0.004ml；灌胶前加aps和temed，加完后充分混匀，迅速灌胶。用移液枪将配制好的分离胶溶液缓慢加入到装配好的玻璃板中，分离胶溶液高度约为6cm，给浓缩胶留出1.5cm高的位置，加好后在凝胶顶部缓缓加入无水乙醇促进胶凝，使凝胶表面呈一条直线；放置1小时左右直到凝胶完全凝固，当无水乙醇和凝胶之间有一条折线时说明凝胶已经凝固，倒掉胶上的无水乙醇，用滤纸吸干。制备5％的浓缩胶(4ml)方法如下：30％聚丙烯酰胺0.67ml，ddh2o2.7ml，1mtris(ph6.8)0.5ml，10％sds0.04ml，10％过硫酸铵0.04ml，temed0.004ml；灌胶前加aps和temed，加完后充分混匀，迅速灌胶。用移液枪将配制好的浓缩胶溶液缓慢加入分离胶的上层，直至玻璃板的边缘，然后小心插入梳子，注意不要产生汽包，放置约1小时左右凝胶，凝胶之后拔出梳子，准备电泳。将准备好的蛋白样品和蛋白标记分子加入到加样孔中，防止气泡产生，使用bio-rad电泳仪，槽内加满电泳液以后即可开始电泳，电泳条件为：80v电压，30分钟，换120v电压，1小时30分钟左右。电泳至溴酚蓝刚好跑出分离胶底部停止。5、转膜：sds-page凝胶电泳结束以后，将玻璃板撬开后小心分离出凝胶，切去浓缩胶的部分，保留分离胶，浸泡于去离子水中；剪取与凝胶大小相似的pvdf膜放入无水甲醇中浸泡2分钟；将切好的凝胶、滤纸以及事先用无水甲醇浸泡过的pvdf膜放入转膜平衡液中平衡10分钟；采用bio-rad的转膜系统，以夹三明治的方式，从黑面到白面的顺序依次为：黑面(负极)-海绵垫-滤纸-凝胶-pvdf膜-滤纸-海绵-白面(正极)，滤纸、凝胶和pvdf膜要对齐，彻底清除内部气泡，然后放入装满转膜液的转膜仪中，转膜条件为300毫安，2小时；转膜槽置于冰浴中。转膜结束后可以参考蛋白marker转上pvdf膜作为转膜成功的标志，也可将膜用1×丽春红染液染色，然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。6、免疫杂交反应：用1×pbst洗掉丽春红，配置5％的bsa闭液，室温封闭1小时。加入用pbst稀释的一抗，4度过夜；1×pbst洗膜3次，每次10。加入pbst稀释的hrp标记的二抗，室温1小时。1×pbst洗膜3次，每次10。ecl化学发光采集结果，以gapdh作为对照内参。7、数据统计分析：用imagej软件western条带的灰度分析，然后与对应的gapdh进行相比，然后再利用graphpadprism软件进行统计分析及作图。mir-194-5p抑制tgfβ1诱导的emt相关标记物在蛋白水平的变化实验结果如图6、7、8、9所示，由图6、7、8、9可知经tgfβ1理后，紧密连接蛋白zo-1表达下降，而emt相关基因zeb1表达量明显上升，在mir-194-5p组zeb1明显下降，zo-1上升，nectin-1蛋白水平没有变化。实施例4免疫荧光显示mir-194-5p抑制tgfβ1诱导的emt相关标记物在细胞原位的变化。1、细胞处理：将细胞接种于预置在培养皿中的玻片上，经相应的处理之后，取出玻片；2、固定：用4％多聚甲醛固定10分钟，pbs洗3次，每次5分钟；3、透膜：0.1％tritonx-100透膜10分钟，pbs洗3次，每次5分钟；4、封闭：5％马血清室温封闭1小时；5、一抗：加5％马血清室稀释的一抗，置于湿盒内防止干燥，4℃孵育过夜；6、二抗：pbs洗3次，每次5分钟；加5％马血清室稀释的荧光素酶标记的与一抗同种属来源的二抗，置于湿盒内，避光37℃孵育1，pbs洗3次，每次5分钟；7、染核：用0.5μg/mldapi染细胞核3分钟，pbs洗3次，每次5分钟；8、封片：用荧光封片剂封片。9、拍照：用激光共聚焦显微镜，在油镜，600倍放大进行拍照。免疫荧光显示mir-194-5p抑制tgfβ1诱导的emt相关标记物在细胞原位的变化实验结果如图10所示，nectin-1、occludin和zo-1定位在细胞膜，经tgfβ1理后，转染空载体的arpe19细胞之间的紧密连接被破坏细胞膜zo-1、nectin-1、occludin染色不连续，转mir-194-5p的arpe19则膜定位的zo-1、nectin和occuldin相对完整连续。如图11所示，经如图10、11中紧密连接蛋白zo-1的染色所示；zeb1转位如核，而在转染mir-194-5p的arpe19保护了tgfβ1对细胞紧密连接的破坏，减少核内的zeb1。实施例5mir-194-5p对zeb13-utr的相互作用在hek293t细胞系转入mirna-194-5p质粒和psicheck-2质粒(含有zeb13’-utr区域)，检测荧光素酶的活性，荧光素酶活性检测试剂盒购自promega。转染质粒时，采用的是invitrogen公司的lipofectamine2000脂质体，主要步骤如下：1.前一天先将细胞按照50％左右的密度铺在六孔板里。2.转染前将培养基换成无血清无抗生素的dmem培养基，然后取两个灭菌的离心管，各加入250μl无血清无抗生素的培养基，再分别加入5μl的脂质体和4μg的质粒(mir-194-5p和psicheck2质粒各2ug)，各自混匀后，静置5分钟。3.将含有脂质体的培养基加入到含有质粒的培养基中，混匀，30分钟后均匀滴加到细胞里。4.6小时后换成正常的高糖dmem培养基继续培养，转染36小时，裂解进行报告基因检测。结果参见图12。通过报告基因分析支持过表达mir-194-5p与zeb1的3’-utr相互作用。图12可以看出，在hek293中，mirna-194-5p过表达降低荧光素酶的活性。实施例6mir-194-5p抑制pvr大鼠的干预的眼底检查玻璃体腔注射pvr造模1、大鼠准备：6-8w的sd大鼠购自斯莱克公司，饲养在同济大学动物中心。，160～180g重，随机分为三组，pbs对照组，模型组(arpe19+prp)，治疗组(arpe19+prp+h89)。2、细胞准备：取体外培养的arpe19细胞，p10-p15之间，调节细胞浓度使得每只眼的细胞数量为2.4*106，分到两个ep管中分别为模型组合治疗组，置于冰上备用。3、血小板富集血浆(prp)的制备：将大鼠固定于鼠笼内，鼠尾暴露于笼外。穿刺前用酒精棉球擦拭鼠尾，将5号头皮针和1ml注射器相连接，用肝素钠稀释液冲洗针头和注射器；右手持针，左手拇指在上、示指在下捏住鼠尾，将鼠尾略弯曲以使进针处血管和针头方向平行，针头平行于鼠尾刺破表皮后继续进针3-5mm，针头进入尾静脉见回血，左手捏住鼠尾，右手推拉1ml注射器活塞，制造负压进行取血；取血结束后，应用脱脂棉球按压针眼部位30s，确定止血后放开大鼠。将取得的血转移到含3.8％枸橼酸钠的采血管内，低温离心，1000g，1min，其上清液为prp。4、arpe19+prp悬液制备：按照已经计算好的细胞量和注射量，分别用prp重悬arpe19细胞，模型组为arpe19+prp，治疗组为arpe19+prp+mir-194-5p；mir-194-5p的量为100-50um。5、玻璃体腔注射：注射前大鼠腹腔注射2％戊巴比妥钠(1ml/400g体重)进行麻醉，1×速眠新(0.1ml/200g)进行肌肉松弛，然后给予一滴0.5％托吡卡胺散瞳(wuxishanhegroup，jiangsu，china)，一滴0.4％盐酸奥布卡因表面麻醉(eisaicoltd，tokyo，japan)。在体视显微镜下，先用1ml注射器自角膜缘后垂直进针扎一小孔，然后再用注射针由该孔向玻璃体腔内注入相应液体。每只眼的注射体积为8ul。数据如图14所示，control为正常对照显示眼底血管结构清晰，pvr组眼底照相出现血管部分弯曲，造模组对视网膜结构造成明显损伤，且有前膜形成，说明联合注射arpe19细胞和血小板富集血浆的方法能够成功诱导pvr模型。mir-194-5p治疗组显示为眼底血管结构明显好于造模组。实施例7mir-194-5p对pvr大鼠模型的zeb1表达眼球冰冻切片的制备1.眼球准备：pvr造模后的sd大鼠在不同时间点收取眼球样本，sd大鼠脱臼处死后，仔细摘除眼球，注意保留视神经；2.固定：置于4％多聚甲醛固定过夜；3.解剖：在解剖显微镜下沿角巩膜缘上缘解剖眼球，小心去除角膜，虹膜和晶状体，形成完整的视杯，注意操作轻柔防治造成视网膜脱离；4.脱水：用30％的蔗糖过夜脱水；5.包埋：用组织包埋液oct包埋4℃平衡过夜；6.液氮速冻：将眼球用液氮快速冷冻，冷冻之前使得眼球的位置尽量垂直居中。-80℃保存冰冻样品。7.切片：用冰切机按8μm的厚度进行连续切片，取过视神经乳头的切片。将切片放在-80℃保存，使用前吹干。视网膜冰冻切片免疫荧光1.切片准备：取实施例7中所得的眼球冰冻切片样品进行免疫荧光染色检测。2.烤片：50℃烤片半小时。3.固定：4％pfa固定10分钟，再用pbs清洗三次，每次5分钟。4.透膜：用0.25％triton-x100透膜15min，pbs洗3次，每次5min。5.封闭：5％马血清室温封闭1小时；6.一抗：加5％马血清稀释的相应一抗，置于湿盒内防止干燥，4℃孵育过夜。7.二抗：pbs洗3次，每次5min；加5％马血清稀释的荧光素酶标记的与一抗同种属来源的二抗，置于湿盒内，避光37℃孵育1小时。8.dapi染核：pbs洗3次，每次5min；用0.5μg/mldapi染细胞核1min，pbs洗3次，每次5min。9.封片：用荧光封片剂封片。10.拍照观察：在显微镜下拍照观察。如图13所示，为2w的眼球冰冻切片免疫荧光照片，其中蓝色为dpai染核，高亮的白色为emt标记物zeb1，而经mir-194-5p治疗后，眼球结构的破坏减轻，同时zeb1的表达量也下降，进一步说明mir-194-5p对pvr有治疗作用。上述的对实施例的描述是为便于该
技术领域：
的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。<110>同济大学<120>mir-194-5p的应用<160>11<210>1<211>22<212>dna<213>人工序列<400>1uguaacagcaacuccaugugga22；<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列<220><221>gapdh-forward<400>2aggtcggtgtgaacggatttg21；<210>3<211>23<212>dna<213>人工序列<220><221>gapdh-reverse<400>3tgtagaccatgtagttgaggtca23；<210>4<211>21<212>dna<213>人工序列<220><221>zo-1-forward<400>4attgtcgtcgcatgtagatcc21；<210>5<211>22<212>dna<213>人工序列<220><221>zo-1-revrse<400>5gggttcataggtcagattaggc22；<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<220><221>a-sma-forward<400>6aatgcagaaggagatcacgg20；<210>7<211>21<212>dna<213>人工序列<220><221>a-sma-reverse<400>7tcctgtttgctgatccacatc21；<210>8<211>18<212>dna<213>人工序列<220><221>nectin-1-forward<400>8cggatggacgtgaagctc18；<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列<220><221>nectin-1-reverse<400>9caggctgtagttgatgggtc20；<210>10<211>21<212>dna<213>人工序列<220><221>vimentin-forward<400>10cgtgaataccaagacctgctc21；<210>11<211>21<212>dna<213>人工序列<220><221>vimentin-reverse<400>11ggaaaagtttggaagaggcag21；当前第1页12