白蛋白融合的Kunitz结构域肽的制作方法

专利名称：：白蛋白融合的Kunitz结构域肽的制作方法白蛋白融合的Kunitz结构域肽相关申请本申请要求2002年2月7日申请的美国临时申请系列号60/355,547的优先权。本文以其整体引用该申请的公开内容作为参考。发明领域本发明涉及Kunitz结构域肽和白蛋白融合蛋白领域。更具体地说，本发明涉及用于治疗，预防，或改善疾病或紊乱的Kunitz结构域肽和白蛋白融合蛋白。发明背景Kunitz结构域是形成中央反向平行0折叠和短C-末端螺旋的大约51_64个残基的折叠结构域(参见，例如，美国专利号6,087,473,本文以其整体引用以供参考)。该特征性结构域包含形成3个二硫键的6个半胱氨酸残基，导致产生双环结构。N-末端区和第一P链之间存在活性抑制结合环。该结合环通过P2Cw残基与最后2个P链之间形成的发夹环以二硫键结合。来自各种蛋白酶抑制剂的分离的Kunitz结构域显示出具有抑制活性(例如，Petersen等，Eur.J.Biochem.125:310-316,1996;Wagner等，Biochem.Biophys.Res.Comm.186:1138-1145，1992;Dennis等，J.Biol.Chem.270:25411-25417，1995)。连接的Kunitz结构域也显示出具有抑制活性，例如，在美国专利号6,087,473中讨论。含有一个或多个Kunitz结构域的蛋白酶抑制剂包括组织因子途径抑制剂(TFPI),组织因子途径抑制剂2(TFPI-2),淀粉样P-蛋白前体(APPP)，抑酶肽和胎盘bikunin。TFPI,即一种外源性途径抑制剂和天然抗凝剂，含有3个串联连接的Kunitz抑制剂结构域。氨基末端的Kunitz结构域抑制因子VIIa,纤溶酶，和组织蛋白酶G;第二个结构域抑制因子Xa,胰蛋白酶，和胰凝乳蛋白酶；第三个结构域无已知活性(Petersen等，出处同上)。以前的一些研究证实了Kunitz结构域肽对丝氨酸蛋白酶的抑制活性。在下面的段落中讨论诸如血浆激肽释放酶，纤溶酶，和嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的丝氨酸蛋白酶被Kunitz结构域肽抑制的研究结果。血浆激肽释放酶抑制剂激肽释放酶是在组织和血浆中都可发现的丝氨酸蛋白酶[参见，例如，Markland的美国专利号6,333,402,在此以其整体引用以供参考]。血浆激肽释放酶与接触激活(内源性途径)凝血，纤维蛋白溶解，低血压，和炎症相关[参见Bhoola，K.D.，C.D.Figueroa，和K.Worthy,PharmacologicalReviews(1992)44(1)1-80]。激肽释放酶的这些效果通过3种不同生理底物的活性介导i)因子XII(凝血)，ii)尿激酶原/纤溶酶原(纤维蛋白溶解)，和iii)激肽原(低血压和炎症)。激肽释放酶裂解激肽原导致产生激肽，即小的高效生物活性肽。激肽通过细胞表面受体起作用，该受体称为BK-1和BK-2，存在于包括内皮，上皮，平滑肌，神经，腺和造血细胞的各种细胞类型中。细胞内异源三聚体G-蛋白连接激肽受体与包括氧化氮，腺苷酸环化酶，磷脂酶A2和磷脂酶C的第二信使途径。激肽的重要生理活性包括(i)增加血管透性；(ii)血管舒张；(iii)支气管痉挛；和(iv)诱导疼痛。因此，激肽介导与菌血症(脓毒)或外伤相关的威胁生命的血管中风和水肿，哮喘的水肿和导气管反应过强，与组织损伤相关的炎症和神经性疼痛。血浆激肽释放酶活性不当并导致激肽产生的后果在遗传性血管水肿(HAE)患者中有明显表现。HAE由Cl-抑制剂，即血浆激肽释放酶的主要内源性抑制剂的遗传缺陷引起。HAE的症状包括皮肤，皮下组织和胃肠道的水肿，腹痛和呕吐。几乎三分之一的HAE患者由于喉头和上呼吸道水肿引起的窒息死亡。激肽释放酶以酶原(前激肽释放酶)形式分泌，该酶原作为无活性分子循环直到由蛋白水解事件活化[Genebank登录号P03952显示了人血浆前激肽释放酶]。体内血浆激肽释放酶(pKA)的一种重要抑制剂是Cl抑制剂；(参见Schmier,等，《HemostasisandThrombosis》第2章，"接触活化及其异常，，，Colman，RW，JHirsh,VJMarder,和EWSalzman编，第二版，1987，J.B.LippincottCompany,Philadelphia,PA.,第27-28页)。Cl是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂且与pKA形成不可逆或几乎不可逆的复合物。尽管牛胰腺胰蛋白酶抑制剂(也称为BPTI,抑酶肽，或TrasylolTM)最初认为是Ki-320pM的强pKA抑制剂[Auerswald，E.-A.，D.Hoerlein,G.Reinhardt,W.Schroder,和E.Schnabel,Bio.Chem.Hoppe-Seyler，(1988),369(Supplement):27-35],但是最近的报道[Berndt,等，Biochemistry,32:4564-70,1993]表明其对血浆激肽释放酶的Ki为30nM(即，30,000pM)。G36S突变型具有超过500nM的K"Markland等[美国专利号6,333,402;5,994,125;6,057,287;和5，795，865;各文献以其整体在此引用以供参考]要求保护在抑制人血浆激肽释放酶中具有高亲和力和特异性的许多衍生物。一种这类蛋白质在患有HAE的人类患者中进行试验。尽管以前表明该化合物是安全和有效的，但是作用的持续时间比期望的要短。纤溶酶抑制剂纤溶酶是纤溶酶原产生的丝氨酸蛋白酶。纤溶酶的催化区(或"CatDom")裂解肽键，特别是在精氨酸残基之后的肽键且在赖氨酸之后的裂解程度较小，该催化区与胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，激肽释放酶，和许多其它的丝氨酸蛋白酶具有高度同源性。纤溶酶的最大特异性由血纤蛋白的kringles结合产生(Lucas等，JBiologicalChem(1983)258(7)4249-56;Varadi&Patthy，Biochemistry(1983)22:2440-2446;和Varadi&Patthy,Biochemistry(1984)23:2108-2112)。活化时，裂解ARGs6广Val562之间的键，使得新产生的游离氨基末端形成盐桥。然而，kringles通过两个二硫键保持附着到CatDom上(Colman，RW，JHirsh,VJMarder，和EWSalzman编，《HemostasisandThrombosis》，第二版,1987，LB.LippincottCompany,Philadelphia,Pa.，Bobbins,1987，出处同上)。主要负责纤维蛋白溶解的试剂是纤溶酶，即纤溶酶原的活化形式。许多物质可活化纤溶酶原，包括活化的Hageman因子，链激酶，尿激酶(uPA)，组织型纤溶酶原激活剂(tPA)，和血浆激肽释放酶(pKA)。pKA是尿激酶的酶原形式的激活剂和直接的纤溶酶原激活剂。纤溶酶在正常循环血液中检测不到，但是纤溶酶原，即酶原以大约3(iM存在。另一含量不可测的纤溶酶原与血纤蛋白和细胞外基质和细胞表面的其它成份结合。正常血液含有大约2pM的纤溶酶生理抑制剂，(X2-纤溶酶抑制剂((X2-PI)。纤溶酶与Ot2-PI形成1:1的复合物。基质或细胞结合的纤溶酶相对难以受到OC2-PI的抑制。因此，纤溶酶的活化可超出OC2-PI的中和能力而产生血纤蛋白原裂解状态。一旦形成，纤溶酶可i)降解血纤蛋白凝血块，有时过早降解凝血块；ii)消化血纤蛋白原(凝血块的组成材料)，通过引起从降解产物形成脆弱的，容易裂解的凝血块，和通过血纤蛋白原降解产物抑制血小板附着/聚集而削弱止血；iii)直接与血小板相互作用以裂解糖蛋白Ib和1Ib/IIIa,防止附着到高剪切血流区的损伤内皮上并削弱形成血小板栓塞所需的聚集反应(Adelman等,Blood(1986)68(6)1280-1284);iv)通过蛋白水解灭活外源性凝血途径中的酶，进一步促进蛋白裂解状态。Robbins(Robbins,《HemostasisandThrombosis》第21章，Colman,R.W.,J.Hirsh,V.J.Marder,和E.W.Salzman编，第二版，1987,J.B,LippincottCompany,Philadelphia,PA)详细综述了纤溶酶原-纤溶酶系统。该出版物(即，Colman，R.W.，JHirsh，V,J.Marder,和E.W,Salzman编，《HemostasisandThrombosis》，第二版，1987，J.B.LippincottCompany,Philadelphia,PA)在此引用以供参考。if举f^溶麻和if举蛋^^溶席纤维蛋白溶解和纤维蛋白原溶解不当导致出血过多是诸如心肺旁路的需要体外循环的手术操作中常见的并发症，且也在血栓溶解疗法和特别是肝脏的器官移植中遇到。以出血素质发生率高为特征的其它临床病症包括肝硬化，淀粉样变性，急性早幼粒细胞白血病和实体瘤。恢复止血需要冒着免疫反应和接触诸如肝炎病毒和HIV的病原体的风险输注血浆和/或血浆产品o甚至大量灌注高度失血亦可抵抗稀释。当判断有生命危险时，用诸如c画氨基己酸(参见Hoover等，Biochemistry(1993)32:10936-43)(EACA),氨曱环酸(tranexarnicacid),和抑肽酶(Neuhaus等，Lancet(1989)2(8668)924-5)的抗纤维蛋白溶是纤溶酶的直接抑制剂且是这些试剂中最有效的。由于存在血栓形成并发症，肾脏毒性，和对于BPTI有免疫原性的可能性，这些试剂需慎重使用且通常用作"最后手段(lastresort)"(Putterman，ActaChirScand(1989)155(6-7)367)。这三种抗纤维蛋白溶解剂都缺乏靶特异性和亲和性且通过未鉴定的代谢途径与组织和器官相互作用。由于亲和性低需要大剂量，由于缺乏特异性而引起副作用，和存在免疫反应和器官/组织毒性的可能性增大了使用这些抗纤维蛋白溶解剂预防出血或作为常规手术后疗法避免或减少输血治疗的争议。因此，需要一种安全的抗纤维蛋白溶解剂。该试剂的必要特性有i)中和相关靶纤维蛋白溶解酶；ii)以高亲和性与靶酶结合以最小化剂量；iii)对靶具有高度特异性以减小副作用；和iv)与人蛋白质具有高度相似性以最小化可能的免疫原性和器官/组织毒性。作为被有效抗纤维蛋白溶解剂抑制的候选靶的所有纤维蛋白溶解酶都是胰凝乳蛋白酶同源的丝氨酸蛋白酶。凝血活性缺陷，纤维蛋白溶解活性升高，或两种情况相结合可引起出血过多。在大多数出血素质中必须控制纤溶酶的活性。据认为在减少失血中BPTI的临床上有益的效果由其对纤溶酶(Ki0.3nM)或血浆激肽释放酶(Ki~100nM)或者两种酶的抑制产生。Garddl[Toxicol.Pathol.(1993)21(2)190-8]综述了通常使用的血栓溶解剂，并阐明尽管血栓溶解剂(例如，tPA)确实可开通血管，但是出血过多是一个严重的安全问题。尽管tPA和链激酶具有短的血浆半衰期，但是它们活化的纤溶酶在系统中保持较长的时间，且正如所述，该系统可能存在纤溶酶抑制剂缺陷。因此，纤溶酶原过度活化可导致危险的凝血无力和有害的或致命的出血。一种有效的，高特异性的纤溶酶抑制剂在这种情况下将是有用的。BPTI是一种有效的纤溶酶抑制剂。然而，已发现其抗原性足够大以致于第二次使用需要进行皮试。另外，控制出血所需的BPTI剂量相当高且作用机制不清楚。有人认为BPTI对纤溶酶起作用，而其他人认为它通过抑制血浆激肽释放酶起作用。Fraedrich等[ThoracCardiovascSurg(1989)37(2)89-91]报道了对80个心脏打开手术患者使用大约840mg剂量的BPTI减少几乎一半的失血，且平均输血量减少74%。MilesInc.最近在美国引入TmsylolTM以减少手术出血[参见Miles关于Trasylol的产品宣传册，在此引用以供参考]。Lohmann和Marshal[RefractCornealSurg(1993)9(4)300-2]表明纤溶酶抑制剂可用于控制眼科手术中的出血。Sheridan等[DisColonRectum(1989)32(6)505-8]报道了BPTI可用于限制结肠手术中的出血。与BPTI几乎一样有效或者更有效但与人蛋白区几乎相同的纤溶酶抑制剂可提供相似的治疗潜力但产生的抗原性潜力更小。纤溶酶是血管生成中的关键酶。O'Reilly等[Cell(1994)79:315-328]报道了纤溶酶的38kDa片断(缺少催化区)是一种有效的转移抑制剂，表明抑制纤溶酶在阻断肿瘤转移中有用[Fidler&Ellis,Cell(1994)79:185-188;也参见Ellis等，AnnNYAcadSci(1992)667:13-31;O'Reilly等，Fidler&Ellis,和Ellis等，在此引用以供参考]。嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制嚢性纤维变性是一种影响肺，胃肠，和生殖系统的遗传性常染色体隐性疾病。在全世界有80,000例流行，CF的发病率估计为每3500人中有1例[嚢性纤维变性基金会，iJeg^o^j""wa/iepo",Bethesda，Maryland,1999年9月]。CF中的遗传缺陷在1989年描述为在508位置缺失单个苯丙氨酸(AF508)，产生缺陷型嚢性纤维变性跨膜传导调节蛋白(CFTR)，它可抑制Cr(和由此引起的Na+和水)的再吸收[Rommens，J.M.，等，"嚢性纤维变性基因的鉴定:染色体步查和跳查"，>SWe"ce245:1059,1989;Riordan，J,R.,等，"嚢性纤维变性基因的鉴定克隆和互补DNA",Sc/e"ce245:1066,1989;Kerem，B.,等，"嚢性纤维变性基因的鉴定遗传分析"，Sc/e"ce245:1073,1989]。在CFTR中发现了非AF508的突变且可引起CF。干燥的粘液随后可能堵塞呼吸，胃肠，和生殖系统中的许多通道。CF中75%以上的死亡率由呼吸并发症引起[嚢性纤维变性基金会，ieg&^j;799S^wwa/DatoiepoW,Bethesda,Maryland,1999年9月]。尽管在cf个体中出生前存在胰腺，肝脏，和肠疾病，但是cf的肺在出生时是正常的，直到受到感染和炎症攻击。随后，cf肺中的cr再吸收缺陷导致通过从导气管取走钠，伴随着随后被动取走水引起导气管分泌物干燥。然后干燥的分泌物可通过将细菌截留在非常适合于不同微生物病原体定居的环境中而干扰粘膜纤毛的清除作用[Reynolds,H.Y.,等，"粘膜绿脓假单胞菌(尸"M^mo"osawMg/"o^):患有慢性肺疾病的青年中嚢性纤维变性的征兆",JAMA236:2190,1976]。继发的肺感染和炎症募集并活化可释放嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)的嗜中性粒细胞。在呼吸上皮表面嗜中性粒细胞主导的炎症产生嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的慢性上皮负担。CF肺内过量的NE迅速超过内源性抗蛋白酶。另外，NE刺激促炎介质的产生并裂解补体受体和IgG,从而削弱宿主防止更多细菌定居的防御机制[Tosi，M.F.，等，"嗜中性粒细胞弹性蛋白酶裂解调理的假单胞菌属(尸^^fomo"05)上的C3bi和嗜中性粒细胞上的CR1以产生功能重要的调理素受体错配"，C//"./"veW.86:300，1990]。感染因此变得更持久，且^t动进行的炎症和过量水平的NE破坏导气管上皮，引起支气管扩张，和肺功能的进行性丧失和死亡。对患有CF的患者的一种治疗方案是通过诸如妥布霉素和ciprofloxin的系统抗微生物剂消灭CF病原体。尽管这些特定的抗微生物剂表现出在清除感染和改善肺功能中有效，但是分别在7.5%和9.6%的CF患者中报道了对妥布霉素和dprofloxin具有抗生素抗性[嚢性纤维变性基金会，户a"en/^egW77^5^"m^/Datoiepc^，Bethesda,Maryland,1999年9月]。在CF患者中60%感染绿脓假单胞菌(户^n^/wwfl)且41%感染金黄色酿脓葡萄球菌(S.aw^M),随着对CF使用这些抗微生物剂的增加，药物抗性选择压力也增力口。在患有CF的患者中肺功能也是治疗的目标。Pulmozymes(链球菌DNA酶a),即一种通过水解痰中的DNA降低粘液粘弹性的重组人脱氧核糖核酸酶，在临床试—险中已表明治疗8天后可增加FEV,和FVC。该变化持续6个月，并伴随着静脉内抗生素使用的减少[Fuchs，H.L.,等，"烟雾化重组人脱氧核糖核酸酶对呼吸症状加重和嚢性纤维变性患者肺功能的效果"，iV.￡"g/.331:637-642,1994]。另一治疗方案是使用蛋白酶抑制剂消除NE对弹性蛋白酶降解及其后遗症的直接影响。中和过多的NE可恢复正常体内平衡，保护细胞外肺基质。肺内正常的抗蛋白酶活性可保护弹性蛋白，通过减少嗜中性粒细胞反应降低粘液粘度，并保护肺功能，从而降低CF的死亡率。另外，恢复补体介导的吞噬作用可允许免疫系统清除细菌性病原体，导致肺感染的发生率，持续时间，和严重性降低。例如，在CF的大鼠模型中，用od抗胰蛋白酶治疗7天后细菌数与安慰剂组中的85±21相比减少到0.2士0.4[Cantin,A.和Woods,D,"慢性绿脓假单胞菌肺感染模型中烟雾化的Prolastin抑制细菌增殖"，爿m7A，>"0〃160:1130-1136,1999]。本发明小结本发明涉及含有与白蛋白融合的Kunitz结构域肽的蛋白质。这些融合蛋白本文统称为"本发明的白蛋白融合蛋白"。本发明的这些融合蛋白表现出体内半衰期延长和/或在溶液中的治疗活性延长。本发明包含治疗性白蛋白融合蛋白，组合物，药用组合物，剂型和试剂盒。本发明还包含编码本发明的白蛋白融合蛋白的核酸分子，以及含有这些核酸的载体，用这些核酸和载体转化的宿主细胞，和使用这些核酸，载体，和/或宿主细胞制备本发明的白蛋白融合蛋白的方法。本发明的一个目的是提供含有Kunitz结构域肽或其片断或变异体，和白蛋白，或其片断或变异体的白蛋白融合蛋白。用于该白蛋白融合蛋白的合适的Kunitz结构域肽包括DX-890，DX-88,DX-1000，和DPI-14。Kunitz结构域肽部分任选可通过接头与白蛋白部分隔开。本发明的另一目的是提供包含白蛋白融合蛋白以抑制丝氨酸蛋白酶的组合物和方法，该丝氨酸蛋白酶的非限制性例子包括血浆激肽释放酶，纤溶酶和嗜中性粒细胞弹性蛋白酶。本发明的另一方面是提供含有至少两个Kunitz结构域肽或其片断或变异体的白蛋白融合蛋白，其中至少一个Kunitz结构域肽或片断或变异体具有诸如抑制纤溶酶，激肽释放酶，或人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的功能活性。本发明还有另一方面是提供含有Kunitz结构域肽，或其片断或变异体，和白蛋白，或其片断或变异体的白蛋白融合蛋白，其中该白蛋白具有白蛋白活性，与未融合状态下的Kunitz结构域肽或其片断或变异体的体内半衰期相比，该白蛋白活性可延长诸如DX-8卯，DX-88,DX-1000,和DPI-14的Kunitz结构域肽，或其片断或变异体的体内半衰期。本发明还有另一方面是提供含有Kunitz结构域肽，或其片断或变异体，和白蛋白，或其片断或变异体的白蛋白融合蛋白，其中本发明的白蛋白融合蛋白在生理学pH下溶解度增加。本发明的另一方面是提供含有Kunitz结构域肽，或其片断或变异体，和白蛋白，或其片断或变异体的白蛋白融合蛋白，其中Kunitz结构域肽，或其片断或变异体与白蛋白N-末端或与白蛋白片断或变异体的N-末端融合。作为选择，本发明还提供了含有Kunitz结构域肽，或其片断或变异体，和白蛋白，或其片断或变异体的白蛋白融合蛋白，其中Kunitz结构域肽，或其片断或变异体与白蛋白C-末端或与白蛋白片断或变异体的C-末端融合。本发明还提供了含有白蛋白融合蛋白和药用上可接受的载体的组合物。本发明的另一目的是提供治疗患有嚢性纤维变性，嚢性纤维变性相关性疾病或紊乱，或可用包含DX-890和/或DPI-14的Kunitz结构域肽调节的疾病或紊乱的患者的方法。该方法包含施用有效量的白蛋白融合蛋白的步骤，该白蛋白融合蛋白含有包含DX-890和/或DPI-14的Kunitz结构域肽，或其片断或变异体，和白蛋白，或其片断或变异体。本发明的另一目的是提供治疗患有遗传性血管性水肿，遗传性血管性水肿相关的疾病或紊乱，或可用诸如DX-88的Kunitz结构域肽调节的疾病的患者的方法。该方法包含施用有效量的白蛋白融合蛋白的步骤，其中该白蛋白融合蛋白含有包含DX-88的Kunitz结构域肽，或其片断或变异体，和白蛋白，或其片断或变异体。本发明的一个目的是提供治疗患有癌症，癌症相关的疾病，出血，或可用诸如DX-1000的Kunitz结构域肽调节的疾病的患者的方法。该方法包含施用有效量的白蛋白融合蛋白的步骤，其中该白蛋白融合蛋白含有包含DX-1000的Kunitz结构域肽，或其片断或变异体，和白蛋白，或其片断或变异体。本发明的另一目的是提供含有编码白蛋白融合蛋白的多核苷酸序列的核酸分子，以及含有该核酸分子的载体。本发明还提供了制备白蛋白融合蛋白的方法，其中该方法包括(a)提供在生物体中可表达的含有编码白蛋白融合蛋白的核苷酸序列的核酸；(b)在该生物体中表达该核酸以形成白蛋白融合蛋白；和(c)纯化该白蛋白融合蛋白。附图的简要描述图1:DX-890和DX-8卯-HAS融合蛋白的Ki测量。图2:^I-DX-890(左侧)和125I-DX-890-HAS融合蛋白(右侧)的血浆清除率曲线。图3:在SE-HPLC(Superose-12)上的正常小鼠血浆中的125I-DX890。图4:正常小鼠血浆中125I-HAS-DX890的SE-HPLC(Superose-12)图谱。图5:1251标记的DX-890和HSA-DX-8卯在兔中的血浆清除率。图6:兔血浆样品的SEC分析。本发明的详细描述本发明涉及白蛋白融合的Kunitz结构域肽。本发明还涉及双功能(或多功能)融合蛋白，其中白蛋白与两个(或多个)Kunitz结构域肽，任选不同的Kunitz结构域肽偶连。具有不同Kunitz结构域肽的该双功能(或多功能)融合蛋白与仅包含一种类型的Kunitz结构域肽的白蛋白融合蛋白相比预期具有改进的药物抗性谱。某些情况下可能需要抑制两种或多种蛋白酶且融合多个Kunitz结构域允许一种化合物可用于抑制两种或多种蛋白酶。作为选择，可融合两个或多个Kunitz结构域，各结构域针对相同的蛋白酶以便增加每克的抑制剂活性。具有两个Kunitz结构域的抑制剂的一种有用的形式是K1::SA::K2，其中Kq和&是Kunitz结构域且SA是血清白蛋白或其主要部分。该双功能(或多功能)融合蛋白与仅包含一种类型的Kunitz结构域肽的白蛋白融合蛋白相比也可表现出协同效应。另外，可将化学实体共价附着到本发明的融合蛋白上以增强生物学活性或调节生物学活性。本发明的白蛋白融合蛋白预期可延长Kunitz结构域肽的体内半衰期。所述白蛋白融合肽的体外或体内半衰期比缺少该连接的白蛋白的肽的半衰期延长2倍，或5倍，或更多。另外，至少部分由于该肽的半衰期增加，预期本发明的白蛋白融合蛋白可减少该治疗肽的给药安排频率。与缺少连接白蛋白的治疗肽的给药安排频率(thefrequencyofthedosingschedule)相比，该给药安排频率减少至少四分之一或者至少一半。本发明的白蛋白融合蛋白可延长该肽的储存期(shelflife),和/或稳定该肽和/或其在溶液中(或在药用组合物中)的体外和/或体内活性。可作为治疗剂的这些白蛋白融合蛋白预期可减少这样的需要，即需要用大量过量的载体蛋白(例如未融合的白蛋白)配制蛋白质溶液以防止由诸如非特异性结合的因素引起的蛋白质损失。本发明还包含编码白蛋白融合蛋白的核酸分子以及含有这些核酸的载体，用这些核酸载体转化的宿主细胞，和使用这些核酸，载体，和/或宿主细胞制备本发明的白蛋白融合蛋白的方法。本发明还包括修饰成含有本发明的核酸分子，任选修饰成表达由该核酸分子编码的白蛋白融合蛋白的转基因生物。白蛋白术语人血清白蛋白(HSA)和人白蛋白(HA)在本文中可交换使用。术语"白蛋白，，和"血清白蛋白，，范围更宽，且包含人血清白蛋白(和其片断和变异体)以及来自其它物种的白蛋白(和其片断和变异体)。本文使用的"白蛋白"统指具有白蛋白的一种或更多种功能活性(例如，生物学活性)的白蛋白蛋白质或氨基酸序列，或白蛋白片断或变异体。具体地说，"白蛋白"是指人白蛋白或其片断(参见EP201,239，EP322,094,WO97/24445,W095/23857),特别是本文SEQIDNO:18和美国临时申请系列号60/355,547和WO01/79480的表1和SEQIDNO:18所示的人白蛋白的成熟形式或来自其它脊推动物的白蛋白或其片断，或这些分子的类似物或变异体或其片断。本发明的白蛋白融合蛋白中使用的人血清白蛋白蛋白质参照SEQIDNO:18含有一组或两组下列点突变组Leu-407突变成Ala,Leu-408突变成Val，Val-409突变成Ala，和Arg-410突变成Ala;或Arg-410突变成Ala,Lys-413突变成Gin,和Lys-414突变成Gln(参见，例如，国际公开号W095/23857,本文以其整体在此引用以供参考)。在一些实施方案中，含有一组或两组上述点突变组的本发明的白蛋白融合蛋白对酵母Yap3p蛋白水解裂解的稳定性/抗性增强，使得在酵母宿主细胞中表达的重组白蛋白融合本文使用的足以延长或延续该治疗性蛋白的体内半衰期，治疗活性，或储存期的白蛋白部分是指与非融合状态的治疗性蛋白质的体内半衰期，治疗活性，或储存期相比在长度或结构上足以稳定，延长或延续该白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的体内半衰期，治疗活性或储存期的白蛋白部分。该白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可包含上述HA序列的全长，或者可包含能够稳定或延长该治疗活性的其一个或多个片断。该片断可具有10个或更多个氨基酸的长度或者可包括HA序列的大约15,20，25，30，50，或更多个连续的氨基酸或者可包括部分或全部的HA特异性结构域。本发明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可以是正常HA的变异体。本发明的白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分也可以是本文所述的治疗性蛋白质的变异体。术语"变异体"包括插入，缺失和取代，包括保守的或非保守的取代，其中该变异基本上不改变一种或多种白蛋白的亲瘤性(oncotic)，有用的配体结合和非免疫原性特性，或给治疗性蛋白赋予治疗活性的活性位点，或活性结构域。具体地说，本发明的白蛋白融合蛋白可包括人白蛋白的天然存在的多态性变异体和人白蛋白的片断，例如在EP322,094中公开的那些片断(即HA(Pn)，其中n是369至419)。该白蛋白可来自于任何脊推动物，特别是任何哺乳动物，例如人，奶牛，绵羊，或猪。非哺乳动物白蛋白包括，但不限于，鸡和鲑鱼。该白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可与治疗性蛋白部分来自于不同的动物。一般来说，HA片断或变异体有至少100个氨基酸长，例如，至少150个氨基酸长。HA变异体由HA的至少一个完整结构域组成或任选包含HA的至少一个完整结构域，例如结构域l(SEQIDNO:18的氨基酸1-194)，2(SEQIDNO:18的氨基酸195-387)，3(SEQIDNO:18的氨基酸388-585)，l+2(SEQIDNO:18的1-387),2+3(SEQIDNO:18的195-585)或l+3(SEQIDNO:18的氨基酸1-194+SEQIDNO:18的氨基酸388-585)。各结构域本身由两个同源性亚结构域，即1-105,120-194，195-291，316-387,388-491和512-585组成，具有包含残基Lys106至Glul19,Glu292至Val315和Glu492至Ala511的亚结构域间的弹性接头区。本发明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可包含HA的至少一个亚结构域或结构域或其保守修饰。如果该融合蛋白以亚结构域为基础，任选可使用一些或全部相邻接头与治疗性蛋白半分子相连。白蛋白融合蛋白本发明一般涉及白蛋白融合蛋白和治疗，预防，或改善疾病或紊乱的方法。本文使用的"白蛋白融合蛋白"是指由至少一个分子的白蛋白(或其片断或变异体)与至少一个分子的治疗性蛋白(或其片断或变异体)融合形成的蛋白质。本发明的白蛋白融合蛋白包含互相结合，例如互相通过遗传融合(即该白蛋白融合蛋白通过翻译核酸产生，在该核酸中编码全部或部分治疗性蛋白的多核苷酸与编码全部或部分白蛋白的多核苷酸在阅读框内连接)的治疗性蛋白的至少一个片断或变异体和人血清白蛋白的至少一个片断或变异体。治疗性蛋白质和白蛋白蛋白质，即白蛋白融合蛋白的一个部分可称为白蛋白融合蛋白的"部分"，"区域"，或"半分子"。在一个实施方案中，本发明提供了包含治疗性蛋白质和血清白蛋白蛋白质，或任选由其组成的白蛋白融合蛋白。在另一实施方案中，本发明提供了包含治疗性蛋白质的生物活性和/或治疗活性片断和血清白蛋白蛋白质，或任选由其组成的白蛋白融合蛋白。在另一实施方案中，本发明提供了包含治疗性蛋白质的生物活性和/或治疗活性变异体和血清白蛋白蛋白质，或任选由其组成的白蛋白融合蛋白。在一些实施方案中，白蛋白融合蛋白的该血清白蛋白蛋白质组件是血清白蛋白的成熟部分。在另一实施方案中，本发明提供了包含治疗性蛋白质和血清白蛋白的生物活性和/或治疗活性片断，或任选由其组成的白蛋白融合蛋白。在另一实施方案中，本发明提供了包含治疗性蛋白质和血清白蛋白的生物活性和/或治疗活性变异体，或任选由其组成的白蛋白融合蛋白。在某些实施方案中，白蛋白融合蛋白的该治疗性蛋白质部分是治疗性蛋白质的成熟部分。在另一实施方案中，本发明提供了包含治疗性蛋白质的生物活性和/或治疗活性片断或变异体和血清白蛋白的生物活性和/或治疗活性片断或变异体，或任选由其组成的白蛋白融合蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了包含治疗性蛋白质的成熟部分和血清白蛋白的成熟部分，或任选由其组成的白蛋白融合蛋白。该白蛋白融合蛋白包含HA作为N-端部分，和治疗性蛋白质作为C-末端部分。作为选择，也可使用包含HA作为C-端部分，和治疗性蛋白质作为N-末端部分的白蛋白融合蛋白。在另一实施方案中，该白蛋白融合蛋白具有与白蛋白N-末端和C-末端都融合的治疗性蛋白质。在一个实施方案中，在N-和C-末端融合的治疗性蛋白质是相同的治疗性蛋白质。在另一实施方案中，在N-和C-末端融合的治疗性蛋白质是不同的治疗性蛋白质。在另一实施方案中，在N-和C-末端融合的治疗性蛋白质是可用于治疗或预防相同疾病，紊乱或症状的不同治疗性蛋白质。在一些实施方案中，在N-和C-末端融合的治疗性蛋白质是可用于治疗或预防本领域已知通常在患者中同时发生的疾病或紊乱的不同治疗性蛋白质。除了白蛋白部分与治疗性蛋白部分的N-末端和/或C-末端融合外，本发明的白蛋白融合蛋白也可通过将目的治疗性蛋白或肽插入HA的内部区域产生。例如，在HA分子的蛋白质序列内，在a-螺旋的末端和开始之间存在许多环和转角，它们通过二硫键稳定。从HA的晶体结构测定的环(PDB标识符1A06,1BJ5，1BKE，1BM0,1E7E至1E7I和1U0R)大部分从该分子的主体延伸出去。这些环用于插入，或内部融合治疗性活性肽，特别是那些需要二级结构发挥功能的肽，或者治疗性蛋白质，以便基本上产生具有特定生物学活性的白蛋白分子。可插入肽或多肽以产生本发明的白蛋白融合蛋白的人白蛋白结构中的环包括Val54-Asn61，Thr76-Asp89，Ala92-Glu100，Glnl70-Ala176，His247-Glu252，Glu266-Glu277，Glu280-His288,Ala362-Glu368，Lys439-Pro447，Val462-Lys475,Thr478-Pro486，和Lys560-Thr566。在其它实施方案中，将肽或多肽插入成熟人白蛋白的Val54-Asn61,Glnl70-Ala176,和/或Lys560-Thr566环中(表l)(SEQIDNO:18)。插入的治疗性蛋白质可来自任一来源，包括筛选特异性生物学活性的噬菌体展示和合成肽文库，或者来自具有所需功能的分子的活性部分。另外，含有用作治疗性蛋白质的候选物的包含Kunitz结构域肽的随机肽文库可在特定环内或者通过将该随机化肽插入HA分子的特定环中产生，其中提供了氨基酸的许多(例如，5xl0"组合。通过下列方法之一可在HA或HA的结构域片断上产生该文库(a)随机突变HA或HA结构域片断的一个或多个肽环内的氨基酸。以该方式可突变环内的一个，一个以上或全部残基；(b)用长度Xn(其中X是氨基酸且n是残基数目)的随机肽取代，或插入进HA或HA结构域片断的一个或多个环(即，内部融合)；(c)除了(a)和/或(b)夕卜的N-,C-或N-和C-末端肽/蛋白融合。结构域片断也可使得该HA或HA结构域片断具有多功能。插入人血清白蛋白环中的肽的非限制性例子有DX-8卯(人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂)，DPI-14(人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂)，DX-88肽(人血浆激肽释放酶抑制剂，表2)，和DX-1000(人纤溶酶抑制剂，表2)或其肽片断或肽变异体。更具体的说，本发明涉及白蛋白融合蛋白，它含有插入人血清白蛋白环中的至少7，至少8,至少9,至少10,至少11,至少12，至少13，至少14，至少15，至少20，至少25，至少30,至少35，或至少40个氨基酸长的肽片断或肽变异体。本发明还涉及这样的白蛋白融合蛋白，它含有与人血清白蛋白N-末端融合的至少7,至少8，至少9,至少10，至少11,至少12,至少13,至少14,至少15，至少20,至少25,至少30,至少35，或至少40个氨基酸长的肽片断或肽变异体。本发明还涉及这样的白蛋白融合蛋白，它含有与人血清白蛋白C-末端融合的至少7，至少8,至少9,至少10，至少11，至少12,至少13，至少14，至少15，至少20,至少25，至少30，至少35，或至少40个氨基酸的肽片断或肽变异体。一般来说，本发明的白蛋白融合蛋白可具有一个来自HA的区域和一个来自治疗性蛋白质的区域。然而，可使用各蛋白质的多个区域来制备本发明的白蛋白融合蛋白。同样，可使用一个以上的治疗性蛋白质来制备本发明的白蛋白融合蛋白。例如，治疗性蛋白质可与HA的N-末端和C-末端都融合。在该构型中，治疗性蛋白质部分可以是相同或不同的治疗性蛋白质分子。双功能白蛋白融合蛋白的结构可表示为X-HA-Y或Y-HA-X或X-Y-HA或HA-X-Y或HA-X-Y-HA或HA-Y-X-HA或HA-X-X-HA或HA-Y-Y-HA或HA-X-HA-Y或X-HA-Y-HA或多种组合或在HA序列的任何位置内插入X和/或Y。涉及诸如Kunitz结构域的治疗性蛋白质"X"，和治疗性肽"Y"的其它实施方案涉及将HA分隔成部分1和2。本发明的融合蛋白可具有形式X-HA(部分l)-Y-HA(部分2)和HA(部分l)-Y-HA(部分2)-X。其它实施方案涉及两个治疗性蛋白质结构域"X"和"Z，，和治疗性肽"Y",产生具有下列形式的融合蛋白X-HA(部分l)-Y-HA(部分2)-Z和Z-HA(部分1)-Y-HA(部分2)-X。可根据功能，半衰期，等以各种比率制备双或多功能白蛋白融合蛋白。双或多功能白蛋白融合蛋白也可制备成通过HA另一端的蛋白质或肽将融合蛋白的治疗性蛋白质部分靶向靶器官或细胞类型。作为对融合蛋白的已知治疗性分子的另一选择，可通过筛选将一般6,8,12,20或25或XJ其中X是氨基酸(aa)且n等于残基数目)的随机化氨基酸与HA或HA结构域片断的N-,C-或N-和C-末端融合构建的文库获得该肽，且其中允许氨基酸的所有可能的组合。该方案的具体优势在于可在HA分子上原位选择该肽，因此该肽的特性是选择的而不会与通过任何其它方法产生然后连接到HA上的肽的情况一样可能被修改。与折叠恰当的结构域，例如HA末端的Kunitz结构域的连接不必进行该选择。原位选择对于没有二硫键或单个二硫键环的肽可能是重要的。另外，本发明的白蛋白融合蛋白可包括融合部分之间的接头肽以便在半分子之间提供更大的物理间隔且因此最大化治疗性蛋白质部分的可接近性，例如与其关连受体的结合。该接头肽可由氨基酸组成以便具有弹性或更具有刚性。因此，如上所述，本发明的白蛋白融合蛋白可具有下列通式R2-R1;Rl-R2;R2-R1-R2;R2-L-R1-L-R2;R1-L画R2;R2-L画R1;或R1-L隱R2-L-R1，其中Rl是至少一个治疗性蛋白，肽或多肽序列(包括其片断或变异体)，且不必是相同的治疗性蛋白，L是接头且R2是血清白蛋白序列(包括其片断或变异体)。举例性的接头包括(GGGGSV(SEQIDNO:—)或(GGGS)"SEQIDNO:—)或(GGS)n,其中N是大于或等于1的整数且其中G表示甘氨酸，S表示丝氨酸。在某些实施方案中，含有治疗性蛋白的本发明的白蛋白融合蛋白与未融合白蛋白的相同治疗性蛋白的储存期或体内半衰期或治疗活性相比具有延长的储存期或体内半衰期或治疗活性。储存期一般是指在溶液或在某种其它贮存剂型中治疗性蛋白的治疗活性稳定而无过度的治疗活性损失的时间期限。许多治疗性蛋白质在其未融合状态下是非常不稳定的。如下所述，这些治疗性蛋白质的一般储存期在掺入本发明的白蛋白融合蛋白时显著延长。具有"延长"或"延期"储存期的本发明的白蛋白融合蛋白相对于在相同贮存和处理条件下的标准品表现出更高的治疗活性。该标准品可以是未融合的全长治疗性蛋白。当白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分是类似物，变异体，或者是改变的或不包括该蛋白的完整序列时，治疗活性的延长任选与该类似物，变异体，改变肽或不完整序列的未融合同等物相比较。作为例子，与标准品在给定时间点比较时，本发明的白蛋白融合蛋白保留比在相同贮存和处理条件下的标准品的治疗活性高大约100%的治疗活性，或高大约105%，110%，120%，130°/。，150%或200%的治疗活性。然而，应注意该治疗活性取决于该治疗性蛋白质的稳定性，且可能低于100%。储存期也可按相对于贮存开始时的治疗活性标准化的，贮存后的治疗发明的白蛋白融合蛋白可保留相同条件下同等未融合治疗性蛋白质治疗活性的超过大约50%的治疗活性，大约60%,70%，80%,或90%或更高的治疗活性。本发明的白蛋白融合蛋白相对于相同贮存和处理条件下的未融合治疗性蛋白质标准品表现出更高的可溶性。治疗性蛋白质如上所述，本发明的白蛋白融合蛋白包含通过遗传融合互相结合的至少治疗性蛋白质的片断或变异体和至少人血清白蛋白的片断或变异体。本文使用的"治疗性蛋白质，，是指Kunitz结构域肽，其非限制性的例子包括DX-890，DPI-14，DX-88或DX-1000,或其具有一种或多种治疗和/或生物学活性的片断或变异体。Kunitz结构域是形成中央反向平行卩折叠和短C-末端螺旋的大约51-64个残基的折叠结构域。该特征性结构域含有6个半胱氨酸残基，形成3个二硫键，产生双环结构。在N-末端区和第一个P链之间存在活性抑制结合环。该结合环通过P2C14残基与最后两个卩链之间形成的发夹环形成二硫键。Kunitz结构域是如下通式的从大约51个氨基酸至大约64个氨基酸的多肽<formula>formulaseeoriginaldocumentpage24</formula>在Cs和C55,Cw和C38,和C30和C5!之间形成二硫键。(^4-(:38二硫键常见于天然Kunitz结构域，但在人工Kunitz结构域中可去掉。如果C,4变成另一氨基酸类型，那么(338也改变成非半胱氨酸，反之亦然。可将任一多肽融合到氨基末端。X厂X4可包含0至4个氨基酸。X6-Xu可包含8或9个氨基酸。如果Xw不存在，那么Xu是Gly。X26a,X26b，和X26c中每一个都可以不存在；即，X5-X3o可包含16，17,18，或19个氨基酸。X33是Phe或Tyr。X39-Xso可包含12,13,14,或15个氨基酸；即，X42a,X42b,和X42c中的每一个都可以不存在。X45是Phe或Tyr。X56-X58可包含0至3个氨基酸。其它半胱氨酸可存在于位置50,53,54或58。任何多肽可融合到羧基末端。表3显示了21个已知的人Kunitz结构域的氨基酸序列。表3:21个已知的人Kunitz结构域的氨基酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>表1中的任一结构域都可改造成具有特异性生物学作用(例如抑制特定的蛋白酶)并与HA融合。因此本发明的白蛋白融合蛋白可至少含有治疗性蛋白质的片断或变异体。变异体包括突变体，类似物，和模拟物，以及同源物，包括内源性或天然存在的相关物。表现出"治疗活性"的多肽或"治疗上有活性"的蛋白质是指具有与诸如本文所述的或者本领域已知的一种或多种治疗性蛋白质的治疗性蛋白质相关的一种或多种已知生物学和/或治疗活性的多肽。作为非限制性例子，"治疗性蛋白质"是用于治疗，预防或改善疾病，症状或紊乱的蛋白质。本文使用的"治疗活性"或"活性"是指其效果与人体所需的治疗结果一致的活性，或者指在非人哺乳动物或在其它物种或生物体中所需的效果。治疗活性可在体内或体外测量。例如，可在细胞培养物中测定所需效果。用于本领域所述的许多治疗性蛋白质的该体外或细胞培养测定法通常是可获得的。有用的测定法的例子包括，但不限于，特别是本文作为参考文献引用的，表4的参考文献和出版物中所述的，和本文实施例所述的那些测定法。可测量本发明的融合蛋白表现出的活性，例如，通过在体外测定法，例如本文所述的那些测定法中容易完成。使用这些测定法时，可测定这样的参数，即与治疗性蛋白(或其片断或变异体)未融合到白蛋白上时相比，该融合蛋白表现的相对生物学和/或治疗活性。相应于本发明的白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的治疗性蛋白可通过连接一个或多个寡糖基团进行修饰。称为糖基化的该修饰可显著影响蛋白质的物理特性且在蛋白质的稳定性，分泌，和定位方面是重要的。该修饰在美国临时申请系列号60/355，547和WOO1/79480中进行了详细描述，本文引用以供参考。可修饰相应于本发明的白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的治疗性蛋白，及其类似物和变异体以改变一个或多个位点的糖基化，该改变可由对其核酸序列的改造，通过表达它们的宿主细胞，或者由于其表达的其它条件引起。例如，通过消除或导入糖基化位点，例如，通过取代或缺失氨基酸残基，例如用谷氨酰胺取代天冬酰胺，可产生糖基化异构体，或者通过在不能糖基化它们的宿主细胞，例如在大肠杆菌或糖基化缺陷型酵母中表达该蛋白质可产生未糖基化的重组蛋白。这些方法的例子在美国临时申请系列号60/355,547和WO01/79480中进行了更详细的描述，本文引用以供参考，且它们是本领域已知的。表4提供了相应于本发明的白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的治疗性蛋白质的非穷举性列表。"治疗性蛋白质X"栏公开了治疗性蛋白质分子，下面的插入语包含科学命名和商标名称，它包含治疗性蛋白质分子或其片断或变异体，或任选由其组成。本文使用的"治疗性蛋白质X"可指单个的治疗性蛋白质分子(亦可从CAS和Genbank登录号获得的氨基酸序列限定)，或者指与该栏公开的给定治疗性蛋白质分子相关的整组治疗性蛋白质。与各条目相关的信息分别以其整体引用以供参考，特别是对于其中所述的氨基酸序列。"PCT/专利参考文献"栏提供了相应于描述该治疗性蛋白质分子的专利和/或公开的专利申请的美国专利号，或PCT国际公开号。在"PCT/专利参考文献"栏中引证的各专利和/或公开的专利申请以其整体在此引用以供参考。具体地说，各引证的"PCT/专利参考文献"的序列表中描述的特定多肽的氨基酸序列，在例如，各引证的"PCT/专利参考文献"的详细描述中描述的这些氨基酸序列的变异体(突变，片断，等)，在例如，各引证的"PCT/专利参考文献"的详细描述中描述的治疗适应征，和在各引证的"PCT/专利参考文献"的详细描述，和更具体地说，在实施例中描述的用于特定多肽的活性测定法均在本文中引用以供参考。"生物学活性"栏描述了与治疗性蛋白质分子相关的生物学活性。在"相关出版物"栏中引证的各参考文献以其整体，特别是关于在该文献中描述(例如，参见方法部分)"优选适应征(indication)Y"栏描述了可用治疗性蛋白质X或含有治疗性蛋白质X部分的本发明的白蛋白融合蛋白治疗，预防，诊断，或改善的疾病，紊乱，和/或情况。表4:选定的治疗性蛋白质列表<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>在各种实施方案中，本发明的白蛋白融合蛋白具有与治疗性蛋白质的治疗活性和/或生物学活性相应的治疗活性和/或生物学活性，该治疗性蛋白质相应于表4相应行中所列的白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分。(参见，例如，表4的"生物学活性"和"治疗性蛋白质X"栏)。在其它实施方案中，本发明的白蛋白融合蛋白的治疗活性蛋白部分是参考序列的片断或变异体且具有表4"生物学活性"栏公开的相应治疗蛋白质的治疗活性和/或生物学活性。多肽和多核苦酸片断和变异体^錄本发明还涉及表4所述治疗性蛋白质，白蛋白，和/或本发明的白蛋白融合蛋白的片断。即使从蛋白质的N-末端缺失一个或多个氨基酸导致修改或丧失了该治疗性蛋白质，白蛋白，和/或白蛋白融合蛋白的一种或多种生物学功能，但是仍然可保留其它的治疗活性和/或功能活性(例如，生物学活性，多聚化能力，结合配体的能力)。例如，当从N-末端去掉完整多肽的不超过大多数的残基时，一般可保留N-末端缺失的多肽诱导和/或结合抗体的能力，该抗体可识别该多肽的完整或成熟形式。缺失了完整多肽的N-末端残基的具体多肽是否保留该免疫学活性可通过本文所述或者本领域已知的常规方法容易测定。大量缺失N-末端氨基酸残基的突变体可保留一些生物学或免疫原性活性也不是不可能的。事实上，由少到6个氨基酸残基组成的肽通常可诱发免疫反应。因此，相应于本发明的白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的治疗性蛋白的片断，包括全长蛋白质以及从对照多肽(例如表4公开的治疗性蛋白质)的氨基酸序列的氨基末端缺失了一个或多个残基的多肽。本发明还包含编码这些多肽的多核苦酸。另外，相应于本发明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的血清白蛋白多肽的片断，包括全长蛋白质以及从对照多肽(即，血清白蛋白)的氨基酸序列的氨基末端缺失了一个或多个残基的多肽。本发明还包含编码这些多肽的多核苦酸。另外，本发明的白蛋白融合蛋白的片断包括全长白蛋白融合蛋白以及从该白蛋白融合蛋白的氨基末端缺失了一个或多个残基的多肽。本发明还包含编码这些多肽的多核苷酸。另外，如上所述，即使从对照多肽(例如，治疗性蛋白质和/或血清白蛋白)的N-末端或C-末端缺失一个或多个氨基酸导致修改或丧失了该蛋白质的一种或多种生物学功能，但是仍然可保留其它的功能活性(例如，生物学活性，多聚化能力，结合配体的能力)和/或治疗活性。例如，当从C-末端去掉完整或成熟多肽的不超过大多数的残基时，一般可保留C-末端缺失的多肽诱导和/或结合抗体的能力，该抗体可识别该多肽的完整或成熟形式。缺失了对照多肽的N-末端和/或C-末端残基的具体多肽是否保留治疗活性可通过本文所述和/或本领域已知的常规方法容易测定。本发明还提供了从相应于本发明的白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的治疗性蛋白质(例如，在表4中提及的治疗性蛋白质)的氨基酸序列的羧基末端缺失了一个或多个残基的多肽。本发明还包含编码这些多肽的多核苷酸。另外，本发明还提供了从相应于本发明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的白蛋白(例如，血清白蛋白)的氨基酸序列的羧基末端缺失了一个或多个残基的多肽。本发明还包含编码这些多肽的多核苷酸。另外，本发明还提供了从本发明的白蛋白融合蛋白的羧基末端缺失了一个或多个残基的多肽。本发明还包含编码这些多肽的多核苷酸。另外，可联合任意的上述N-或C-末端缺失以产生N-和C-末端缺失的对照多肽(例如，表4中提及的治疗性蛋白质，或血清白蛋白(例如，SEQIDNO:18,表l)，或本发明的白蛋白融合蛋白)。本发明还提供了从氨基和羧基末端都缺失了一个或多个氨基酸的多肽。本发明还包含编码这些多肽的多核苦酸。本申请还涉及含有与本文所述的对照多肽序列(例如，治疗性蛋白质，血清白蛋白或本发明的白蛋白融合蛋白)至少60%,80%,85%,90%，95°/0，96%,97%,98%或99%相同的多肽的蛋白质，或其片断。在一些实施方案中，本申请涉及含有与上述具有N-和C-末端缺失的氨基酸序列的对照多肽至少80%，85%,90%，95%,96%，97%,98%或99%相同的多肽的蛋白质。本发明还包含编码这些多肽的多核苷酸。本发明的其它多肽片断是包含氨基酸序列，或任选由其组成的片断，该氨基酸序列表现出治疗性蛋白或血清白蛋白的多肽序列的治疗活性和/或功能活性(例如生物学活性)，该多肽序列的氨基酸序列是片断。其它多肽片断有生物学活性片断。生物学活性片断是表现出与本发明的多肽的活性相似，但不必相同的活性的那些片断。该片断的生物学活性可包括改进所需的活性，或者降低不需要的活性。史^谬"变异体"是指不同于对照核酸或多肽，但保留其基本特性的多核苷酸或核酸。一般来说，变异体与对照核酸或多肽总体上非常相似，且在许多区域相同。本文使用的"变异体"是指在序列上分别不同于治疗性蛋白(例如，参见表4的"治疗性蛋白X"栏)，白蛋白，和/或本发明的白蛋白融合蛋白，但是保留本文它处所述或者本领域已知的其至少一种功能和/或治疗特性(例如，在表4"生物学活性"栏中公开的治疗活性和/或生物学活性)的本发明的白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分，本发明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分，或白蛋白融合蛋白。一般来说，变异体与相应于本发明的白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的治疗性蛋白，相应于本发明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的白蛋白，和/或本发明的白蛋白融合蛋白的氨基酸序列总体上非常相似，且在许多区域相同。本发明还包含编码这些变异体的核酸。本发明还涉及包含一种氨基酸序列，或任选由其组成的蛋白质，该氨基酸序列与例如，相应于本发明的白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的治疗性蛋白(例如，在表4的参考文献中公开的氨基酸序列，或其片断或变异体)，相应于本发明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的白蛋白(例如，表l，或其片断或变异体)，和/或本发明的白蛋白融合蛋白的氨基酸序列至少60%,80%，85%,90%，95%,96%,97%，98%,99%或100%相同。还提供了这些多肽的片断(例如，本文公开的那些片断)。本发明包含的其它多肽是由这样的多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在严格杂交条件下(例如，在大约45摄氏度下在6X氯化钠/种檬酸钠(SSC)中与结合DNA的滤膜杂交，接着在0.2XSSC,0.1%SDS中在大约50-65才聂氏度下洗涤一次或多次)，在高度严格条件下(例如，在大约45摄氏度下在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中与结合DNA的滤膜杂交，接着在0.1XSSC,0.2%SDS中在大约68摄氏度下洗涤一次或多次)，或者在本领域的技术人员已知的其它严格杂交条件下(参见，仿H口，Ausubel，F.M.等，编,1989Cwre"f尸rotoco/A/o/ecw/arB/o/ogV，Greenpublishingassociates,Inc.,andJohnWiley&SonsInc.，NewYork,第6.3.1-6.3.6和2.10.3页)与编码本发明的氨基酸序列的核酸分子的互补序列杂交。本发明还包含编码这些多肽的多核苷酸。具有与本发明的查询(query)氨基酸序列至少例如，95%相同的氨基酸序列的多肽，是指除了所述多肽序列在每100个查询氨基酸序列的氨基酸中包含多达5个氨基酸改变外，所述多肽的氨基酸序列与该查询序列相同。换句话说，为了获得具有与查询氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列的多肽，可插入，缺失，或用另一氨基酸取代所述序列的多达5%的氨基酸残基。对照序列的这些改变可在对照氨基酸序列的氨基-或羧基末端位置，或者在那些末端位置之间的任何位置发生，可单独散布在对照序列的残基中，或者在对照序列内以一个或多个连续组存在。实际上，任何具体多肽与例如，本发明的白蛋白融合蛋白或其片断(例如该白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分或该白蛋白融合蛋白的白蛋白部分)的氨基酸序列是否具有至少60%，80%,85%,90%,95%，96。/。，97%，98%或99%的相同性可使用已知的计算机程序按常规测定。该程序和使用它们的方法在例如，本文作为参考文献引用的美国临时申请系列号60/355,547和WO01/79480(第41-43页)中描述，且是本领域熟知的。本发明的多核苷酸变异体可在编码区，非编码区，或两者中都含有改变。多核苷酸变异体包括那些含有这样的改变的变异体，即该改变产生沉默取代，添加，或缺失，但不改变所编码的多肽的特性或活性。由于遗传密码的筒并性可通过沉默取代产生该核苷酸变异体。多肽变异体包括小于50，小于40,小于30，小于20，小于IO，或5—50,5-25,5-10，1-5,或1-2个氨基酸以任意组合取代，缺失，或添加的那些变异体。多核苷酸变异体可因为各种原因而产生，例如，为了优化特定宿主的密码子表达(将人mRNA中的密码子改变成诸如酵母或大肠杆菌的微生物宿主优选的那些密码子)。在另一实施方案中，可优化编码本发明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的多核苷酸用于在酵母或哺乳动物细胞中表达。在还有另一实施方案中，可优化编码本发明的白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的多核苷酸用于在酵母或哺乳动物细胞中表达。在还有另一实施方案中，可优化编码本发明的白蛋白融合蛋白的多核苷酸用于在酵母或哺乳动物细胞中表达。在另一实施方案中，编码本发明的白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分蛋白质的野生型多核苷酸杂交。在另一实施方案中，编码本发明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的密码子优化的多核苷酸在本文所述的严格杂交条件下不与编码该白蛋白的野生型多核苷酸杂交。在另一实施方案中，编码本发明的白蛋白融合蛋白的密码子优化的多核苷酸在本文所述的严格杂交条件下不与编码该治疗性蛋白质部分或该白蛋白部分的野生型多核苷酸杂交。在另一实施方案中，编码本发明的白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的多核苷酸不包含该治疗性蛋白质天然存在的序列，或者任选不由其组成。在另一实施方案中，编码本发明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的多核苷酸不包含该白蛋白天然存在的序列，或者任选不由其组成。在另一实施方案中，编码本发明的白蛋白融合蛋白的多核苷酸不包含该治疗性蛋白质部分或该白蛋白部分的天然存在的序列，或者任选不由其组成。在另一实施方案中，该治疗性蛋白质可选自通过生物淘选(biopanning)的随机肽文库，因为这将没有天然存在的野生型多核苷酸。天然存在的变异体称为"等位基因变异体"，且是指占据生物染色体给定基因座的基因的一些可选择的形式之一。(GenesII，Lewin,B.，编，JohnWiley&Sons,NewYork(1985))。这些等位基因变异体可在多核苦酸和/或多肽水平上改变且包含在本发明中。另外，通过诱变技术或通过直接合成也可产生非天然存在的变异体。使用蛋白质工程和重组DNA技术的已知方法，可产生变异体以改良或改变本发明多肽的特性。例如，可从本发明的多肽的N-末端或C-末端缺失一个或多个氨基酸而基本上不丧失生物学功能。参见，例如，Ron等(J.Biol.Chem.268:2984-2988(1993)(KGF变异体)和Dobeli等，J.Biotechnology7:199-216(1988)(干扰素y变异体)。另外，大量证据证实了变异体通常保留与天然存在的蛋白质相似的生物学活性(例如Gayle及其同事(J.Biol.Chem.268:22105-22111(1993)(IL-la变异体))。另外，即使从多肽的N-末端或C-末端缺失一个或多个氨基酸导致修改或丧失了一种或多种生物学功能，但是仍然可保留其它的生物学活性。例如，当从N-末端或C-末端去掉分泌形式的小于大多数的残基时，很可能保留缺失变异体诱导和/或结合可识别该分泌形式的抗体的能力。缺失了蛋白质的N-或C-末端残基的具体多肽是否保留该免疫学活性可通过本文所述或者本领域已知的常规方法很容易地测定。因此，本发明还包括具有功能活性(例如，生物学活性和/或治疗活性)的多肽变异体。在另一实施方案中，本发明提供了具有功能活性(例如，诸如在表4"生物学活性"栏中公开的生物学活性和/或治疗活性)的白蛋白融合蛋白的变异体，该功能活性相应于治疗性蛋白质的一种或多种生物学和/或治疗活性，该治疗性蛋白质相应于该白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分。该变异体包括根据本领域已知的一般规则选择的缺失，插入，倒位，重复，和取代以便对活性具有很小影响。在另一实施方案中，本发明的变异体具有保守取代。"保守取代"是指在组内的交换，例如脂肪族或疏水氨基酸Ala,Val，Leu和Ile的取代；羟基残基Ser和Thr的取代；酸性残基Asp和Glu的取代；酰胺残基Asn和Gin的取代，碱性残基Lys，Arg，和His的取代；芳香残基Phe,Tyr，和Trp的取代，小的氨基酸Ala，Ser,Thr，Met,和Gly的取代。关于如何制备表型沉默的氨基酸取代的指导在例如，Bowie等，"翻译蛋白质序列中的信息对氨基酸取代的耐受性"，Science247:1306-1310(1990)中提供，其中作者指出有两个主要的策略可用于研究氨基酸序列对于改变的耐受性。按作者所述，蛋白质具有惊人的氨基酸取代耐受性。作者还指出在该蛋白质的某些氨基酸位置很可能允许进行氨基酸改变。例如，大多数隐蔽(buried)(蛋白质的三级结构内)的氨基酸残基需要非极性侧链，而一般很少有表面侧链的特性保守。另外，有耐受性的保守氨基酸取代包含脂肪族或疏水氨基酸Ala,Val,Leu和Ile的取代；羟基残基Ser和Thr的取代；酸性残基Asp和Glu的取代；酰胺残基Asn和Gln的取代，碱性残基Lys,Arg,和His的取代；芳香残基Phe，Tyr，和Trp的取代，小体积氨基酸Ala,Ser，Thr,Met,和Gly的取代。除了保守氨基酸取代外，本发明的变异体包括(i)含有一个或多个非保守氨基酸残基的取代，其中取代的氨基酸残基可以是或者不是遗传密码编码的残基，或(ii)含有一个或多个具有取代基团的氨基酸残基的取代的多肽，或(iii)与另一化合物，例如增加多肽稳定性和/或可溶性的化合物(例如，聚乙二醇)融合或化学连接的多肽，(iv)含有添加氨基酸的多肽，例如，IgGFc融合区肽。根据本文的教导该变异体多肽认为在本领域的一支术人员的知识范围内。例如，含有用其它带电或中性氨基酸取代带电氨基酸的氨基酸取代的多肽变异体可产生具有改进特性，例如更少聚集的蛋白质。由于聚集体的免疫原性活性，药用配制品的聚集同时降低了活性且增加了清除率。参见Pinckard等，Clin.Exp.Immunol.2:331-340(1967);Robbins等，Diabetes,36:838-845(1987);Cldand等，Crit.Rev.TherapeuticDrugCarrierSystems10:307-377(1993)。在具体实施方案中，本发明的多肽包含本文所述的治疗性蛋白质和/或人血清白蛋白，和/或本发明的白蛋白融合蛋白的氨基酸序列的片断或变异体，或任选由其组成，其中该片断或变异体与对照氨基酸序列相比具有1-5,5-10，5-25,5-50,10-50或50-150个氨基酸残基的添加，取代，和/或缺失。在某些实施方案中，该氨基酸取代是保守的。本发明还包含编码这些多肽的核酸。本发明的多肽可由通过肽4定或修饰的肽4建，即肽等配物(peptideisosteres)互相连接的氨基酸组成，且可含有20个基因编码的氨基酸以外的氨基酸。该多肽可通过天然加工，例如翻译后加工，或者通过本领域熟知的化学修饰技术进行修饰。该修饰在基础课文和在更详细的专著，以及在多巻的研究作品中进行了充分的描述。修饰可在包括肽主链，氨基酸侧链和氨基或羧基末端的多肽的任何位置发生。可预料到在给定多肽的一些位点可存在相同或各种程度的相同类型的修饰。另外，给定多肽可含有许多类型的修饰。多肽可以是分支的，例如，由于遍在蛋白化作用，且它们可以是环状的，含有或不含分支。环状，分支，和分支环状的多肽可由翻译后的天然加工产生或者可通过合成方法制备。修饰包括乙酰化，酰化，ADP-核糖基化，酰胺化，黄素的共价连接，血红素半分子的共价连接，核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接，脂类或脂类衍生物的共价连接，磷脂酰肌醇的共价连接，交联，环化，二硫键形成，脱曱基化，形成共价交联，形成半胱氨酸，形成焦谷氨酸，曱酰化，Y-羧基化，糖基化，GPI锚形成，羟基化，碘化，甲基化，十四烷基化，氧化，PEG化，蛋白水解加工，磷酸化，异戊二烯化，外消旋，硒化，硫酸化，转移-RNA介导的蛋白质氨基酸添加，例如精胺酰基化，和遍在蛋白化。另外，可将化学实体共价连接到白蛋白融合蛋白上以增强或调节特定功能或生物学活性，例如，通过在CurrentOpinionsinBiotechnology,10:324(1999)中公开的方法。另外，可将靶向实体共价连接到本发明的白蛋白融合蛋白上以便将特定功能或生物学活性靶向某些细胞或阶段特异性类型，组织类型或解剖结构。针对本发明的白蛋白融合蛋白，可定位该试剂的作用。另外，该靶向可降低所需的本发明的白蛋白融合蛋白的剂量，因为通过在所需位点积聚本发明的白蛋白融合蛋白，可达到更高的局部浓度。本发明的白蛋白融合蛋白可通过使用交联剂以及通过在配体是蛋白质时将编码本发明的白蛋白融合蛋白，或其功能性部分的核苷酸序列克隆到与配体核苷酸序列相邻，并作为融合蛋白表达该连接物的重组DNA技术与靶向部分连接。本发明包含的另一翻译后修饰包括，例如，N-连接的或O-连接的糖链，N-末端或C-末端的加工，将化学半分子连接到氨基酸主链上，化学修饰N-连接或O-连接的糖链，和由于原核宿主细胞表达而添加或缺失N-末端曱硫氨酸残基。该白蛋白融合蛋白还可用4企测标记，例如酶，荧光，同位素或亲和性标记^"饰以允许4企测和分离该蛋白质。该《务饰的例子在例如，本文作为参考文献引用的美国临时申请系列号60/355,547和WO01/79480(第105-106页)中提供，且是本领域熟知的。功能活性"具有功能活性的多肽"是指能够表现出与治疗性蛋白质的全长，前体蛋白，和/或成熟形式相关的一种或多种已知功能活性的多肽。该功能活性包括，但不限于，生物学活性，酶抑制，抗原性[与抗多肽的抗体结合或与多肽竟争结合的能力]，免疫原性(产生与本发明的特定多肽结合的抗体的能力)，与本发明的多肽形成多聚体的能力，和与多肽的受体或配体结合的能力。"具有生物学活性的多肽"是指在有或无剂量依赖性的具体生物学试验中测量时表现出与包括成熟形式的本发明的治疗性蛋白的活性相似，但不必相同的活性的多肽。如果存在剂量依赖性，与本发明的多肽相比在给定活性下的剂量依赖性与该肽不必相同，而是基本上相似。在另一实施方案中，本发明的白蛋白融合蛋白具有与未融合到白蛋白上的治疗性蛋白(或其片断或变异体)相关的至少一种生物学和/或治疗活性。可使用本领域已知的或按常规改良的测定法，以及本文所述的测定法来测定本发明的白蛋白融合蛋白的功能活性(例如，生物学活性)。具体地说，可使用表4"相关出版物"栏引用的测定法测定白蛋白融合蛋白的功能活性(例如，生物学活性或治疗活性)。另外，本领域的技术人员可使用在其表4相应行中引用的测定法按常规测定相应于本发明的白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的治疗性蛋白质的片断的活性。另外，本领域的技术人员可使用本领域已知的和/或下面实施例部分所述的测定法按常规测定相应于本发明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的白蛋白的片断的活性。另外，本文所述的(见实施例和表4)或者本领域已知的测定法可按常规用于测量本发明的白蛋白融合蛋白和其片断，变异体和衍生物诱发与本发明的白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分和/或白蛋白部分相关的生物学活性和/或治疗活性(体外或体内)的能力。其它方法将是本领域的技术人员已知的且在本发明的范围内。融合蛋白的表达本发明的白蛋白融合蛋白可作为重组分子从酵母，诸如细菌的微生物，或人或动物细胞系中分泌产生。任选的是，该多肽可从宿主细胞中分泌。为了表达本文举例的白蛋白融合蛋白，与酵母启动子，WO90/01063中举例的HAS/MFa-7融合蛋白前导序列，酵母爿Z)///终止子，丄^72选择标记和美国专利号5,637,504中举例的去整合(disintegration)载体pSAC35联合，成功使用了WO95/33833中举例的i/5P/50基因分裂的酵母菌抹，或WO00/44772[rHA加工]中举例的PM77基因分裂的酵母菌抹(用于減少/消除白蛋白融合蛋白的O-连接的糖基化)，或WO95/23857中举例的E4"基因分裂的酵母菌林。预期可用于本发明的其它酵母菌株，启动子，前导序列，终止子，标记和载体在本文作为参考文献引用的美国临时申请系列号60/355,547和在WO01/74980(第94-99页)中描述，且是本领域熟知的。本发明还包括转化后表达本发明的白蛋白融合蛋白的细胞，任选酵母细胞。除了转化的宿主细胞本身外，本发明还涉及在营养培养基中的这些细胞的培养物，任选单克隆(克隆同源的)培养物，或从单克隆培养物产生的培养物。如果该多肽是分泌型的，那么该培养基可含有该多肽，含有该细胞，或者如果它们被过滤或离心掉的话不含该细胞。许多表达系统是已知的且可以使用，包括细菌(例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)，酵母(例如啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)，乳克鲁维氏酵母(Kluyveromyceslactis)和巴斯德毕赤氏酵母(Pichiapastoris))，丝状真菌(例如曲霉属)，植物细胞，动物细月包和昆虫细月包。目的蛋白可按常规方法生产，例如从插入宿主染色体或者在游离质粒中的编码序列产生。可用目的蛋白编码序列以任何常规方法，例如电穿孔五"2^wo/.194,182中公开。成功转化的细胞，即含有本发明的DNA构建体的细胞可通过熟知技术来鉴定。例如，可生长导入表达构建体所得的细胞以产生目的多肽。使用诸如Southern(1975)JMo/.98,503或Berent等(1985)肠tec/z.3，208所述的方法收获细胞并裂解，检查其DNA成份中是否存在该DNA。作为选择，可使用抗体检测上清中是否存在该蛋白质。有用的酵母质粒载体包括pRS403-406和pRS413-416且一般可从StratageneCloningSystems,LaJolla,CA92037,USA获得。质粒pRS403,pRS404，pRS405和pRS406是酵母整合质粒(YIps)且插入了酵母选择标记ifZS3，77eP7，丄5^/2和W^3。质粒pRS413-416是酵母着丝粒质粒(YCps)。用于在酵母中表达的制备白蛋白融合蛋白的载体包括pPPC0005,pScCHSA,pScNHSA,和pC4:HSA,它们于2001年4月11日在美国典型培养物保藏中心，10801UniversityBoulevard,Manassas,Virginia20110-2209保藏且在本文作为参考文献引用的临时申请系列号60/355,547和WO01/79480中描述。预期用于在酵母中表达白蛋白融合蛋白的另一载体是pSAC35载体，它在Sleep等，BioTechnology8:42(19卯)中描述，本文以其整体引用以供参考。质粒pSAC35属于US5,637,504中所述的去整合类载体。接。例如，可将互补同聚物片断到需要插入载体DNA中的DNA片断上。然后该载体和DNA片断通过互补同聚物尾之间的氢4定连接形成重组DNA分子。含有一个或多个限制性位点的合成接头提供了连接该DNA片断与载体的另一方法。通过核酸内切酶的限制性消化产生的DNA片断用噬菌体T4DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I处理，该酶用其3'5，-核酸外切活性去掉伸出的，Y-单链末端，并用其聚合活性补上3'-凹(recessed)端。因此这些活性的联合产生平端DNA片断。然后将该平端片断与摩尔数大量过剩的接头分子在诸如噬菌体T4DNA连接酶的能够催化平端DNA分子连接的酶存在的条件下温育。因此，该反应产物是在其末端携带多聚体接头序列的DNA片断。然后用合适的限制性酶裂解这些DNA片断并与已经用能产生与该DNA片断匹配的末端的酶裂解的表达载体连接。含有各种限制性核酸内切酶位点的合成接头可从许多商业来源以商品获得。例如，如果制备HA变异体，修饰根据本发明的DNA的所需方法是使用Saiki等(1988)Sc/e"ce239,487-491公开的聚合酶链式反应。在该方法中，需要酶促扩增的DNA侧翼是两个特异性寡核苷酸引物，该引物本身掺入扩增的DNA中。该特异性引物可含有限制性核酸内切酶识别位点，它可用于使用本领域已知的方法克隆进表达载体中。预期用于实施本发明的作为表达该白蛋白融合蛋白的宿主的酵母举例性的属有毕赤氏酵母属(Pichia)(以前分类为汉逊氏酵母属(Hansenula)),糖酵母属(Saccharomyces)，克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)，曲霉属(Aspergillus),假丝酵母属(Candida),球拟酵母属(Torulopsis),有孢圆酵母属(Tomlaspora)，裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)，固嚢酵母属(Citeromyces)，尸ac/yw/e"，4矣合并唐酵母属(Zygosaccharomyces),德、巴利氏酵母属(Debaromyces)，木雾属(Trichoderma),头孑包属(Cephalosporium)，腐质霉属(H謹icola),白霉属(Mwco。，链孢霉属(Neurospora)，K2/rcwz'a，梅奇酵母属(Metschunikowia),纟工冬孑包属(Rhodosporidium)，丄ewco5/on'd/"w，J5o^yooycz^，锁扭卩酵母属(Sporidiobolus),拟内孑包霉属(Endomycopsis)，等。属包括选自由糖酵母属，裂殖糖酵母属，克鲁维氏酵母属，毕赤氏酵母属和有孢圆酵母属组成的组中的那些属。糖酵母属种的例子有啤酒糖酵母，意大利糖酵母(S.italicus)和鲁氏糖酵母(S.rouxii)。其它种的例子，和转化它们的方法在本文作为参考文献引用的美国临时申请系列号60/355,547和WO01/79480(第97-98页)中描述。转化啤酒糖酵母的方法在EP251744，EP258067和WO90/01063中有一般性教导，它们都在本文中作为参考文献引用。用于啤酒糖酵母的合适的启动子包括与PGW基因，04"或04Z^0基因，CTC/,尸i7(95,7TP/，爿￡>///,甘油醛-3-磷酸脱氢酶，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，磷酸果糖激酶，丙糖磷酸异构酶，磷酸葡糖异构酶，葡萄糖激酶，a-交配因子信息素，[一种交配因子信息素]的基因相关的那些启动子，户朋/启动子，GLT2启动子，GPD/启动子，和包含部分5，调控区与其它启动子的部分5，调控区或与上游活化位点的杂合体的杂合启动子(例如，EP-A-258067的启动子)。用于粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomycespombe)的方l更可调启动子有Maundrell(1990>/历o/.C7zem.265,10857-10864所述的来自nmt基因的硫胺素抑制型启动子和Hoffman&Winston(1990)Ge""z'"124,807-816所述的葡萄糖抑制型jbpl基因启动子。转化毕赤氏酵母属用于表达外源性基因的方法在例如，Cregg等(1993)和许多Phillips专利(例如，US4857467，本文作为参考文献引用)中教导，且毕赤氏酵母属表达试剂盒可从InvitrogenBV，Leek，Netherlands,和InvitrogenCorp.,SanDiego,California以商品形式买到。合适的启动子包括AOXI和AOX2。Gleeson等(1986)J.Gen.Microbiol,132,3459-3465包含关于汉逊氏酵母属载体和转化的信息，合适的启动子是MOXl和FMD1;同时EP361991，Fleer等(1991)和来自Rhone-PoulencRorer的其它出版物教导了如何在克鲁维氏酵母属种中表达外源性蛋白质。转录终止信号可以是含有合适的转录终止和多聚腺香化信号的真核基因的3，侧翼序列。合适的3'侧翼序列可以是例如，该基因天然连接的所用表达调控序列的那些序列，即与启动子相应。另外，它们也可以不同，其中任选使用啤酒糖酵母^D/f/基因的终止信号。所需白蛋白融合蛋白开始可用分泌前导序列表达，该前导序列可以是在选定酵母中有效的任何前导序列。在啤酒糖酵母中有用的前导序列包括来自交配因子a多肽(MFoc-l)的前导序列和EP-A-387319的杂合前导序列。该前导序列(或信号)可在成熟白蛋白释放进周围培养基前被酵母裂解。另外，该前导序列包括在JP62-096086(授权号为911036516)中公开的啤酒糖酵母转化酶0St/C2),酸性磷酸酶(PH05)，MFa-l的前序列，0葡聚糖酶(BGL2)和杀伤毒素；糖化糖酵母(S.diastaticus)葡糖淀粉酶II;卡尔斯伯糖酵母(S.Carlsbergensis)a-半乳糖苷酶(MEL1);乳克鲁维氏酵母(K.lactis)杀伤毒素；和假丝酵母属(Candida)葡糖淀粉酶的那些前导序列。,jg和合^^:产冷蛋冷厨合蛋4的^它才法本发明包括编码本发明的白蛋白融合蛋白的多核苷酸，以及含有这些多核苷酸的载体，宿主细胞和生物体。本发明还包括通过合成和重组技术生产本发明的白蛋白融合蛋白的方法。该多核苷酸，载体，宿主细胞，和生物体可通过本领域已知的方法分离和纯化。用于本发明的载体可以是，例如，噬菌体，质粒，粘粒，微型染色体，病毒或逆转录载体。可用于克隆和/或表达本发明的多核苷酸的载体是在需要复制和/或表达该多核苷酸的宿主细胞中能够复制和/或表达该多核苷酸的载体。一般来说，多核苦酸和/或载体可用于真核或者原核的任何细胞，包括哺乳动物细胞(例如，人(例如，HeLa),猴(例如，Cos),兔(例如，兔网织红细胞)，大鼠，仓鼠(例如，CHO,NSO和幼仓鼠肾细胞)或小鼠细胞(例如，L细胞)，植物细胞，酵母细胞，昆虫细胞或细菌细胞(例如，大肠杆菌)。参见，例如，RAusubel等,Cwrew/7Votoco/s/"Mo/ecw/arA'o/ogy，GreenePublishingAssociatesandWiley-Interscience(1992)和Sambrook等(1989)中用于各种类型的宿主细胞的合适载体的例子。然而，应注意当使用复制缺陷型逆转录病毒载体时，病毒增殖一般仅在互补型宿主细胞中发生。可使用含有这些多核苷酸的宿主细胞大量表达该蛋白质用于例如，药品，诊断试剂，疫苗和治疗剂。该蛋白质可通过本领域已知的或者本文描述的方法进行分离和纯化。编码本发明的白蛋白融合蛋白的多核苷酸可与含有选择标记的载体连接用于在宿主中增殖。一般来说，可将质粒载体导入诸如磷酸钙沉淀的沉淀物或者含有带电脂类的复合物中。如果该载体是病毒，可使用合适的包装细胞系体外包装，然后导入宿主细胞中。该多核苷酸插入片断应与表达该多核苷酸的宿主细胞相容的合适启动子可操作地连接。该启动子可以是强启动子和/或诱导型启动子。启动子的例子包括噬菌体XPL启动子，大肠杆菌/ac，化p，p/2o^和toc启动子，SV40早期和晚期启动子和逆转录病毒LTRs启动子，仅列举几个例子。其它合适的启动子是本领域的技术人员已知的。该表达构建体还含有转录起始，终止位点，和在转录区用于翻译的核糖体结合位点。该构建体表达的转录子的编码部分可包含在开始处的翻译起始密码子和在需要翻译的多肽末端合适位置的终止密码子(TAA，TGA或TAG)。正如所述，该表达载体可包含至少一个选择标记。该标记包括用于真核细胞培养物的二氬叶酸还原酶，G418，谷氨酰胺合酶，或新霉素抗性，和用于培养大肠杆菌和其它细菌的四环素，卡那霉素，或氨苄青霉素抗性基因。合适宿主的代表性例子包括，但不限于，诸如大肠杆菌，链霉菌(Streptomyces)属和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella)细胞的细菌细胞；诸如酵母细胞(例如，啤酒糖酵母或巴斯德毕赤氏酵母(ATCC保藏号201178))的真菌细胞；诸如果蝇S2和SpodopteraSf9细胞的昆虫细胞；诸如CHO,COS，NSO,293,和Bowes黑素瘤细胞的动物细胞；和植物细胞。用于上述宿主细胞的合适培养基和条件是本领域已知的。在一个实施方案中，编码本发明的白蛋白融合蛋白的多核苷酸可与指导本发明的蛋白质定位到原核或真核细胞特定区室和/或指导从原核或真核细胞分泌本发明蛋白质的信号序列融合。例如，在大肠杆菌中，人们可能希望指导该蛋白质表达进壁膜间隙。可融合本发明的白蛋白融合蛋白以指导该多肽表达进细菌壁膜间隙的信号序列或蛋白质(或其片断)的例子包括，但不限于，pe/j5信号序列，麦芽糖结合蛋白(MBP)信号序列，MBP,owpj信号序列，周质大肠杆菌热不稳定性肠毒素B-亚基的信号序列，碱性磷酸酶信号序列。用于构建融合蛋白指导蛋白质定位的一些载体是商业上可获得的，例如可从NewEnglandBiolabs获得的pMAL系列载体(特别是pMAL-p系列)。在一个具体实施方案中，本发明的白蛋白融合蛋白的多核苷酸可与WW果胶酸裂合酶信号序列融合以提高该多肽在革兰氏阴性细菌中的表达和纯化效率。参见，美国专利号5,576,195和5,846,818，本文以其整体引用其内容以供参考。可与本发明的白蛋白融合蛋白融合以介导其在哺乳动物细胞中分泌的信号肽的例子包括，但不限于，MPIF-1信号序列(例如，GenBank登录号AAB51134的氨基酸l画21)，stanniocalcin信号序歹'J(MLQNSAVLLLLVISASA,SEQIDNO:一_);和共有信号序列(MPTWAWWLFLVLLLALWAPARG,SEQIDNO:—)。可用于与杆状病毒表达系统结合的合适的信号序列是gp67信号序列(例如，GenBank登录号AAA72759的氨基酸1-19)。使用谷氨酰胺合酶(GS)或DHFR作为选择标记的载体分别可在药物曱硫氨酸sulphoximine或氨曱蝶呤存在的条件下扩增。基于谷氨酰胺合酶的载体的一个优势是可利用谷氨酰胺合酶阴性的细胞系(例如，鼠骨髓瘤细胞系，NSO)。谷氨酰胺合酶表达系统也可通过提供另一抑制剂防止内源性基因的作用而在表达谷氨酰胺合酶的细胞(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)中起作用。谷氨酰胺合酶表达系统及其元件在PCT公开号WO87/04462;WO86/05807;WO89/01036;WO89/10404;和WO91/06657中详细描述，本文以其整体引用以供参考。另外，谷氨酰胺合酶表达载体也可从LonzaBiologies,Inc.(Portsmouth,NH)获得。使用GS表达系统在鼠骨髓瘤细胞中表达和生产单克隆抗体在Bebbington等，Ao々ec/z"o/ogv10:169(1992)和在Biblia和Robinson所o&c/z"o/.11:1(1995)中描述，本文引用以供参考。本发明还涉及含有诸如在本文中所述的载体构建体的宿主细胞，且还涉及含有使用本领域已知的技术与一个或多个异源性调控区(例如，启动子和/或增强子)可操作地相连的本发明的核苷酸序列的宿主细胞。该宿主细胞可以是高等真核细胞，例如哺乳动物细胞(例如，来源于人的细胞)，或低等真核细胞，例如酵母细胞，或者该宿主细胞可以是原核细胞，例如细菌细胞。可选择能够控制插入的基因序列表达，或以所需的特定方式修饰和加工该基因产物的宿主菌抹。在某些诱导剂存在时可提高从某些启动子的表达；因此可控制该遗传工程多肽的表达。另外，不同宿主细胞具有特征性和特异性的蛋白质翻译和翻译后加工和修饰(例如，磷酸化，裂解)的机制。可选择合适的细胞系以确保表达的外源性蛋白质的所需修饰和加工。通过磷酸钙转染，DEAE-葡聚糖介导的转染，阳离子脂类介导的转染，电穿孔，转导，感染，或其它方法可实现将本发明的核酸和核酸构建体导入宿主细胞中。该方法在许多标准实验室手册，例如Davis等，BasicMethodsInMolecularBiology(1986)中描述。特別可预期的是本发明的多肽事实上可通过不含重组载体的宿主细胞表达。除了涉及含有本文讨论的载体构建体的宿主细胞外，本发明还涉及改造为缺失或取代内源性遗传物质(例如，用相应于治疗性蛋白的白蛋白融合蛋白取代相应于治疗性蛋白的编码序列)，和/或包含遗传物质(例如，可包含异源性多核苦酸序列，例如相应于治疗性蛋白的本发明的白蛋白融合蛋白)的脊推动物来源，特别是哺乳动物来源的原代，传代，和永生化宿主细胞。与内源性多核苷酸可操作地相连的遗传物质可活化，改变，和/或扩增内源性多核苷酸。另外，可使用本领域已知的技术通过同源重组可操作地连接异源性多核芬酸(例如，编码白蛋白融合蛋白，或其片断或变异体的多核苷酸)和/或异源性调控区(例如，启动子和/或增强子)与编码治疗性蛋白的内源性多核苷酸序列(参见，例如，美国专利号5,641,670，1997年6月24日公开；国际公开号WO96/29411;国际公开号WO94/12650;Koller等，Ato/.爿o^.S"L/iSJ86:8932-8935(1989);和Zijlstra等，Atowre342:435-438(1989),各文献的公开内容以其整体引用以供参考)。有利的是，本发明的白蛋白融合蛋白可通过包括硫酸铵或乙醇沉淀，酸提取，阴离子或阳离子交换色谱法，磷酸纤维素色谱法，疏水相互作用色谱法，亲和色谱法，羟基磷灰石色谱法，疏水电荷相互作用色谱法，和凝集素色谱法的熟知方法从重组细胞培养物中回收和纯化。在一些实施方案中，可使用高效液相色镨法("HPLC")纯化。在某些情况下，治疗性蛋白质具有低可溶性或者仅在低或高pH下或者仅在高或低盐条件下可溶。治疗性蛋白与HAS的融合很可能提高该治疗性蛋白质的可溶性特征。在一些实施方案中，使用一种或多种上述色谱法纯化本发明的白蛋白融合蛋白。在其它实施方案中，本发明的白蛋白融合蛋白使用一种或多种下列色谱柱纯化Q琼脂糖FF柱，SP琼脂糖FF柱，Q琼脂糖高效柱，蓝色琼脂糖FF柱，蓝色柱，苯基琼脂糖FF柱，DEAE琼脂糖FF,或曱基柱。另外，本发明的白蛋白融合蛋白可使用在国际公开号WO00/44772中所述的方法纯化，本文以其整体引用以供参考。本领域的技术人员可容易地改良其中所述的方法用于纯化本发明的白蛋白融合蛋白。本发明的白蛋白融合蛋白可从包括例如，细菌，酵母，高等植物，昆虫，和哺乳动物细胞的原核或真核宿主通过重组技术产生的产物中回收。依赖于重组生产方法采用的宿主，本发明的多肽可被糖基化或者非糖基化。另外，在某些情况下由于宿主介导的加工，本发明的白蛋白融合蛋白也可包含起始修饰的曱硫氨酸残基。因此，本领域熟知在所有真核细胞中任何蛋白质在翻译后一般高效切除翻译起始密码子编码的N-末端甲硫氨酸。尽管在大多数原核生物中也有效切除大多数蛋白质上的N-端曱硫氨酸，但是对于某些蛋白质，依赖于与N-末端曱硫氨酸共价连接的氨基酸的特性，该原核切除加工失效。本发明的白蛋白融合蛋白和结合治疗性蛋白或其片断或变异体的抗体可与诸如肽的标记序列融合以有利于纯化。在一个实施方案中，该标记的氨基酸序列是六组氨酸肽，例如在pQE载体(QIAGEN，Inc.，9259EtonAvenue,Chatsworth,CA,91311)中提供的标记，以及其它标记，其中许多是商业上可获得的。按Gentz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:821-824(1989)所述，例如，六组氨酸给融合蛋白提供了方便的纯化方法。用于纯化的其它肽标记包括，但不限于，"HA"标记，它相应于来自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等，Cell37:767(1984))和"FLAG"标记。另外，本发明的白蛋白融合蛋白可与诸如细胞毒素的治疗性半分子，例如细胞抑制剂或杀细胞剂，治疗剂或放射性金属离子，例如a-放射体，例如213Bi相连接。该试剂的例子在美国临时申请系列号60/355,547和在WO01/79480(第107页)中提供，本文引用以供参考。白蛋白融合蛋白也可附着到固相支持物上，该固相支持物具体用于肽的免疫测定和纯化，与本发明的白蛋白融合蛋白结合或相连。该固相支持物包括，但不限于，玻璃，纤维素，聚丙烯酰胺，尼龙，聚苯乙烯，聚氯乙烯或聚丙烯。本发明还提供了本发明的白蛋白融合蛋白的化学修饰衍生物，它可提供进一步的优势，例如多肽的可溶性，稳定性和循环时间增加，或免疫原性降低(参见美国专利号4,179,337)。WO01〃9480(第109-111页)中提供了涉及使用聚乙二醇的实施例，本文引用以供参考。本发明的白蛋白融合蛋白的存在和数量可使用ELISA,即本领域已知的熟知免疫测定法来测定。多肽的使用本文鉴定的各多肽可用于许多方法。下面的描述应认为是举例性的且利用了已知的技术。本发明的白蛋白融合蛋白可用于哺乳动物，优选人类的各种紊乱(disorder)的治疗，预防和/或预后。该紊乱包括，但不限于，本文在表4标题为"生物学活性，，下描述的那些紊乱。例如，本发明的白蛋白融合蛋白可用作丝氨酸蛋白酶，纤溶酶，人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和/或激肽释放酶的抑制剂。白蛋白融合蛋白也可用于测定生物学样品中的多肽水平。例如，放射标记的本发明的白蛋白融合蛋白可用于体内的多肽成像。测定法的例子在例如，本文作为参考文献引用的美国临时申请系列号60/355,547和WO0179480(第112-122页)中提供且是本领域熟知的。用于体内蛋白质成像的标记包括，但不限于通过X-射线照相术，核磁共振(NMR),电子自旋驰豫(relaxation)(ESR),正电子发射断层照像(PET),或计算机X-射线断层术(CT)可检测的那些标记。对于X-射线照相术，合适的标记包括诸如钡或铯的放射性同位素，它们发射可检测的射线但对受试者无明显伤害。用于NMR和ESR的合适标记包括具有可检测的特征性自旋的那些标记，例如氘，通过标记给表达本发明的白蛋白融合蛋白的细胞系提供的营养成分可将它掺入白蛋白融合蛋白的。通过将用合适的可检测成像半分子，例如放射性同位素(例如，131I，112In，99mTc，(131I，125I，123I,121I),碳("C)，硫("S)，氚(3印，铟(115，11,113mIn，112In，mIn),和锝("Tc,99mTc)，铊(加Ti)，镓(、，67Ga),钇(，d),钼("Mo)，氙('"Xe),氟("F,153Sm,177Lu,159Gd,149Pm，140La，175Yb，166Ho,90Y,47Sc，186Re,188Re,142Pr,1()5Rh,97Ru)，不透射线物质，或核磁共振可检测的物质标记的白蛋白融合蛋白导入(例如，肠胃外，皮下或腹膜内)哺乳动物中用于检查免疫系统疾病。本领域应明白受试者的大小和所用的成像系统将决定产生诊断图像所需的成像半分子的量。对于人受试者所用的放射性同位素半分子，注射的放射性量一般范围是从大约5至20毫居里(millicuries)的99mTc。然后标记的白蛋白融合蛋白在存在一种或多种受体，配体或底物(相应于用于制备本发明的白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质的受体，配体或底物)的体内位置(例如，器官，细胞，细胞外空间或基质)优先积累。作为选择，如果白蛋白融合蛋白包含治疗性抗体的至少一个片断或变异体，那么标记的白蛋白融合蛋白可在存在相应于治疗性抗体(用于制备本发明的融合蛋白)结合的那些多肽/表位的体内位置(例如，器官，细胞，细胞外空间或基质)优先积累。体内肿瘤成像在S.W.Burchiel等，"放射性标记的抗体及其片断的免疫药物动力学，，(见r"附or7wag/"g:TTzei^d/oc/ze/w'ca/o/Ca"cer第13章，S.W.Burchiel和B.A.Rhodes编，MassonPublishingInc.(1982))中描述。其中所述的方法可由本领域的技术人员容易地进行改良用于本发明的白蛋白融合蛋白。本发明的白蛋白融合蛋白也可用于产生抗体，该抗体又可用于测量治疗性蛋白，白蛋白，和/或本发明的白蛋白融合蛋白在重组细胞中的蛋白质表达，作为评估宿主细胞转化的一个方法，或者用于测量在生物学样品中的蛋白质表达。另外，本发明的白蛋白融合蛋白可用于检测本文所述的生物学活性。转基因生物本发明还包括表达本发明的白蛋白融合蛋白的转基因生物。转基因生物是将重组，外源性或克隆的遗传物质转移进其中的遗传修饰的生物。该遗传物质通常称为转基因。转基因的核酸序列可包含一个或多个转录调控序列和对于所编码的蛋白质最佳表达和分泌所必需的其它核酸序列，例如内含子。该转基因可设计成指导所编码的蛋白质以有利于其从生物或者从该生物产生的产物，例如，从该生物的奶，血液，尿，卵，毛发或种子中回收的方式表达。该转基因可由与靶动物种相同物种或者不同物种的基因组产生的核酸序列组成。该转基因可在正常情况下没有发现该具体核酸序列的基因组位置或者在该转基因的正常位置整合。术语"生殖细胞系转基因生物"是指将遗传改变或遗传信息导入种系细胞，从而赋予该转基因生物能将该遗传信息传递给后代的能力的转基因生物。如果该后代事实上具有某些或者全部该改变或遗传信息，那么它们也是转基因生物。该改变或遗传信息对于接受者所属的生物物种可以是外源的，仅对特定的个体接受者是外源的，或者可以是该接受者已经具有的遗传信息。对于最后一种情况，改变的或导入的基因可不同于天然基因进行表达。转基因生物可以是转基因人，动物或植物。转基因可通过包括转染，电穿孔，显微注射，胚胎干细胞中的基因靶向和重组病毒或逆转录病毒感染的各种不同的方法产生(参见，例如，美国专利号4,736,866;美国专利号5,602,307;Mullins等(1993)Hypertension22(4):630-633;Brenin等(1997)Surg.Oncol,6(2)99-110;Tuan(纟扁)，/ecomZ,W(3"GeweExpr&w/ow/Vofoco/s,MethodsinMolecularBiologyNo.62，HumanaPress(1997))。将核酸片断导入重组受体哺乳动物细胞中的方法可通过支持多个核酸分子共转化的任何方法进行。产生转基因动物的详细方法是本领域的技术人员容易获得的，包括在美国专利号5,489,743和美国专利号5,602,307中公开的内容。另一信息在本文作为参考文献引用的美国临时申请系列号60/355,547和WO01/79480(第151-162页)中提供。编码本发明的白蛋白融合蛋白的构建体可用作基因治疗方法的一部分用于传递治疗上有效剂量的白蛋白融合蛋白。将核酸体内导入细胞的一个方法是通过使用含有编码本发明的白蛋白融合蛋白的核酸的病毒载体。用病毒载体感染细胞具有这样的优势，即大部分靶细胞可接受该核酸。另外，病毒载体内编码的分子，例如通过病毒载体包含的cDNA，可在吸收病毒载体核酸的细胞中有效表达。所述白蛋白融合蛋白的血浆半衰期延长甚至可基因治疗补偿可能的低水平表达。逆转录病毒载体和腺伴随病毒载体可用作重组基因传递系统用于体内转移编码白蛋白融合蛋白的外源性核酸分子。这些载体用于将核酸有效传递进细胞，且转移的核酸稳定整合进宿主的染色体DNA中。该载体，使用它们的方法，及其优点，和非病毒传递方法的例子在本文作为参考文献引用的美国临时申请系列号60/355,547和WO01〃9480(第151-153页)中详细描述。用于编码本发明的白蛋白融合蛋白的基因的基因传递系统可通过许多方法中的任一种导入患者。例如，该基因传递系统的药用制品可通过例如，静脉内注射全身性导入，且该蛋白质在靶细胞中的特异性转导主要由基因传递载体，控制受体基因表达的转录调控序列引起的细胞型或组织型表达，或其结合提供的特异性转染发生。在其它实施方案中，重组基因的起始传递更局限于完全定向地导入动物。例如，该基因传递载体可通过插管(参见美国专利5，328，470)或通过立体定位注射(例如，Chen等(1994)PNAS91:3054-3057)导入。基因治疗构建体的药用制品可基本上由在可接受的稀释剂中的基因传递系统组成，或者可包含包埋该基因传递载体的緩释基质。如果该白蛋白融合蛋白从重组细胞，例如逆转录病毒载体完整地生产，那么该药用制品可包含产生该白蛋白融合蛋白的一个或多个细胞。其它基因治疗方法在本文作为参考文献引用的美国临时申请系列号60/355,547和WO01〃9480(第153-162页)中描述。药用或治疗组合物本发明的白蛋白融合蛋白或其配制品可通过包括肠胃外(例如，皮下或肌内)注射或静脉内输注的任何常规方法给药。该治疗可由单次剂量或一段时间内的多次剂量组成。另外，该单次或多次剂量比未融合白蛋白的治疗性蛋白以更低的频率给药。尽管单独施用本发明的白蛋白融合蛋白是可能的，但是与一种或多种可接受的载体一起作为药用配制品存在是可取的。该载体在与该白蛋白融合蛋白具有相容性和对其接受者无害的意义上必须是"可接受的"。一^:来说，该载体是无菌和无热原的水或盐水。本发明的白蛋白融合蛋白特别非常适合于在诸如无菌无热原水，盐水或其它等渗溶液的含水载体中配制，因为它们在溶液中的储存期延长。例如，本发明的药用组合物可预先以水溶液形式配制好，例如在配药前几周或几月或更长的时间期限前配制好。含有该白蛋白融合蛋白的配制品可考虑该白蛋白融合蛋白在含水配制品中的储存期延长后制备。如上所述，许多这类治疗性蛋白质的储存期在与HA融合后显著增加或延长。如果气溶胶给药是合适的，本发明的白蛋白融合蛋白可使用标准方法配制成气溶胶。术语"气溶胶"包括能够吸入细支气管或鼻通道的任何气体携带的悬浮相的本发明白蛋白融合蛋白。具体地说，气溶胶包括可在测定剂量的吸入器或喷化器，或在喷雾器中产生的气体携带的悬浮相的本发明白蛋白融合蛋白小滴。气溶胶还包括悬浮于空气或其它载体气体中的本发明化合物的干粉组合物，例如，它可通过从吸入器装置吹入给药。该配制品可按常规以单位剂量形式存在且可通过药学领域熟知的任一方法制备。该方法包括将白蛋白融合蛋白与构成一种或多种辅助成分的载体混合的步骤。一般来说，该配制品可通过将活性成份与液体载体或细分的固体载体或两者均匀和充分混合来制备，然后，如果需要，整形该产品。适合于肠胃外给药的配制品包括可含有抗氧化剂，緩沖剂，抑菌剂和导致该配制品适合于目的接受者的溶质的含水和不含水的无菌注射溶液；和包含悬浮剂和增稠剂的含水和不含水的无菌悬液。该配制品可在单位剂量或多剂量容器，例如密封安瓿，小瓶或注射器中存在，且可在冻干(冷冻干燥)条件下贮存，使用前仅需要临时加入无菌液体载体，例如注射水。临时注射溶液和悬液可从无菌粉末制备。由于本发明的许多白蛋白融合蛋白表现出血清半衰期延长，因此与该治疗性蛋白的非融合型标准配制品相比，该配制品剂量可含有更低摩尔浓度或更低剂量的治疗性蛋白部分。作为例子，当本发明的白蛋白融合蛋白包含一个或多个治疗性蛋白质区域时，可根据相对于该治疗性蛋白效力的该白蛋白融合蛋白的效力，同时考虑与天然治疗性蛋白相比该白蛋白融合蛋白的血清半衰期和储存期延长来计算该剂量形式。例如，在由全长HA与全长治疗性蛋白融合组成的白蛋白融合蛋白中，按单位的等价剂量可表现出更大的试剂重量，但是可减少给药频率。本发明的配制品或组合物可与提及该白蛋白融合蛋白成份储存期延长的说明书或包装插页包装在一起，或者与其一起包含在试剂盒中。例如，该说明书或包装插页可说明推荐的贮存条件，例如时间，温度和光照，并考虑本发明的白蛋白融合蛋白的储存期延长。该说明书或包装插页也可说明本发明的白蛋白融合蛋白的具体优点，例如便于贮存以便用于需要在野外，受控制的医院的户外，临床或办公室条件下使用的配制品。如上所述，本发明的配制品可以是含水形式且可在低于理想环境下贮存而不明显损失治疗活性。本发明还提供了通过给受试者施用在药用上可接受的载体中的有效量的本发明白蛋白融合蛋白或编码本发明的白蛋白融合蛋白的多核苷酸("白蛋白融合蛋白多核苷酸")来治疗和/或预防疾病或紊乱(例如，本文公开的任何一种或多种疾病或紊乱)的方法。施用的本发明的白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸的有效剂量可通过描述了诸如生物学半衰期，生物可利用率和毒性的参数的本领域技术人员熟知的方法，包括使用来自诸如在表4中参考文献描述的常规体外和体内研究的数据，使用本领域的技术人员熟知的方法来测定。该白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸可按与良好医学实践一致的方式，并考虑个体患者的临床情况(特别是单独用白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸治疗的副作用)，给药位点(thesiteofdelivery),给药方法，给药时间表，和医师已知的其它因素进行配制和给药。因此本文使用的"有效量"可按该考虑进行测定。例如，测定给药的物质的有效量依赖于许多因素，包括，例如，该物质的化学结构和生物学活性，动物的年龄和体重，需要治疗的确切病症及其严重性，和给药途径。治疗的频率依赖于许多因素，例如每个剂量施用的多核苦酸构建体量，以及受试者的健康状况和病史。给药的精确量，次数，和给药时间选择可由主治医师或兽医确定。本发明的白蛋白融合蛋白和多核苷酸可施用给任何动物，优选哺乳动物和鸟类。优选的哺乳动物包括人类，狗，猫，小鼠，大鼠，兔，绵羊，牛，马和猪，特别优选人。作为一般性建议，本发明的白蛋白融合蛋白可以比未融合的治疗性肽剂量更低或给药频率更少。治疗上有效的剂量可指足以导致症状改善，疾病稳定，延长患者存活，或改善生活质量的化合物的量。白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸可通过口服，直肠，肠胃外，脑池内，阴道内，腹膜内，局部(作为粉末，软膏，凝胶，滴剂或皮肤膏药)，口颊，或者作为口腔或鼻内喷雾给药。"药用上可接受的载体"是指无毒性固体，半固体或液体填充物，胶嚢材料或任何配制辅剂。本文使用的术语"肠胃外"是指包括静脉内，肌肉内，腹膜内，胸骨内，皮下和关节内注射和输注的给药方式。本发明的白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸还适合于通过緩释系统给药，例如在本文作为参考文献引用的美国临时申请系列号60/355,547和WO01/79480(第129-130页)中所述的那些系统。对于肠胃外给药，在一个实施方案中，该白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸一般可通过将它以所需纯度，以单位剂量的可注射形式(溶液，悬液，或乳剂)，与药用上可接受的载体，即在所用剂量和浓度下对接受者无毒性且与该配制品的其它成份相配伍的载体混合来配制。例如，该配制品任选不包括氧化剂和已知对该治疗剂有害的其它化合物。本发明的白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸可单独或者与其它治疗剂联合给药。可与本发明的白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸联合给药的白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸试剂包括但不限于，化疗剂，抗生素，类固醇和非类固醇抗炎剂，常规免疫治疗剂，和/或在本文作为参考文献引用的美国临时申请系列号60/355,547和WO01/79480(第132-151页)中所述的治疗性处理。联合可以是同时，例如作为混合物，分开但同时进行或并行；或者依次给药。它包括该联合试剂作为治疗性混合物一起给药的情况，且也包括该联合试剂分开但同时给药的操作，例如，通过分开的静脉内路线进入相同个体中。"联合"给药还包括先给予一种化合物或试剂，接着再给第二种的分开给药。适用于本发明的药用组合物包括这样的组合物，其中包含有效量的活性成份以达到其计划目的。本发明还提供了一种药品包或试剂盒，它包含一个或多个容器，其中填充了含有本发明白蛋白融合蛋白的药用组合物的一种或多种成份。任选与该容器相联的是按控制药品或生物学产品制造，使用或销售的政府机构指定形式的说明书，该说明书反映了该机构批准制造，使用或销售用于人类给药。按照本发明的该一般性描述，相信本领域的普通技术人员使用前面的描述和下面的说明性实施例能够作出和利用本发明发现的改变并实施所要求保护的方法。因此下面的工作实施例，具体指出了本发明的不同实施方案，且不以任何方式构成对该公开内容的其它方法的限制。实施例实施例1:构建N-末端和C-末端白蛋白-(GGShGG接头克隆载体重组白蛋白表达载体pDB2243和pDB2244以前已经在专利申请WO00/44772中描述。重组白蛋白表达载体pAYE645和pAYE646以前已经在英国专利申请0217033.0中描述。^"饰质粒pDB2243以1更以这样的方式在白蛋白多肽的C-末端导入编码14个氨基酸多肽接头N-GGSGGSGGSGGSGG-C((GGS)4GG，"N，，和"C"表示多肽序列的方向)(SEQIDNO:—)的DNA序列，该方式随后使得另一多肽链在C-末端插入到(GGS)4GG接头上以产生一般构型为白蛋白-(GGS)4GG-多肽的C-末端白蛋白融合蛋白。同样，修饰质粒pAYE645以便以这样的方式在白蛋白多肽的N-末端导入编码(GGS)4GG多肽接头的DNA序列，该方式随后使得另一多肽链以N-末端插入到(GGS)4GG接头上以产生一般构型为多肽-(GGS)4GG-白蛋白的N-末端白蛋白融合蛋白。质粒pDB2243在Sleep，D,,等(1991)Bio/Technology9,183-187和在专利申请WO00/44772中描述，它包含酵母尸朋7启动子和酵母v4D//7终止子以提供合适的转录启动子和转录终止子序列。质粒pDB2243用BawHI完全消化，凹端用T4DNA聚合酶和dNTPs平端化，最后再连接以产生质粒pDB2566。通过退火合成寡核苷酸JH033A和JH033B合成双链合成寡核苷酸接头Bsu36I/HindlII接头。J腦3A5，-TTAGGCTTAGGTGGTTCTGGTGGTTCCGGTGGTTCTGGTGGATCCGGTGGTTAATA画3，(SEQIDNO:一)JH033B5，-AGCTTATTAACCACCGGATCCACCAGAACCACCGGAACCACCAGAACCACCTAAGCC-3，(SEQIDNO:—)将退火的Bsu36I/HindlH接头连接进Hindm/Bsu361切割的pDB2566中以产生质粒pDB2575X,它包含在其C-末端有(GGS)4GG肽接头的白蛋白编码区。含有酵母启动子和酵母jD///终止子提供合适的转录启动子和转录终止子序列的质粒pAYE645在英国专利申请0217033.0中描述。质粒pAYE645用限制性酶消化完全并用限制性酶HindIII部分消化，分离含有酵母启动子3，端和rHA编码序列的DNA片断。用4/n////,7dIII消化在专利申请WO00/44772中描述的质粒pDB2241并分离含有酵母/^^7启动子5'端和酵母爿Z)//7终止子的DNA片断。然后将来自pAYE645的4/7IW,'"dmDNA片断克隆进4/7n/历"dmpDB2241载体DNA片断上以产生质粒pDB2302。将质粒pDB2302用Pacl/Xhol消化完全并分离6.19kb片断，凹端用T4DNA聚合酶和dNTPs平端化，并再连接以产生质粒pDB2465。将质粒pDB2465用Clal线形化，凹端用T4DNA聚合酶和dNTPs平端化，并再连接以产生质粒pDB2533。质粒pDB2533用Blnl线形化，凹端用T4DNA聚合酶和dNTPs平端化，并再连接以产生质粒pDB2534。质粒pDB2534用BmgBI/5gffl消化完全，分离6.96kbDNA片断并连接到一个双《连寡核香酸接头，即VC053/VC054和VC057/VC058上以产生质粒pDB2540,或连接到VC055/VC056和VC057/VC058上以产生质粒pDB2541。VC0S3(SEQIDNO:—VC054(SEQEDNO:_)VC055(SEQIDNO:_)VC056(SEQIDNO:)VC057CTCAATACTTGCAACAATGTCCATTCGAAGATCAC-3'(SEQIDNO:)VC058AAAGCCTTGAAGTTTTCCTCACCTAGGT-3'(SEQIDNO:)双链合成寡核苷酸接头BglII/Agel接头通过退火合成寡核苷酸JHO:55A和JH035B来合成。JH035A5'-GATCTTTGGATAAGAGAGGTGGATCCGGTGGTTCCGA-3，(SEQIDNO:JH035B5'-CCGGTGAGCGACTTCGGACTTGTGAGCGTCACCACAA陽3'(SEQIDNO:一)将退火的Bg氾"gel接头连接进5g/II"gel切割的pDB2540上以产生质粒pDB2573X,它包含在其N-末端具有(GGS)4GG肽接头的白蛋白编码区。实施例2:未融合的DPI-14的平衡抑制常数DPI-14的氨基酸序列是EAVREVCSEQAETGPCIAFFPRWY过反向翻译过程可从该多肽序列产生一个DNA序列。在毕赤氏酵母属中表达DPI-14并使用离子交换色谱，疏水相互作用色谱，和超滤从发酵肉汤上清中提取。DPI-14抑制人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)的平衡抑制常数(Ki)测定为15土2pM，对于[HNEh57土7pM。使用实施例15所述的方法进行IQ测量。实施例3:构建N-末端和C-末端白蛋白-DPI-14融合蛋白在5，或3'末端提供该DNA序列以编码DPI-14编码区，白蛋白编码区或前导序列之间的连接序列以适合于N-末端DPI-14-(GGS)4GG-白蛋白或C-末端白蛋白-(GGS)4GG-DPI-14融合蛋白。从重叠的寡核苦酸构建N-末端BglII-BamHIDPI-14cDNA(表5)和C-末端BamHI-HindIIIDPI-14cDNA(表6)。实施例4:构建N-末端DPI-14-(GGS、GG-白蛋白表达质粒质粒pDB2573X用BglII和BamHI消化完全，分离6.21kb的DNA片断并用小牛肠磷酸酶处理，然后与0.2kb的BglII/BamHIN-末端DPI-14cDNA连接以产生pDB2666。N-末端DPI-14-(GGS)4GG-白蛋白融合蛋白的DNA和氨基酸序列分别在表7和表8中显示。通过"分解(disintegration)"在EP-A-286424中一般性公开和由Sleep,D.，等(1991)Bio/Technology9,183-187所述的质粒pSAC35提供合适的酵母载体序列。从pDB2666分离NotlN-末端DPI-14-(GGS)4GG-rHA表达序列盒，纯化并连接进已用小牛肠磷酸酶处理的Notl消化的pSAC35中，产生两个质粒；第一个(pDB2679)含有与LEU2相同表达方向的Notl表达序列盒，而第二个(pDB2680)含有与LEU2相反方向的Notl表达序列盒。pDB2679和pDB2680都是较好的目的融合蛋白生产质粒。实施例5:构建C-末端白蛋白-(GGS、GG-DPI-14表达质粒质粒pDB2575X用HindIII部分消化，然后用BamHI消化完全。分离所需的6.55kbDNA片断并与0.2kbBamHI/Hind111C末端DPI-14cDNA连接以产生pDB2648。C-末端白蛋白-(GGS)4GG-DPI-14融合蛋白的DNA和氨基酸序列分别在表9和表10中显示。通过"分解"在EP-A-286424中一般性公开和由Sleep,D.，等(1991)Bio/Technology9,183-187所述的质粒pSAC354是供合适的酵母载体序列。从pDB2648分离NotlC-末端白蛋白-(GGS)4GG-DPI-14表达序列盒，纯化并连接进已用小牛肠磷酸酶处理的Notl消化的pSAC35中，产生含有与LEU2相同表达方向的Notl表达序列盒的pDB2651。实施例6:构建C-末端白蛋白-(GGS、GG-DX-1000表达质粒质粒pDB2575X用HindIII部分消化，然后用BamHI消化完全。分离所需的6.55kbDNA片断并与表11所示的0.2kbBamHI/HindlllC末端DX-1000cDNA连接以产生pDB2648X-1000。通过"分解，，在EP-A-286424中一般性公开和由Sleep,D.,等(1991)Bio/Technology9,183-187所述的质粒pSAC35提供合适的酵母载体序列。从pDB2648X-1000分离NotlC-末端白蛋白-(GGS)4GG-DX1000表达序列盒，纯化并连接进已用小牛肠磷酸酶处理的Notl消化的pSAC35中，产生含有与LEU2相同表达方向的Notl表达序列盒的pDB2651X-1000。实施例7:构建N-末端和C-末端白蛋白-DX-8卯融合蛋白产生基础克隆DX-890的氨基酸序歹'J是EACNLPIVRGPCIAFFPRWAFDAVKGKCVLFPYGGCQGNGNKFYSEKECREYCGVP(SEQIDNO:—)。通过反向翻i争过程从该多肽序列产生DNA序列。在5，或3，端提供该DNA序列以编码DX-890编码区，白蛋白编码区或前导序列之间的连接序列以适合于N-末端DX-890-(GGS)4GG-白蛋白或C-末端白蛋白-(GGS)4GG-DX-890融合蛋白。从重叠的寡核苷酸构建N-末端BglII-BamHIDX-890cDNA(表12)和C-末端Bamffl-HindIIIDX-890cDNA(表13)。实施例8:构建N-末端DX-89(KGGSV3G-白蛋白表达质粒质粒pDB2573X用Bglll和BamHI消化完全，分离6.21kb的DNA片断并用小牛肠磷酸酶处理，然后与0.2kb的BglII/BamHIN-末端DX-890cDNA连接以产生pDB2683。N-末端DX-8卯-(GGS)4GG-白蛋白融合蛋白的DNA和氨基酸序列分别在表14和表15中显示。通过"分解"在EP-A-286424中一般性公开和由Sleep,D.,等(1991)Bio/Technology9,183-187所述的质粒pSAC35提供合适的酵母载体序列。从pDB2683分离NotlN-末端DX-890-(GGS)4GG-rHA表达序列盒，纯化并连接进已用小牛肠磷酸酶处理的Notl消化的pSAC35中，产生含有与LEU2相反方向的Notl表达序列盒的pDB2684。实施例9:构建C-末端白蛋白-(GGS)4GG-DX-890表达质粒质粒pDB2575X用HindIII部分消化，然后用BamHI消化完全。分离所需的6.55kbDNA片断并与0.2kbBamHI/Hindl11C末端DX-890cDNA连接以产生pDB2649。C-末端白蛋白-(GGS)4GG-DX-8卯融合蛋白的DNA和氨基酸序列分别在表16和表17中显示。通过"分解，，在EP-A-286424中一般性公开和由Sle印，D.，等(1991)Bio/Technology9,183-187所述的质粒pSAC35提供合适的酵母载体序列。从pDB2649分离NotlC-末端白蛋白-(GGS)4GG-DX-890表达序列盒，纯化并连接进已用小牛肠磷酸酶处理的Notl消化的pSAC35中，产生两个质粒；第一个pDB2652含有与LEU2相同表达方向的Notl表达序列盒，而第二个pDB2653含有与LEU2相反方向的Notl表达序列盒。实施例10:发酵生产融合蛋白按WO00/44772中所述在发酵培养物中表达DX-8卯-HSA融合蛋白。除了在洗脱緩冲液中需要额外的200mMNaCl外，按WO00/44772中所述使用标准HA纯化SP-FF(Pharmacia)条件从发酵培养物上清纯化DX-890-HSA融合蛋白。实施例11:酵母转化和培养条件按SleepD.,等(2001)Yeast18,403-421所述将在WO95/23857,WO95/33833和WO94/04687中公开的酵母菌林转化成亮氨酸原养型。将转化子涂布到緩冲型基本培养基(BMM,Kerry-Williams,S.M.等(1998)Yeast14,161-169所述)上并在3(TC下培养直到生长至足够用于进一步分析。实施例12:DX-890样品的KJ则量按照形成可逆复合物的紧密结合抑制模型(1:1化学计量法)测定DX-8卯或DX-890-HAS抑制HNE的平衡抑制常数(KO。在30。C下在50mMHEPES,pH7.5,150mMNaCl,和0.1%TritonX-100中测定hNE的抑制。所有反应(总体积二200^L)在微量滴定板(Costai^3789)上进行。hNE用各种浓度的添加抑制剂培养24小时。从相对底物水解率测定剩余酶活性。通过添加N-曱氧基琥珀酰-八&-八13-1"0^31-7-氨基-甲基香豆素作为底物开始水解反应。该底物的酶促裂解释放曱基香豆素半分子，伴随着样品荧光增强。在360nm激发光和460nm发射光下监测底物水解率。通过对公式1的非线性回归分析拟合剩余百分活性与抑制剂浓度的绘图以测定平衡解离常数。其中%八=百分活性I=DX-890E=HNE浓度Ki=平衡抑制常数在相同时间测量天然DX-890的Kj作为阳性对照。DX-8卯和DX-890-HAS融合蛋白对人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)的K;彼此相似(图1)。用来自摇瓶酵母培养物或者来自发酵罐的上清中的DX-8卯-HAS融合蛋白可见相似的结果。两种上清都由Aventis或Dyax供应。该结果表明与HAS融合不影响DX-890作为HNE抑制剂的效力。实施例13:DX-88与HASN末端的融合DX-88是来自人LACI第一Kunitz结构域的一个Kunitz结构域，它以K广40pM抑制人血浆激肽释放酶。DX-88的血清半衰期不超过1小时。DX-88在临床试验中通常用于治疗遗传性血管性水肿(HAE)。初步数据表明DX-88是安全有效的。HAE是发病以阵发式复发的病症，且具有长效形式可允许预防性治疗代替反应性治疗。可获得准备用于与HA的N末端融合的DX-88的DNA序歹'J。在5，或3，端提供该DNA序列以编码DX-88编码区，白蛋白编码区或前导序列之间的连接序列以适合于N-末端DX-SS-(GGS)4GG-白蛋白(表")。质粒pDB2573X用BglII和BamHI消化完全，分离6.21kb的DNA片断并用小牛肠磷酸酶处理，然后与0.2kb的BglII/BamHIN-末端DX-88cDNA连接以产生pDB2666-88。N-末端DX-88-(GGS)4GG-白蛋白融合蛋白的DNA和氨基酸序列分别在表19和表20中显示。通过"分解"在EP-A-286424中一般性公开和由Sleep,D.,等(1991)Bio/Technology9,183-187所述的质粒pSAC35提供合适的酵母载体序列。从pDB2666-88分离NotlN-末端DX-88-(GGS)4GG-rHA表达序列盒，纯化并连接进已用小牛肠磷酸酶处理的Notl消化的pSAC35中，产生两个质粒；第一个pDB2679-88含有与LEU2相同表达方向的Notl表达序列盒，而第二个pDB2680-88含有与LEU2相反方向的Notl表达序列盒。实施例14:构建C-末端白蛋白-(GGS、GG-DX-88表达质粒按实施例5所述，质粒pDB2575X用HindIII部分消化，然后用BamHI消化完全。分离所需的6.55kbDNA片断并与0.2kbBamHI/HindlllC末端DX-88cDNA连接(表21)以产生pDB2648-88。C-末端白蛋白-(GGS)4GG-DX-88融合蛋白的DNA和氨基酸序列分别在表22和表23中显示。通过"分解"在EP-A-286424中一般性公开和由Sleep,D.，等(1991)Bio/Technology9,183-187所述的质粒pSAC35提供合适的酵母载体序列。从pDB2648-88分离NotlC-末端白蛋白-(GGS)4GG-DX-88表达序列盒，純化并连接进已用小牛肠磷酸酶处理的Notl消化的pSAC35中，产生含有与LEU2相同表达方向的Notl表达序列盒的pDB2651-88。实施例15:在小鼠中的药物动力学试验按WO00/44772中所述在发酵培养物中表达DX-890-HSA融合蛋白。除了在洗脱緩冲液中需要额外的200mMNaCl外，按WO00/44772中所述使用标准HA纯化SP-FF(Pharmacia)条件从发酵培养物上清纯化DX-8卯-HSA融合蛋白。通过SEC-HPLC从渗滤残留物纯化大约10mg的rHA-DX-8卯融合蛋白并通过SCS-PAGE和RP-HPLC方法鉴定为大约92%是单体形式。该物质用于随后进行125I放射标记和体内血浆清除试验。对于小鼠试验，在尾静脉注射动物且在注射后大约0,7,15,30和90分钟，4小时，8小时，16小时，24小时时处死4只动物，对于天然DX-890不超过4个时间点，因为其很可能半衰期较短。记录注射时间和取样时间。处死时，将0.5ml的样品收集进抗凝剂(0.02mlEDTA)中。离心细胞并与血浆分离。将血浆分成两个等分试样，一个冷冻且一个在4。C下贮存用于即时分析。分析包括对所有样品进行Y计数。另外，对各时间点的两个血浆样品(N二2)进行分析，即，对0，和30分钟的125I-DX-890,和0，30分钟，和24小时的125I-DX-890-HAS融合蛋白。使用带有在线(in-line)放射检测器的SEC-HPLC琼脂糖-12柱分析血浆级份(fractions)。结果表明DX-890与HAS融合将其p(清除)半衰期显著提高约5倍(图2)。另外，似乎DX-890-HSA-融合蛋白在小鼠血浆中比DX-8卯更稳定(图3和4)。实施例16:在兔中的药物动力学试-睑通过碘标记蛋白质并测量放射性标记从兔循环中的清除率来测量DX-8卯和DX-890-HAS的药物动力学特性。使用生碘(iodogen)方法用碘-125碘标记两种DX-890制品。碘标记后，通过大小排阻层析(SEC)从未结合的标记中纯化两种标记的蛋白质制品。合并具有最高放射性的SEC柱级份。通过闪烁计数鉴定纯化的放射性标记的制品的比活并通过使用带有在线放射检测器的琼脂糖-12柱通过SEC鉴定其纯度。新西兰白兔(约2.5Kg)用于清除率测定，一只动物分别用于两种标记的蛋白质制品。将放射性标记的制品通过耳静脉注射进动物中。在大约O，7，15,30,和90分钟的早期时间点和在4,8,16，24，48,72，96，144，168,和192小时的晚期时间点对每只动物在每个时间点收集一个血液样品。将样品(大约0.5ml)收集进抗凝剂(EDTA)试管中。通过离心分离细胞与血浆/血清成份。将血浆成份分成两个等分试样。一个血浆等分试样在-70。C贮存且另一个等分试样在4。C下保持用于即时分析。样品分析包括用于清除率测定的放射计数和用于体内稳定性的SEC层析。兔清除率试验的结果在图5和6和在表24中总结。HSA-DX-890融合蛋白显示出体内循环特性相对于未修饰的DX-890显著改进。对该融合蛋白的血浆清除率大量减小以致于一天后的放射性标记的相对循环水平HSA-DX-890融合蛋白比未修饰的蛋白高100倍(图5)。对该数据的筒单双指数匹配表明清除率曲线的a和p部分都大量增加(表24)。具体地说，Tv2(3的值增加超过20倍，从未修饰蛋白质的大约165分钟(2.75小时)到HSA-DX-890融合蛋白的大约3500分钟(~60小时，~2.5天)。另夕卜，与该曲线的緩慢清除部分相关的总物质部分对于融合蛋白几乎是未修饰的DX-890的2倍(表24)。表24在兔中的清除时间<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>最后，融合蛋白相对于未修饰的DX-890表现出体内稳定性提高(图6)。对来自用125I-DX-890注射的兔的血浆进行SEC分析(图6,A部分)表明标记与更高分子量的血浆成份(更早的洗脱峰)相当迅速地相关联。另外，与高分子量物质相关的总残留循环标记的相对比例随着注射后时间的增加而增加(比较30分钟和4小时时的洗脱分布图)。相反，对来自注射了125I-HSA-DX-8卯的兔的血浆样品进行SEC分析(图6，B部分)表明几乎全部循环标记与注射液中可见的HSA-DX-890峰值相关且该标记与该峰值在至少72小时内保持稳定相关。实施例17:用于制备双重融合的HSA的载体载体pDB2300Xl是pDB2575X的修饰形式，其中靠近rHA基因5，端有Bg/II/Bamffl序列盒且靠近3，端有5^EI/Kp"I序列盒。包含该基因的Notl序列盒在表25中显示，其中显示了该DNA，编码的氨基酸序列和有用的限制性位点。在表25各行中，惊叹号后面的各内容是注释，编号和分开该DNA序列以便于理解该设计。实施例18:将第一种情况的DX890加入pDB2300Xl中将表12所示的DNA导入已经用BglII和BamHI切割的pDB2300Xl中以制备新载体pDB2300X2。表26显示了pDB2300X2的Notl序列盒的DNA，编码的氨基酸序列和有用的限制性位点。实施例19:将第二种情况的DX8卯加入。DB2300X2中将表27所示的DNA导入已经用BspEI和Kpnl切割的pDB2300X2中以制备新载体pDB2300X3。尽管该DNA编码与表12的DNA相同的氨基酸序列，但是改变了许多密码子以减少两个DX890-编码区之间的重组可能性。表28显示了该构建体的DNA,编码的氨基酸序列和有用的限制性位点。编码的氨基酸序列在表29中显示。该蛋白质按与本发明的其它构建体相同的方式表达。表103的蛋白质，即"Dx890-HA-Dx890",具有~16%的DX890的HNE-中和活性但是血清寿命时间长得多。因此代表HNE抑制的曲线下面积比净果露的DX890高得多。实施例20:DX1000::(GGS)4GG::HSA将表30所示的DNA导入已经用和SawHI切割的pDB2573X中以构建pDX1000。表31显示了该编码的蛋白质的氨基酸序列。该蛋白质的表达基本上与本发明的其它HA融合蛋白相同。实施例21:DX-88::(GGS、GG::HSA::(GGSy3G::DX-88按与编码DX-8卯-HSA-DX-890的基因的构建体相似的方式，将表18的DNA插入已经用Bg/II和BawHI切割的pDB2300Xl中以制备新载体中以产生含有两种情况的编码DX-88的DNA的pDB2300X88b。表32的DNA基本上不同于表18的DNA以便不可能发生重组。实施例22:多个白蛋白融合蛋白可修饰本文所述的N-末端融合蛋白表达质粒pDB2540以便在C-末端导入单一Bsu361;该新质粒称为pDB2301X。来自pDB2301X的Notl表达序列盒的DNA序列如下pDB2540+肠361Not工1GCGGCCGCccgtaatgcggtatcgtgaaagcgaaaaaaaaactaacagtagataagacag61atagacagatagagatggacgagaaacagggggggagaaaaggggaaaagagaaggaaagNarl121aaagactcatctatcgcagataagacaatcaaccctcatGGCGCCtccaaccaccatccg<formula>formulaseeoriginaldocumentpage65</formula>28B1catttcacccaattgtagatatgctaactccagcaa'tgagttgatgaatctcggtg亡gtaMot工2941ttttatgtcctcagaggacaacacctgttgtaatcgttcttccacacggatcGCGGCCGC可将编码多肽的DNA插入BglII和Agel位点之间以表达N-末端白蛋白融合蛋白，或者插入Bs11361和HindlII(不是单一的且因此需要部分HindIII消化)位点之间以表达C-末端白蛋白融合蛋白，或者插入两种位点对之间以制备联合N-和C-末端白蛋白融合蛋白。可任选插入多肽间隔区。来自修饰的pDB"40的Notl表达序列盒的DNA序列预期如下pDB2540+2xGS接头611211612413013S14214B1541S〇l"1721781NotlGCGGCCGCccatagacagatcsctagggacgaaagagct仁taagaggcttggacacatatatgcacttatgtaatgcggtagagatggacctatcgcagacaagcgctcggtgcaatgggtttgaacactgcccggggtctccgggttaggcaaaatttggtcccgttatatcgtgaaaggagaaacaggcaccgttagcagtgccaattgcattgcacctttttt333CggctcagtaaattggagttccgaaaaaaaaactaacagtaNai:工aaccctcatG33cgcttgsccgscaaatcatgcacccgacaaaaaacgaggggctttcggtgccactgcagataaagagcttcccatacaGCGCCtccaagaatacg仁ctgccactaset己tagcacag仁ctttggsaatgtggcttatcgataagacagccaccatccggctcgcctttscgaggtcacagtgtgataat:gtgcctacttgtccgtggattaggtgactscgcca_gga_ctccaattagcHind:[工工ttcatcgccaataaaaaaacAAGCTTaacctaattctaacaagcaaagatgaagtgggtt841ttcategtetccattttg亡tcttc^ttctcctctg,cttact:>......................融合蛋白前导序列-..Bgl工工ctAGATCTttggataagaga901短10211081i:ui120112611381BajnK工ggtGGATCCggtggttccggtggttctggtggttccggtggtgaegcteacaagtccgaa>>.........:......GS:接头'.................〉1>>.....rHA........>Age工gtcgctcACCGGTtcaaggacctaggtgaggaaaacttcaaggct匕tggtettgatcget>..............rHA合成基因连续到碱基2739ttcgctcaatsccgaattcgcscsccttgtgacgacaacc仁tccacgacacca_ta_cttct:ac仁仁gcaacactasgscttggttgtgctaacaaacttgccacgraagaaacacgctccsgaatgtccattctgttgctgacgttgtgtactaagattggt仁cttcttgaagattgttgttcgaagatcacggaatctgctggttgetaectagaccagaagasgtac亡t:gtttegctaagatcaag仁tggttgsgagaaacsatgtttcttttgaegtcataegaaattgegstsca^ggccaacgasgttcaagtccttggtgtactgcttagsagacactgct仁tcscc14411501156116B11741180118S119211981204121012161"2122已123"2401gaatgttgtcgacgaaggtaggtgaaagaggaattcgctgcacggtgactaaccaagacttctcactgtagctgacttcgttgggtatgtttgagattggcacgaatgttt仁gatcaagcttgttggttatctagaaactccatgtgctgtgtttctctgaagctgctgaaggcttcttcctttcaaggcaagtttctaatgttggaatgctatctcttcttgctgaagtttgaatctaatcttgtacgactaagacctaacgctaaggtaaaactgtgagatacactaactgatagagtctttggwgttsaggctgctttgggc仁gtcgttggttacttgctgatgaccaagttgaagtgaaaacgatggacg仁仁仁gtatacgctagacgaaacCacctttcgatgaaattgttcgaagaaggtcccacggttctaaggtccgtcgtt■caccaagtgtcgacgaaacttgttt^ttgcagattgaeigtgctagattg仁gacttgactaagagctgactgaatgttgtggaaatgccagaagaactacgagacacccagttggaaaagtttcaagccatcaattgggtgcaagtctccatgttgtaagc仁tgaaccaattgtactgaattacgttccaacaaagttggagtgcttccttctcaaagattaggttcacactggctaagtactgacttgccctgaagctaaactactccgtgttgtgctgctgg匕cgaagaaatacaagttccccasctttacccagaagctgtgtgttttctttggttaaaggaattcaatgaattgagacccaaaggcttgaatgttgtcatctgtgaaatctttggctggacgtcttctgtct仁gttgtgctgacccaccaaaacgctggttgaagtctaagagaatgcgctgaaact246125212581270127612S21288129413001ttcaccttccactgc仁t仁gggtcstggatg2641tgtttcgctgEcoRVacgctGATATCtgtaccttgttgaattggtcaagcacaagatt仁cgctgctttcgttgaatccgaaaaggaagtgttgtasagaaggtaagaagtt:ggtcgctgcttccc...........rHA合成基因......aggctgatgasttgaaggctBsu36Iaagc仁gCCTTAGGcttaggtBspE工Kpn工ggttctagtggt丁CCGGAggttctggtGGTACCggtggttHind工工工aatAAGCTTaattcttatgatttatgatttttattattaaataagttataaaaaaaataagtgtatacaaattttaaagtgactcttaggttttaaaacgaaaattcttattcttgagtaactctttcc仁gt:aggt:caggttgctttctcagg仁atagcatgaggtcgctc仁tattgaccagcaaatgcctgcaaatcgctccccatttcacccaattgttgagttga仁gaatctcggtgtgtattttatgtcctcagagSphlacacctctaccgGCATGCcgagatatgctaactccagcasgacaacacctgttgtaatcg30S1ttc仁tccacacggatcGCGGCCGC可将编码多肽的DNA插入BglII和BamHI位点之间以表达N-末端白蛋白融合蛋白，或者插入单一的BspEI和Kpnl位点之间以表达C-末端白蛋白融合蛋白，或者插入两种位点对之间以制备联合N-和C-末端白蛋白融合蛋白。通过使用本文所述的BglII-BamHIDPI-14cDNA和BamHI-HindlllDX-890cDNA可最筒单地例证这点。通过将这些cDNAs连接进合适的位点，可构建具有下列DNA序列的DPI-14-(GGS)4GG-rHA-(GGS)4GG-DX-890融合蛋白。Not工1GCGGCCGCccgtaatgcggtatcgtgaaagcgaaaaaaaaactaacagtagataagacag"atagacagatagagatgqacgagaaacagggggggagaaaagg3gaaaagagaaggaaag1213014214B1721csctagggacgaaagagctttaagaggcttstgeacttatetttaaaegetgttgaasaaccatatgttacetategcagacaagcgctcggtgcaatgggtttgaacactgcccggggtcteegggttaggtcccgttatcaccgttagcagtgccaattcegggaggagcagagtagcaggctcagtaaattggagttcsacgcttgsctgcacccgscgggcttteggtgccactgcaGCGCCtccaaatagcacagtagatcaggtcggctgggsaactttggaaatgtggct亡atcccaccatccgactgccggctgctcgcctttacgaggtcacag匕gtgataatgtgcctactttaggtgactacgccsggsctccaattsgc781Hind工工IttcatcgccaataaaaaaacAAGCTTaacctaattctsscssgesssgatgaagtgggttBgl工工841t;tcatcgtctccattctgttct仁gttctcctctgct仁actctAGATCTttgga仁aagaga>.......................融合蛋白前导序列........................9019S11021gaagctgttagagasgtttgttctgascaagctgaaactggtccatgtattgetttctte>>DPI—14达碱基1060:ccasgatggtacttcgatgttactgaaggtaagtgcgcgcca仁tcttctacggtggttgtggtggtaacagasacaacttcgatactgaagaatactgtatggctgtttgtggttctg匚t>............................DP工-14............................>:>10B11141120113211S2117411S0120412101216122212341252125B12"1ggtGGATCCggtggttccggtggttctggtggt仁ccggtggtgacgctcacaagtccgaa》................GS接—头.................>1》...rHA合成基因'Age工gtcgctcACCGGTtcaaggacctaggtgaggaaaacttcaaggctttggtcttgatcgct>rHA合成基因连续到碱基2877..............ttcgctcaatcacaccttgtatggctgac仁gacgacaaccgaatgttgtcgacgaaggtaggtgaaagaggaattcgctgcaeggtgacttctcactgtagctgacttcgttgggtatgtcacgaatgttttgttggttaccatgtgctgsccccagtcttgtttctctgttcsccttccacttgcs3csctaagacttgtcggtgataagttgtgctaacaaacttgccacgctccsgaaagctgctgaaggc仁tcttcctttcaaggcaagtttctaatgttggaatgctatctcttc仁tgctgaagttcttgtacgactaagacctaaegctaaggtaaaactgtgatgggtaaggtsagattacttctgatagagtctttggsagtacgct:GATATstgtccsttctgttgctgacgttgtgtact:aagsttggttcttcttgaagattgttgttctaaggctgetcgctaagcaattgggctgCcgttggttacttgct:ga仁gaccaagttgaagtgaaaacgatggacgtttgttttcgatgaaattgttcgaagaaggtcccacggttctaaggtccgtcg仁tcaccaagtgtCTgtaccttggaagatcacggaatctgctggttgetsectgaaagasacgaagtscttgt仁tcgctaagstgtttgttgcagattgaagtgctagattgtg&cttgsctsagagctgac仁gaatgttgtggaastgccagaagaactacgagacacccagttcaagecatcaattgggtgcaagtctccatgttgtaagcttgaaccaattacg仁tccsstcaagttggttgagagaaacaatgtttcttttgacgtca仁aegaaattgegtgettecttctcaa^gsttaggfttcacactggctaagtaaaaagccat仁ctgacttgeectgaagctaaactactccgtgttgtgctgctgg.tcgaagaaatacsagttccccaact仁tacccagaagcct匕tggttaacasgtccttgctscggtga^gtgtactgcttgct仁tcaccccca_a_aggcttgaatgttgtg仁仁ggaaaagatctttggctggacgtc仁tctgtct仁gttgtgctgaccca_ggttgaagtcta^gsgaa_tggeaegssaagcsgssg3ccscgctgaaacttaagaagcaa<formula>formulaseeoriginaldocumentpage69</formula>但是由于前24个氨基酸构成本文所述的该融合蛋白的前导序列，因此分泌产物的氨基酸序列如下-1eaveevcseq51eycravcgsa101faqylqqcpf151vatlretyge201fhdweetflk251cllpkldelr301efaevsklvt351eccekpllek40]_lgmfla'eyar451fkp:lveep，501sri、;lgkvgsk551ctes:lvnrrpsoi丁alvelvkhk651aasqaalglg701cvlfpyggcqaetgpc工affggsggsggsgedhvklvnevmadccakqepkylye工arrhdegkassakqdltkvhteccshc工aevendrhpdyswllcckhpeakrmcfsa;levdetpkatkeqlkagsggsggsgggkignkfysekpjwyfdvteggsggdahksetefaktcvadernecfl/3hkpyfyapsl:lfrlkcaslqkfhgdllecaddempadlpslalrlaktyettqlgeykfqnapcasdylswyvpkefnaetvmddfaafvesggeacnlp工ecreycgvpkcapffyggcvahrfkdlgeesaencdkslddnpnlprla/fakrykaaftgerafkawavradlakyiceadfveskdvclekccaaadpllvrytkkvplnglcvlhekftfhadictlkcckaddketwgpc工affpgg舰则fdteewfkalvliahtlfgdklc了rp￡vdvmctaeccqaadkaaarlsqrfpkanqdsissklkKNTAEAKDVFhecyakvfdegvstptlvevtpvsdrvtkcsekerqikkqcfaeegkklvrwafdavkgk实施例23:DPI-14-(GGS、GG-HSA融合蛋白的氨基酸序列表33显示了DPI14通过含有(GGS)4GG的接头与HSA融合的氨基酸序列。使用本文所述的方法和载体可简单地构建编码给定序列的基因。DPI-14是HNE的有效抑制剂且与HAS的融合产生具有更长血清残留时间的分子。表1:来自GenBank登录号AAN17825的成熟HSA的氨基酸序列DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLOHKDDNP肌PRIjVRPEVDVMCTAFHDNEETFIjKKYLYE工ARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHC工AEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYKTTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQISICEIjFEQIjGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTAL/VELAAKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASRAALGL(SEQIDNO:1S)表2:DX-1000和DX-88的氨基酸序列DX-1000(SEQ工DNO:DX-88(SEQ工DNO:表5:N-末端Bg/II-B"mHIDPI-14cDNA的DNA序列TCTGCTGGTGGATCC(SEQIDNO:_)表6:C-末端"flmHI-/^"dnDPI-14cDNA的DNA序列表7:N-末端DPI-14-(GGS、GG-白蛋白融合蛋白编码区的DNA序列<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>表8:N-末端DPI-14-(GGS、GG-白蛋白融合蛋白的氨基酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>表9:C-末端白蛋白-(GGSXiGG-DPI-14融合蛋白编码区的DNA序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage74</formula>袅10:C-末端白蛋白-(GGSVGG-DPI-14融合蛋白的氨基酸序列謹KSEVAHRFKD1jGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFE;DHVKLVNEVTEFAKTCVADESAE1SICDK:SLHTLFGDKLCTVATTiRErYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAraDNEETFLKKYLYE工ARRHPYFYAPEliLiFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLIjPKLDELRDEGKASRADLAKY工CENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLiPSLAADFVESKDVCKNYAGNRNNFDTEEYCMAVCGSA(SEQIDNO:表11:C-末端BamHI-HindIIIDX-1000cDNA的DNA序列<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>表12:N隱末端Sg/II-^amHIDX-8卯cDNA的DNA序列<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>表13:C-末端五w"HI-历mflnDX-890cDNA的DNA序列<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>表14:N-末端DX-890-(GGS、GG-白蛋白融合蛋白编码区的DNA序列<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>表15:N-末端DX-890-(GGSVnrT-白备白融合蛋白的氨基酸序列EC3KKLVAASQAALGL(SEQIDNO:表16:C-末端白蛋白-(GGS、GG-DX-890融合蛋白编码区的DNA序列TOCTCA/TCGGTTTAAAGATTTGGGA口AAGAAAATTTCAAAGCCTTGGTGTTGATTGCCTTTGCTCAGTATCTTCAGCAGTMATTAGTGATGXATTTGCAAAAACATG丁GTTGCTGATGAGTCAGCTGAAAATTGTGACAAATCACTTCAXACCCTTTTTGGAGACAAAT丁ATGCACAGTTGCAACTCTTCGTGAAACCTATCGTGAAATGGCTGACTGCTGTGCAAAACGAGAAATGAATGCTTCTTGCTGACAACCCAAACCTCCCCCACCvGAGGTTGCACTGCTTTTCATGAGAATTTTTOAAAAAATACTTATA丁GAAATTGCCAGAAGACATCCTTACTTT丁A丁GCCCCGGAACTCCTTTTCTTTCCTAAAAGGCTTTTACAGAATGTTGCCAAGCTGCTGATAAAGCTCCCTGCCTGTTGCCAAAGCTCGATCAACTTCGGGATGAAGGGAAGGCTTCGTCTCCCAAACAGAGGCCAGTCTCCTTCAAAGCA丁GGGCAG丁AGCTCGCCTGAGCGTTTGCAGAAGT丁TCCAAGTTAGTGACAGAGTCCACACGGAATCCTGCCATGGAGATCTGCTTGAATCTGCTCATGACAGGGCGGACCTTGCCAAGTA丁ATCAAGMTCGA丁CTCCAGTAATGCTGTGAAAAACCTCTGTTCGAAAAA丁CCCACTGCATTGCCGAAGTGGAAAATGATGAGA丁GCCTGCTCATTAGCTGGATGTTTGCAAAAACTATGCTGAGG'CAAAGGATGTCTTCCTGGGCAtGTTTTTGTATGAATATGCAAGAAGGCATCCTGATTACTCTGTCGTGCTGCTGCTGAGACTTGCC:AAGACATATGAAACCACTCTAGAGAAGTG.CTGTGCCGCTGCAGATCCTCATGAATGCTATGCCAAAGTGTTCGATGAATTTAAACCTCTT,GTGGVM3AGCCTCAGAATTTAATCAAACAAAATTGTGAGCTTTTTGAGCAGCTTGGAGAGTACAAATTCCAGAATGCGCTATTAGTTCGTTACACCAAGAAAGTACCCCAAGTGTCAACTCCAACTCTTGTAGAGGTCTCAAGAAACCTAGGAAAAGTGGGCAGCAAATGTTGTAAACATCCTGAAGCAAAAAGAATGCCCTGTGCAGAAgactatctatccgtggtcctgaaccagttatgtgtgttgcatgagaaam:GCCAGTAAGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACAGAATCCTTGGTGAACAGGCGACCATGCTTTTCAGCTCTGGAAGTCGATGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTTAATGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGATATATGCACACTTTCTGAGAAGGAGAGACAAATCAAGAAACAAACTGCACTTGTTGAGCTCGTGAAACACAAGCCCAAGGCAACAAAAGAGCAACTGAAAGCTGTTATGGATGATTTCGCAGCTTTTGTAGAGAAGTGCTGCAAGGCTGACGATAAGGAGACCTGCTTTGCCGAGGAGGGTAAAAAACTTGTTGCTGCAAGTCAAGCTGCCTTAGGCTTAGGTGGTTCTGGTGGTTCCGGTGGTTCTGGTGGATCCGGTGGTGAAGCCTGTAACTTGCCAATTGTTAGAGGTCCATGTATTGC丁TTCTTCCCAAGATGGGCTTTCGATGCTGTTAAGGGTAAGTGTGTTTTGTTCCCATATGGTGGTTGTCAAGGTAACGGTAACAAGTTCTACTCTGAAAAGGAATGTAGAGAATACTGTGGTGTTCCA(SEQID'NO:)表17:C-末端白蛋白-(GGSVGG-DX-890融^茶白的氨泉酸序列DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATIiRETYGEMADCCAKQEPERNECFL<QHKDDNP肌PRUVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYE工ARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASIiQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEE7VEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADliAKYICENGDSISSKLKECCEKPliEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKP1>VEEPQNLIKQNCELFEQIjGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCABDYIiSWLNQIvCVXHEKTPVSDRVTKCCTESLVWHRPCFSALEVDETYVPKEFMAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGSGGSGGSGGSGGEACNLPIVRGPCIAFFPIWAFDAVKGKCVLFPYGGCQGNGNKFYSEKECREYC(SEQIDNO:_)表18:N-末端Bg/II-丑amfflDX-88cDNA的DNA序列<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>袅19:N-末端DX-88-(GGShGG-白蛋白融合蛋白编码区的DNA序列GAAGCTATGCACTCTTTCTCTGCTTTCAAGGCTGACGACGGTCCGTGCAGAGCTGCTCACCCAAGATGGT丁CTTCAACATCTTCACGCGACAATGCGAGGAGTTCATCTACGGTGGTTGTGAGGGTAACCAAAACAGATTCGAGTCTCTAGAGGAGTGTAAGAAGATGTCTACTAGAGACGGT(SEQIDNO:_)表20:DX-88::HSA的氨基酸序列eamhsfcafkaddgpcraahpr^ffniftrqceefiyggcegngnrfes:lEECKKMCTRDGGSGGSGGSGGSGGDAHKSEVAHRFKDLiGEENFKALA/IilAFAQYIjQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSIjHT1jFGDKLC丁VA1TjRETYGEMADCCAKQEPERNECFI^HKDDMPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFIjKKYLYEIARRHPYFYAPEKLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACIjIjPKLDEIjRDEGKASSAKQRLKCASIjGKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEE7VEVSKLVTDIjTKVHTECChgdjl;lecaddRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPI/LEKSHC工AEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLiLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLi工KQNCELFEQIjGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNL/3KVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYXSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCctes:lvnrrpcfsalevdetyvpkefnaetftfhadicti;sekerqikkqTALTVELVKHKPKATKEH(SEQIDNO:表21:C-末端BamHI-HindlllDX-88cDNA的DNA序列GGATCCGGTGGTGAAGCTATGCACTCTTTCTGTGCTTTCAAGGCTGACGACGGTCCGTGCAGAGCTGCTCACCCAAGATGGTTCTTCAACATCTTCACGCGACAATGCGAGGAGTTCATCTACGGTGGTTGTGAGGGTAACCAAAACAGATTCGAGTCTCTAGAGTGTAAGATGTGTACTAGAGACTAATAAGCTT(SEQIDNO:_〉表22:HSA::〖GGS)4rTrT::Dy-WgatgcaCSCagt3aggttgetcateggtttgat仁tggaagsst仁cgcc仁tggtgttg3仁tgcctttgett3tct仁cagcagtgttttcatgtasssttagtaacttttgcaa^aatgtgttgetgatgaggetsattgtgactC￡Lcttcatc仁ttttggagac仁tstgc3ca_gttgcaisetcttcgttatggtstggetgact:gctgtgescctg巧sa±ga^tgcttcttgcasetcccccg^Lttggtgagaccagsggttgatatgtgcactgettttgacgaagagtttttg仁5LCttsgaasttgccagacatcctttttatgccccggaaetccttttctttgetW3&ggtata^ELgetgettttgastgttgcgc仁getgatgetgcctgcc仁g仁tgaagetcgatgaacttegggatgaagggsaggc仁tegtctgrccasscagetcsag亡gtgccagtetctttggagaaagagetttcgcatgggesgtagetcgcctgagecagagatttcccgetgagtttgcagssgtttecsaggtggatcttseegtcacggaa仁gctgcest，gatctgcttgaatgtgetg红gacagggcggaccttgccaagt己tatetgtaatCMgattegatetecctggaatgctgtcctttgtectgcsttgccgs3gtgsstgatgagcctgc仁gacttgteattsgetgetga^tttt3ttagtgatgtttgctdtgetgsggesgatgtcctgtttta^tgsa仁&tgesagaaggcc仁gsttct狗ctgctgctgagacttgccaaggsa_deca_ctetag巧tgctgtgccgetgcagatcctesttgct3tgccttcgaitgastttcctcttgtggagcctcagttsELtCtgtgagctttttgagcagct仁仁scttccsg33仁cta_tt3gttcgttscdCCaagcccgtgactactcttg仁agaggtcteaagsggagtgggcagetgttgtestcctgaagc，atgccct9tgaatatCt3tecgtggtcctgcagtt3tg仁gtg"gC3t333acgccaiagtagagtc3CCtgctgctecttggtgaggcgatgctttteagetctggaagtcgattscgttccctttgetttcsecttcgcagattgcctttctgagateaagactgcacttgttgagetcgtgC3C.cccaaggcagagC33ctggetgttatggstgatt匕cgcagettttgtagagsagtgctgcaaggetgacgataaggagtgctttgccgaggagsascttgttgetgc3agtgetgccttsggcggtgg仁tctggtggttec.ggtggttctggtggatecggtggtGAAGCTATGCACTCTTTCTGTGCTTTCAAGGCTGACGACGGTCCGTGCAGAGCTGCTCACCCAAGATGGTTCTTCAACATCTTCACGCGACAATGCGAGGAGTTCATCTACGGTGGTTGTGAGGGTAACCAAAACAGATTCGAGTCTCTAGAGGAGTGTAAGAAGATGTGTACTAGAGAC(SEQ工DNO:一表23:表22中编码的成熟蛋白质的氨基酸序列DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVL工AFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLiQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDE!jRDEGKASSAKQRIiKCASIjQKFGERAFKAWAVARIiSQRFPKAEFAEVSKLVTDIuTKVHTECCHGDLLECADDRAI)LAKY工CENQDS工SSKLKECCEKPLIjEKSHC工AEVENDEMPADIiPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLiYEYARRHPDYSWlaLLRLAKTYETTIuEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQ肌IKQNCEIaFEQLGEYKFQNALAVRYTKKVPQVSTPTLiVEVSRNU3KVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC丁ESl;VNRRPCFSALEVDETYVPKEF船ETFTFHADICTIjSEKERQIKKQTAIiVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAAS。AAIiGLGGSGGSGGSGGSGGEAMHSFCAFKADDGPCRAAHPRWFFNIFTRQCEEFIYGGCEGNQNRFESLEECKKMCTRJD(SEQ.IDNO:_)具有2xGS接头的pDB2300Xl的Notl序列盒j--1GCGGCCGCccgtaatgcggtatcgtgaaagcgaaaaaaaaactaacagtagataagacag!Notl.，..Slatagacagatagagatggacgagaaac:agggggggagaaaaggggaaaagagaaggaaag;121aaagactcatctatcgcagataagacaatcssccctcstGGCGCCtccasccaccatccgINarl,..181cactagggaccaAGCGCTcgcaccgttagcAfe工.-actGCCGGCtNgoM工V241301361421gsaagagc仁ttaagaggc仁tggacacatstgtgcaatgggtttgaacactaccaatagttttgccaagacgcattgcaccttttttaaaCcgacaaatcataxactctatTGCACccgacgaatacgtctgccactaactatagcacagtagatcaggtcBsgl.gctcgcctttacgaggtcactg仁gcctsct4B1atgcacttatgcccggggtcccgggaggagaaaaaacgagggctgggaaatgtccgtgga541ctttaaacgctccgggttagcagagtaGCAgggcttTCGgctttggaaatttaggtgactBcgl.........6D1tgttgaaaaagcaaaatttgggctcagtaatgCCActgcagTGGcttatcacgccaggacBstX工........6￡ILtgcgggagtggcgggggcaaacacacccgcgataaagagcgcgatgaatataaaaggggg721ccsatgttacgtcccgttatattggagttcttcccatacaaaCTTAAGagtccaattageAflII.781ttcatcgccaataaaaaaacAAGCTTaacctaattctaacaagcaaagHindI工I(1/2)12345678101112131415MKWVFIVSIFLiFSsatgtgggttttcateg仁Ctecatttt3ttcttgttc仁CCtct1618192021222324252S27282930ASRSDKRGGSGGSgettsctctAGATCTgstaagagaggtGGAggttecBamHI..31323334353S3738394041."4345GGSGGSGGDAHKSEVggtggttcttec的tggtgacgetCSCtecgaagtc"4748495051525354555S575859soAHRFKI;.GEEFKASS4getcACCGGTtcCTAGGtgaggaattcaagget:ttgAgeI.Avrl.100910S411441189123412"1324SIVgtc7SDgatS2S3Ii工ttgate7778HVCACGTCSIc1Q6TSlCC121T136Raga151PCSLCVgtt107122Ytac137N152agaDgac$3Aget108F123妙13SE153ttgS4AgetKG124gaa!39ctgt154Vgtt169Egaa65Fttc80Xi仁tg110gat125MatgFttc155Raga170Egaa56Aget81Vgtc;6Stct111Kaag12SAget141ttg15SPccs171Tetcc678297AgetU2Lttg127Dgac142Q157Egaa1726B83Egaa6984Vg仁仁98E113Ctgt128CHC3C1S8Vg匕t173!ttg5>SsacTact123Ctgt1"K159174sag70QT3CC100cVgtt130Aget:U5Dgac160Vgtc17571QEgas101Dg&clisget131Kaag1S1Matg176Y72Ctgt87仁仁c102KsisigT132Q147162Ctgt177IiTtg73P8BAgc仁103stecttg1"Egaa148Pset1787475FEttcgaa8S30KTaagact10410SIiH119120agagaaPEccagaa143150sacttg164165AFgetttc179180E工Seal.1414150415431594181Aget19SAget211Egaa241Iittg256Raga182R197Ksag212aag227Gggt242Q2S7ttg1B3aga1S8RAget228K243Kaag258Stct:iS4HC3C19SYtac214Aget229Aget2"Fttc25SQ185PCC3200Ksag215Ctgt230Stct245Gggt2S0R185Ytac201Aget216ttg231stec245E2S1B*ttc187ttc202Aget21*7ttg232Agc仁247Rags262P188Yt3C203Fttc218PCCSL233Kssg248Aget2S3189A^Ct204T21SKaag234Qess243Fttc264Aget190PCCSL205Ega_a220tts23Saga250KE191Egaa_20SCtgt221Dgat23Sttg251Aget26SPttcIittg207Ctgt222Eg&a237Kaag252W267Aget193ttg208Q223ttg238CtstAget268Egas194195FFttcttc209210AAgetget22422SRDagagac235240gettec2S425SVAgtcget270gt仁tc仁271272273274275276277278279280281282283284285KLVTDLTKVHTECCHttg3Ctgac2862872BB290231GDliECggtgscttgttggaatgt30130230330430530Syiceq1729taca_tctgtgaa316317318319320321CCEKP1774tgttgtgaaasgttg331332333334335336VENDEM1819gttgaagatgaaatg34734S343350351DFVESKgacttcsttgaatct3613623S33653"KDVFG1909gtcttc仁tg!376377378379380381HPDYSVC3Cgact￡LC仁ccgtt39139339SYETTE1999tacgaasetttggaa40S40740B409410"1ECYAKgaatgttSLCgetgtt421422423424425426EPQN工2089gaatTGATCBell..I437438439440441ILGEYKF2134ttgggtgaatacasgttc!451452453454455456IKKVPQV2179aagaaggtcccacaagtc4""74。470471RN1/GKV2224AGAaacttgggtaaggtc4814824B34844S5486A3CRMPC2269getaagaGAATGCcatgtactaaggtt'cacactgaatgttgtcac29229329429529729B299300getgatgacagagetgacttggetaag307308309310311312313314315DS工SSKLKEgac仁ctatCTCTTCcaagttgaaggaaEarl....32232332432532S327329330IiEKSHCIAEttggaaaagtctcactgtattgetgaa337338339340341342343344345cCAGCTGacttgccatctttggetget3523533543553563573583593S0DVCKNYAEAgacgtttgtaagaactacgetgaaget368369370371372373374375MFLiYEYARRatg,ttcttgtacgaatacgetagsaga38238338438538S387388389390gtcttgttgttgagattggetaagacc"735B399400401402403404405KCCAAADPHaagtgttgtgetgc仁getgacccacac412413414415416417418420FDEFKPIjVEttcgatgaat仁caagccattggtcgaa427428429430431432433434435KQNCEIjFEQAagcaaaactgtgaattgttcgaacaa442"3444"5"644*7448449450ona;llvrytcaaaacgetttgttggttagatacact4574SB459460461"24。4S4465STPTLVEVStCCAccccaacttTGGttgaagtcTCTXcm工................472473474475476477478479480GSKCCKHPEggttctaagtgtt;gtaagcacccagaa4874884894904514924934S4495AEDYIiSVVIigetgaagattact仁gtecg仁cg仁仁ttg,Bsm工...，06"749950D5(US02S035D4S055065075D8509510.NQIjCVIjHEKTPVSDR2314aaccaattgtgtgttttgcacgaaaaGACcccaGTCtctgatagaPshAI........AlwNl.......511512513514S15516S17S1851S520521522523524525VTKCCTESRPC2359gtCACCTOttgtsetgaatctGTTAACCC3tgtHpa工..52752852￡)530531532533S34535537S38540SLiEVDETYVPKEF24CMttctctgetttgGTCGACgaaacttscSttsagGAATTCSail,,.5415425435"5455"54*754B5495505S155255355SNAETFTFHADICTS2449a_scgetgaaact:ttcttcgetATCtgtsectec55655755B5S2S635"5S55S65SBEKEIKKQrAVE2494gaa_aaggaaagacsaa±tsagaagactgetttggttgaa匕tg571572573574575S775785795B0581SB2583SB45B5VKHKPKTKEQKVgtcaagCCSaaggetactsaggaaaaggetgtc5已65875BB592533594S98MnDFAAFVEKCCKA2584acggatgs仁ttcgetgc仁ttcgttgaatgtaaggetSOUSD360460S60760S612DKETCFAEEGKKI;VA2629gatacttgtgetgsagaaggtasgssgttggc仁SIBS19S23626S27628SQAG!GGSGGsG2674gettecgetgecttaggttctggttec妙'631632S33。S637S38GSGGsG(3T2719ggtTCCGGAggttecggtGGTACCtS3GCTTasttcttBspEI.Kpn工...终止子终止子Hind工I工(2/2)tttatgatttttattattaaataagTTMAAaaaaaataagtGTMACaaattttaaagtPsi工.，.BstZ17工2824gactcttaggttttaaaacgaaaattcttattcttgagtaaptctt匕cctgtaggtcaggttgetttetcaggtatagcatgaggtcgetct仁attgaccacacctctaccgGCATGCcg'Sph工..294430043064t仁c仁tccacatgc&aatcgccggatCGCGGtccccafttcCCGCacccaattgtsgatatgetaac仁cca9c3agtcctcagaggacaacacctgttgtaatcg(SEQ.IDNO..-表26:具有DX890〖N末端)和第二个DX890备用的C末端接头的pDB2300X2的Notl序列盒SIGCGGCC3CccgtaatgcggtNot工，…atagacagatagagatggacaaagactcatctatcgcagaafccgtgasagcgaassaaasactaacsgtsgatsagacaggagaaacagggggggagaaaagg的aaaagagaaggaaagtaagacaatcaaccctcatGGCGCCtccaaccaccatccgNar工..、241301361421cactagggaccaAGCGCTcgAfe工-.gaaagagcttgtgcaatgggtaagaggctttttgaacactggacacatataccaatagtta仁aaaaaattttgccaagaccaccgttagcaacgcttgactcaca_aaccaagtgccaattgcattgcaccttttttaaaCcaaaggagcctatsctctatTGCACccgacatagcacagtagatcaggtcactGCCGGCtNgoMIVgctcgcctttacgagg仁cacagtgtgataatg匕gcctactBsg工..481atgcact仁atgcccggggtcccgggaggagaaaaaacgagggctggga逸atgtccgtgga541ctttaaacgctccgggttagcagagtaGCAgggcttTCGgct仁tggaaatttaggtgactBcg工.........SOItgCtgaaaaagcaaaatttgggctcagtaatgCCActgcagTGGcttatcacgccaggacBstX工........PSt工--.661tgcgggagtggcgggggcaaacacaccc:gcgataaagagcgcgatgaatataaaaggggg721ccaatgttacgtcccgttatattggagttcttcccatacaaaCTTAAGagtccaattagcAfl工I.781ttcatcgccaataaaaaaacAAGCTTaacetaattctaacaagcaaag!UndI工I(1/2)Signalsequence--------------------------------------------12345S78S101112131415MKWVF工VS工IjFLFSS829atgsagtgggttttcategtctecattttgttcttgttctectctSignalsequence------------------->----------------1617IS1520212223242S26272S2930AYSRSIaDKREACNLP874gettactctAGATCTttggataagagagaagectgtaacttgccaXba工，-,(1/2)continued--------------------------------------------313233"3536373B334041*4243"4S.IVRGPC工AFFPRWAFattgttagaggtccatgtattgetttcttcccaagatggget仁tcDX890continued---------------------'---------------二-------"474849505152535556575859SODAVKGKCVIjFPYGGC964gatgetgttaagggtaagtgtgttttgttcCCAtatggTGGttgtPf1MI.........Nde工.…continued--------------------------------------------SI6263"6567S370717273747SQGNGNKFYSEKECRE1009caaggt貼cggtaacaagttctactctgaaaaggaatgtagagaacontinued--->Liinker--------------------------------7S777379BOBl82838485BS878889$0YCGVPGGSGGSGGSG1054tactgtggtgttccaggtGGATCCggtggttecggtggttctggtBamHI..Linker------->rHA-------------->3192333495S7S893GSGGDAHKSggttecggtggtgacgetcacaagtectoresidue100101102103104105evahkfgaagtcgetcACCGGTtcAgel...10S107109110111112113工工4KDIjGEENFK1144aaggaCCTAGGtgaggaaaacttcaagAvr工工.12112212312412512612712812911B9ttcgetcaatacttgcaacaatg匕cca115116u7118119120AIivIi工Agetttggtct仁gateget130131132133134135FEDHVKttcgaagatCACGTCaagBmgB工*-13613713813914014114214314414514s147:ub149150vevtefaictCvad1234ttggtcga3gttSLCCttcgetsettgtgttgetgac1511521531541551561571581601611S21S4165ESAENCKSHTFG1279gaatctgetgaatg匕gacsagtecttgc3csecttgttcggt1s616716b1631701*71172173174175176177178179180DKCTVATETYGE1324gataagttgtgtgttget3CCttgrgss3CCtacggtgaa181182184185186187188189iso131192193134195MADCCAKQEPEEC1369atggetgactgttgtgetsagc&sgasCCSgaaag这gaatg仁1961"1982002012022032042052ds20720b209210QHKDDNPNPRv1414ttcttgCSCgacgacCC3ttgCC3ttSgt仁21121221321421521S217218219220221222223224225RPEVDVMCTAFHDNEsgaCC3gaagttgscgtcstgtgtgetttcC3Cgacgas22622722B22923023123223323423523623723B240etfkky工arh1504gaattc匕tgaagaAGTtgtacgaaattgetagaC3C<table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table>2179222422694S1452453IiEKttggaaasg4S64S7468KVF3sggttttc4814B24B3Ij工ktTGATCAagBell…，454CtgtDgatQ455C470E485N33CAget471FttcCtgt4S7Aget472Ksag487Egaa458Aget473PCC34B8ttg459'"O4S1DPHgeicccacac47447S476IiVEttggtcgaa4B9490491FEQttcgaacaa4S24S3464ECYgaatgttac477478479EPQgaaccsch￡l492493494IiGEttgggtgaa4S5Aget480495tac2314235949S497KFaagttcQv43BQ513Stec4"514TAcc500Aget515P501ttg516Tact502ttg517503Vgtt518VGtt504REgaaXcml,50SYTtacact520521gtcTCTXba工507508503KKVaagasggtcS22523524AGAaacttg(2/2》S10P525Gggt240452S527KVsaggtc528Gggt529stct530K531C532Ctgt533Ksi3g534H53S536PEccagaa53753B539AKRgetaagaGAS40MBsml,2449Bsm工541542543544S45S4S547548549550551552553554555Ccatgtgetgaagattacttgtecgtcgttttgaaccaattg匕gt249455S557VLgttttg558HC3C555Egaa560KaaG561TACc5S2PCC3563VGTC564Stct565566DRgataga567568569570VTKCgtCACcaaGTGtDra工工I......25392584571572CTtgtactS8S587gaaGTC573Sga_a588GAC574Stct589gaa575S76577LVNttgGTTAACHpa工...590T3Ct591592tscgtt5785S3P579RagaKaag580581PCccatgt595596EFgaattc582ttc5975白3Stct5S8get584get599E585lattgS00actSail.2S29601S02FTttC3CCS03FttcS04Hesc605AgetSOSS07DIGATATCEcoRV,.608C609T￡lccS10SllIjSttgtecS12E613KaagS14EgaaS15aga26742719S17QIcaaat仁631532PKccaS18KaagAgetS19K634Tset620QcatsKaag621622TAactget。6EQS23ttg。Sttg624VgttKaagS2SEIigaattgAVgetgtc527VgtcMatgS28KDgatHC3CDgatS30KaagFttc<image>imageseeoriginaldocumentpage91</image>!BsgIct;gcac1450!Bcg工gcaxmnnrmtcg1_5'68!Bara:iGRGCYc1620!PBt工CTGCAg1!Afl工工Ct仁aag1763!Hind工工工Aagctt2801!BglHAgatct594固e工CAtatg1995!BamH工Ggatcc11072$!AgeIAccggt11136iAvr工工Cctagg11149!BmgB;rCACgtc11225$11520iEar工CTCTTCNnim11923IPvu工工CAGctg12006!Bcl工Tgs仁ca12270$12366!Bsm工GAATGCN12444!PshA工GACNNnngtc1250812513125291Hpa工GTTaac125541Sal工Gtcgac12587JEcoRVGATatc12"41Bsu36工CCtnagg128S5!BspEITccgga12890!P:flFIGACNnngtc129B0!TthlllIGACNmigtc129801Acc65工Ggtacc13cm!KprilGGTACC:i3091(Ps丄工TTiV-—￡Si3143i!SpillGCATCci32903101G7GGCCGCccNot::....gtsatgcggtatcgtgaasgcgsaaaaaaasctaacagtsgstsagscagatagacagstagagatggacgagaaacagggggggagaaaaggggaaaagagaaggaaag121aaagsctcatctatcgcagataagacaatcaaccctcatGGCGCCtccaaccaccatccgNarl>..181cactagggaccaAGCGCTcgcaccgttagcaacgcttgactcacaaaccaactGCCGGCtAfe工..WgoMIV2413C14214815"g:sasgagcttggacacatatctttaaacgcgtgcastgggtttgaacactaccsatsgttttgccssgaccaaaggsgfcctatsctctatTGCACccgacBsg工gaatacgtct:agatcaggtcgctcgccttttgtgcctactgcccggggtcccgggaggagaaaasacgagggctgggasstgtccgtggatccgggttagcagagtaGCAs的cttTCGgctttggaaatttaggtgactBcg工.........，601tgttgaaaaagcaaaa仁t仁gggctcag仁aatgCCActgcagTGGcttatcacgccaggacBstX工........PSt工..，661tgcgggagtggcgggggcsaacacacccgcgataasgagcgcgatgaatataassggggg721ccaatgttacgtcccgttatattggagttcttcccatscaaaCTTAAGagtccssttagc'Afm."7B1ttcatcgccaataaaaaaacAAGCTTaacctaattctaacaagcaaagHind工工I(1/2)一丁"123457B1011121314ISMKWVF工VS工FLFSStgggttttca_tcgtctecttgttcttgttctectct:信号序列]ei^e>第.一种情况161718IS2021222324252627282530ASRSIiDKREACPgettctAGATCTttggstgectgtBgll工，.3132333435373839404142434445工VRGPCIFFRWF5"gt仁sgaggtCC3tg仁sttgetttc仁tcaga仁gggetttc47484950525354555S575已59SOAVKGKCV1;.FP*YGGc9"gatgc仁gtt的tsagtS匕gt匕ttcCCAGGttg仁速,SI6263"65S667S869707172737475GGNGNKFYSEKECREcaaggtaacggtaacasgttc匕actctgaaaaggsatgtsgagas!---接头_>151929394!GSGGggttecggtggt10S107108109KDLG11"saggaCCTAGGtAvr工:i:.,.121122123124FA<2Y1185ttcgetcastac13613713B139:lvnE1234ttggtcsacgaa151152153154ESAE12"gaatctgetgas1661S7168165DKLC….......…rHA基因959S37SB100DAHKSEgacgetcacaagtecgaa11D111112113114115EENFKAgaggaaaacttcaagget12512S12712B129130:lqqcpfttgcaacastgtccattc140141142143144145V丁EFAKgttaccgaa仁tcgetaag155156157158155ISONCDKSLaactgtgacaagtecttg170171172173174175TVATLR直到密码子.679101102103104ICSVAHRFgtcgetCACCGGTtcIIS117118119120viattgg仁cttgget131132133.134EDHVgasgatgtcaag14714B149ISOtcvadaxt.tststtgetg&c1611"1S5HTIjFCSCsecttgt:tc，17S177ETyGE767778798081828384b587888SYCGVPGGSGGSGGSL0S4tactgtggtgttccaggtGGATCCggtggttecggtggttct:BamHI..9-G9<formula>formulaseeoriginaldocumentpage94</formula>2044406Stct407Ksag408Dgac409Vgtt410Ctgt411K412413414get415Egsa416Aget417Kssg418Dgac419Vgtc420Fttc20B9421ttg422Gggt423Matg424Ftt:c425LttgYtsc427EYt￡LCAget43DRagaRsga432Hcac433PCC￡L434Dgac435tsc2134"6Stec437Vgtt438Vgtc439ttgI*ttg441Littg442Ragattg444Aget"5K446T3CC447Yt3C448EgssTact450T217S451ttg452Egaa453K454Ctgt455Ctgt456Aget457Aget458Aget459DgacPCCS4s:1H4S2EgaaCtgt464YtacAget2224KaagVgtt4￡BFttc469Dgat470EgasFttc472Kssg473P474ttg47SVgtc47SE477Egaa478PCC3479Q480481ttg4823tC4B3K4844854BSCtgt487Egsaitittg489Fttc490Egaa432ttg4S3Ggg仁494Egaa495tax2314KFttc498Qcaa499500Aget501ttg502ttg503Vgtt504Rsgs505YtscSOSTact507Kaag50Baag509Vgtc510Pcca_511512VgtcS3_3Stec514T515pCCS516Tset517ttg518Vgtt519Egss520Vgtc521Stct522RagaN524ttg525Gggt2404Ka_3g527VgtcS28Gggt529StctKaag531Ctgt532CtgtKaag534HC3C535PccaEgas537Aget538KaagR540atg2449541PCC3542Ctgt543Aget544E545DgatYtsc547Iittg548Stec549VgtcS50Vgtt5S1tt95525S3Q554ttg555Ctgt2494556Vgtt557t仁g5S8Hcac559EgaaKaagTa_cc562PCC3S63VgtcStctDgat56SagaVgtcTsec569Kaag570Ctgt2539571Ctgt572T3Ct573Egaa574Stct575ttg57SVgtt577MS78R579Raga580PCC3581Ctgt582FttcS83Stct584AgetS65Littg2S8458SEg&s5B7Vgtc588DgacSB9Egas590TElCt591Ytac592V593CCS594Kaa_g5"EgEL3Fttc5S7Msac538Agc仁593EgasSOOTSC仁601Ftt:c602T3CC603Fttc604H605getSOSDgat607axeS08Ctg仁609Tsec610ttgSllStec.612EKaag"4EgaaS15Raga2574SISQ617KaagKa巧620Q621Tac仁622Aget623ttg624Vgt匕625ES2Sttg€27Vgtc628KHC5LC630K271327"280S28542855294430343079311白631"2633<S34S35。6。7638639'640641S42643"4645KATKEQKAVMDDFCC33sggetsetsaggasaaggetgtcatggstgatttc647S50651SS3654S57S58S60AAFVEKCCKADDKETgetgetttcgttgaa3叩tg仁tgtaaggetga_tgataagsetSSI6S3664"56"668663671S72673674675CFAEEGKKVAASQAtgtttcgetgaa_gasggtsa>gaagttggtcgetgettecget接头576677S78S79680681S82SB3SB468S68768S630ALrGGGSGGSGGSGGgecTTAGGCttsggtggttctgs仁tec柳ggtTCCGGA郇Bsu36工BspE工..DX-(第-二个编码区！)--—至结^>—S326936947007017027D3704705SGGSGGEACNPIVRsgtggt的ctecggtggtgagget仁gcsatcttCCtategtccgt70S707708709711712713714715716717718719720GPC工AFFPRWAFDAVggcccttgcgecttttttcctcgttgggectttgacgecgtc72172272372472572S7277287"730"1732733734735KGKCVLiFPYGGCQGggctgcg匕cC仁ttttcctggctgccagaat73673773873974174274374574774B749750GNKSEKEcREYcG仁ttt3t9巧9巧tgccgtgagtattgc751Vgtc752PcctGGTACCKpn工.-.taatAAGCTTa终止子终止子Hind工工I(2/2)attc仁tatgatttatgatttttattattaaataagTTM"AAaaaaaataagtGTATACaaattttasagtPsi工..，Bst217I31783238329B33563418gactcttaggttgetttetcageaaatgeetgagttga仁gttcttccacattttaaaacgaaaattcttaaggtatagcatgaggtcgettgeaastegetccccatttcaatctcggtgtgtattttatcggatCGCGGCCGCNotl......ttct仁gagtaactctttcctgtaggtcaggcttattgaccacacc匕ctaccgGCATGCcgSphl..acccsattgtagatatgetaactccagcaagtectcsgaggacaacacctgttgtaatcg(SEQ.IDNO:_J.129:DX890::(GGS)4GG::HA::(GGS)4GG::DX8卯的氨基酸序列EACNLPIVRGPC工AFFPRWAFDAVKGKCVLFPYGGCQGNGNKFYSEKECREYCGVPGGSGGSGGSGGSGGDAHKSEVAHRFKDLGEENFKA!LVIj工A阔Y<formula>formulaseeoriginaldocumentpage97</formula>表30:N-末端BglII-BamHlDX-1000cDNA的DNA序别<formula>formulaseeoriginaldocumentpage97</formula>表31:DXlOOO::(GGS)4GG::HA的氨基酸序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage97</formula>表32:N-末端BwEI-Kp"IDX-88cDNA-第二个编码区的DNA序列<table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table>权利要求1.一种白蛋白融合蛋白，它含有Kunitz结构域肽或其片断或变异体，和白蛋白，或其片断或变异体。2.根据权利要求1的白蛋白融合蛋白，其中该Kunitz结构域肽或其片断或变异体具有功能性活性。3.根据权利要求2的白蛋白融合蛋白，其中该功能性活性包含抑制丝氨酸蛋白酶。4.根据权利要求2的白蛋白融合蛋白，其中该功能性活性包含抑制纤溶酶。5.根据权利要求2的白蛋白融合蛋白，其中该功能性活性包含抑制人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶。6.根据权利要求2的白蛋白融合蛋白，其中该功能性活性包含抑制激肽释放酶。7.根据权利要求1的白蛋白融合蛋白，它含有DX-890或其片断或变异体和白蛋白或其片断或变异体。8.根据权利要求1的白蛋白融合蛋白，它含有DPI-14或其片断或变异体和白蛋白或其片断或变异体。9.根据权利要求1的白蛋白融合蛋白，它包含DX-88或其片断或变异体和白蛋白或其片断或变异体。10.根据权利要求1的白蛋白融合蛋白，它包含DX-1000或其片断或变异体和白蛋白或其片断或变异体。11.根据权利要求1的白蛋白融合蛋白，其中该白蛋白融合蛋白包含至少两个Kimitz结构域融合肽或其片断或变异体。12.根据权利要求11的白蛋白融合蛋白，其中至少两个Kunitz结构域融合肽或其片断或变异体分别具有功能性活性。13.根据权利要求12的白蛋白融合蛋白，其中至少两个Kunitz结构域融合肽之一的功能性活性包含抑制丝氨酸蛋白酶。14.根据权利要求12的白蛋白融合蛋白，其中至少两个Kunitz结构域融合肽之一的功能性活性包含抑制纤溶酶。15.根据权利要求12的白蛋白融合蛋白，其中至少两个Kunitz结构域融合肽之一的功能性活性包含抑制人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶。16.根据权利要求12的白蛋白融合蛋白，其中至少两个Kunitz结构域融合肽之一的功能性活性包含抑制激肽释放酶。17.根据权利要求11的白蛋白融合蛋白，其中至少两个Kunitz结构域肽或其片断或变异体具有不同的氨基酸序列。18.根据权利要求1的白蛋白融合蛋白，它包含选自由DX-890,DX-88，DX-1000,或DPI-14组成的组中的肽的至少一个片断或变异体和白蛋白或其片断或变异体，其中所述的白蛋白片断或变异体具有白蛋白活性且所述的肽片断或变异体具有功能性活性。19.根据权利要求1的白蛋白融合蛋白，其中所述的白蛋白活性具有与未融合状态的肽或其片断或变异体的体内半衰期相比延长选自由DX-890，DX-88，DX-IOOO，或DPI-14组成的组中的肽，或其片断或变异体的体内半衰期的能力。20.根据权利要求1的白蛋白融合蛋白，它还包含一个或多个额外的白蛋白半分子。21.根据权利要求1的白蛋白融合蛋白，其中该白蛋白融合蛋白包含选自由DX-890，DX-88,DX-IOOO，或DPI-14组成的组中的一个或多个半分子，或其片断或变异体，或一个或多个额外的白蛋白半分子。22.根据权利要求1的白蛋白融合蛋白，其中所述的融合蛋白还包含化学半分子。23.根据权利要求1的白蛋白融合蛋白，其中该Kunitz结构域肽，或其片断或变异体与白蛋白的N-末端或者与白蛋白的片断或变异体的N-末端融合。24.根据权利要求23的白蛋白融合蛋白，其中该Kunitz结构域肽含有DX-8卯，DPI-14,DX-88,或DX-IOOO。25.权利要求1的白蛋白融合蛋白，其中该Kunitz结构域肽或其片断或变异体，与白蛋白的C-末端，或白蛋白的片断或变异体的C-末端融合。26.根据权利要求24的白蛋白融合蛋白，其中该Kunitz结构域肽包含DX-890,DPI-14，DX-88，或DX-IOOO。27.根据权利要求1的白蛋白融合蛋白，其中所述的Kunitz结构域肽包含第一肽，或其片断或变异体，和第二肽，或其片断或变异体，且其中所述的肽，或其片断或变异体不同于所述的第二肽，或其片断或变异体。28.根据权利要求27的白蛋白融合蛋白，其中所述的第一肽，或其片断或变异体，和所述的第二肽，或其片断或变异体选自由DX-890,DX-88,DX-1000,或DPI-14组成的组中。29.根据权利要求1的白蛋白融合蛋白，其中该Kunitz结构域肽，或其片断或变异体通过接头与该白蛋白或白蛋白的片断或变异体分开。30.根据权利要求1的白蛋白融合蛋白，其中该白蛋白融合蛋白包含如下通式R2-R1;Rl-R2;R2-R1隱R2;R2-L-R1-L-R2;Rl-L-R2;R2-L-R1;或R1-L-R2画L-R1，其中Rl是选自由DX-890,DX-88,DX-1000,或DPI-14组成的组中的至少一个肽，或其片断或变异体，L是肽接头，R2是白蛋白。31.根据权利要求1的白蛋白融合蛋白，其中融合到白蛋白，或其片断或变异体上的该Kunitz结构域肽，或其片断或变异体的体外生物学活性比未融合状态的Kunitz结构域肽，或其片断或变异体的体外生物学活性更高。32.根据权利要求1的白蛋白融合蛋白，其中与白蛋白，或其片断或变异体融合的Kunitz结构域肽，或其片断或变异体的可溶性比处于相同贮存，处理或生理学条件下的未融合状态的Kunitz结构域肽，或其片断或变异体的可溶性更高。33.根据权利要求30的白蛋白融合蛋白，其中与白蛋白，或其片断或变异体融合的至少一个肽，或其片断或变异体的体内生物学活性比未融合状态的至少一个肽，或其片断或变异体的体内生物学活性更高。34.根据权利要求1的白蛋白融合蛋白，其中该白蛋白融合蛋白是非糖基化的。35.根据权利要求1的白蛋白融合蛋白，其中该白蛋白融合蛋白在酵母中表达。36.根据权利要求35的白蛋白融合蛋白，其中该酵母是糖基化缺陷型。37.根据权利要求36的白蛋白融合蛋白，其中该酵母是蛋白酶缺陷型。38.根据权利要求l的白蛋白融合蛋白，其中该白蛋白融合蛋白通过哺乳动物细胞表达。39.根据权利要求38的白蛋白融合蛋白，其中该白蛋白融合蛋白通过培养的哺乳动物细胞表达。40.—种组合物，它含有权利要求1-39任一项的白蛋白融合蛋白和药用上可接受的载体。41.一种治疗患者疾病或紊乱的方法，包含施用权利要求1的白蛋白融合蛋白的步骤。42.—种治疗患有可由DX-890和/或DPI-14调控的嚢性纤维化或嚢性纤维化相关性疾病或紊乱的患者的方法，包括施用有效量的权利要求1的白蛋白融合蛋白的步骤，其中所述的Kunitz结构域肽是DX-8卯或DPI-14,或其片断或变异体。43.—种延长DX-890和/或DPI-14，或其片断或变异体的体内半衰期的方法，包含将DX-8卯和/或DPI-14，或其片断或变异体融合到白蛋白，或白蛋白的片断或变异体上的步骤，以便与未融合状态下的DX-890和/或DPI-14，或其片断或变异体的体内半衰期相比足以延长DX-890和/或DPI-14，或其片断或变异体的体内半衰期。44.一种治疗患有可通过DX-88调控的遗传性血管性水肿或遗传性血管性水肺相关性疾病或紊乱的患者的方法，包括施用有效量的权利要求1的白蛋白融合蛋白的步骤，其中所述的Kunitz结构域肽是DX-88,或其片断或变异体。45.—种延长DX-88,或其片断或变异体的体内半衰期的方法，包含将该DX-88，或其片断或变异体融合到白蛋白或白蛋白的片断或变异体上的步骤，以便与未融合状态下的DX-88,或其片断或变异体的体内半衰期相比足以延长DX-88，或其片断或变异体的体内半衰期。46.—种治疗患有可通过DX-1000调控的癌症，癌症相关性疾病，出血或紊乱的患者的方法，包括施用有效量的权利要求1的白蛋白融合蛋白的步骤，其中所述的Kunitz结构域肽是DX-lOOO，或其片断或变异体。47.—种延长DX-IOOO，或其片断或变异体的体内半衰期的方法，包含将DX-IOOO，或其片断或变异体融合到白蛋白或白蛋白的片断或变异体上的步骤，以便与未融合状态下的DX-1000,或其片断或变异体的体内半衰期相比足以延长DX-IOOO,或其片断或变异体的体内半衰期。48.—种核酸分子，它包含编码权利要求1的白蛋白融合蛋白的多核苷酸序列。49.含有权利要求48的核酸分子的载体。50.含有权利要求48的核酸分子的宿主细胞。51.—种药用组合物，它包含有效量的权利要求1的白蛋白融合蛋白和药用上可接受的载体或赋形剂。52.—种制备权利要求1的白蛋白融合蛋白的方法，该方法包括(a)提供在生物中可表达的含有编码白蛋白融合蛋白的核苷酸序列的核酸；(b)在该生物中表达该核酸以形成白蛋白融合蛋白；和Cc)纯化该白蛋白融合蛋白。53.权利要求52的方法，其中该白蛋白融合蛋白包含在糖基化缺陷型酵母菌抹中表达的DX-890和/或DPI-14白蛋白融合蛋白。全文摘要本发明涉及包含与白蛋白或其片断或变异体融合的诸如Kunitz结构域肽(包括，但不限于其片断和变异体)的丝氨酸蛋白酶抑制肽的蛋白质。这些融合蛋白在本文中统称为“本发明的白蛋白融合蛋白”。这些融合蛋白表现出在溶液中的储存期延长和/或治疗活性延长。本发明包含治疗性白蛋白融合蛋白，组合物，药用组合物，剂型和试剂盒。本发明还包含编码本发明的白蛋白融合蛋白的核酸分子，以及含有这些核酸的载体，用这些核酸和载体转化的宿主细胞，和使用这些核酸，载体，和/或宿主细胞制备本发明的白蛋白融合蛋白的方法。本发明还涉及抑制嗜中性粒细胞弹性蛋白酶，激肽释放酶，和纤溶酶的组合物和方法。本发明还涉及治疗囊性纤维变性和癌症的组合物和方法。文档编号C07K14/76GK101166762SQ03807516公开日2008年4月23日申请日期2003年2月7日优先权日2002年2月7日发明者托马斯·韦默,斯科特·M·基,汉斯-彼得·豪泽,瓦尔·罗姆伯格,罗伯特·C·拉德纳,达里尔·斯利普,阿瑟·C·利申请人:达尔塔生物技术有限公司;戴克斯公司