专利名称：作为ccr－3拮抗剂用于治疗炎症的吗啉脲衍生物苯磺酸盐的制作方法
新化合物本发明涉及新化合物、其制备方法、含有它的药物制剂及其治疗用途。
共同待决(Co-pending)的申请号PCT/GB01/04530的国际专利申请(Glaxo Group Limited)涉及了能阻断嗜酸性细胞迁移/趋化的吗啉脲衍生物。
现在，令人惊奇的发现PCT/GB01/04530中式(I)化合物中一类具体的化合物具有特别有利的理化性质，更加适合于大量的制备和在药物制剂中应用。特别地，该化合物是结晶态并且不易吸潮、稳定，而且显示出良好的溶解性。
具体地，该化合物的可结晶的性质对于分离和纯化来说是理想的，用于制备常规的药物制剂也是足够稳定的。这些优点给制剂和处理带来了重要的好处。
因此，根据本发明的一个方面，提供了式(I)化合物 其中A-代表苯磺酸盐(besylate)阴离子；R代表H或C1-6烷基；并且n为0.8到2.2的数字。
优选的R是H。
优选的n为1.1到2.1之间的数字，更优选的大约是2。
所以，本发明一个优选的方面提供了4-({[({[(2S)-4-(3，4-二氯苯基)吗啉-2-基]甲基}氨基)羰基]氨基}甲基)苯甲酰胺苯磺酸盐二水合物。
化合物4-({[({[(2S)-4-(3，4-二氯苯基)吗啉-2-基]甲基}氨基)羰基]氨基}甲基)苯甲酰胺在共同待决的专利申请PCT/GB01/04530中被公开，然而苯磺酸盐以前没有被公开过。我们发现化合物4-({[({[(2S)-4-(3，4-二氯苯基)吗啉-2-基]甲基}氨基)羰基]氨基}甲基)苯甲酰胺不易制成适合药用的盐。
在本发明的另一个方面，提供了式(I)化合物的制备方法，该方法包括式(IA)化合物； 与苯磺酸阴离子和合适的C1-6烷基醇及水组成的原料之间的反应。
合适的苯磺酸阴离子原料为苯磺酸和诸如苯磺酸铵的苯磺酸盐。优选的苯磺酸阴离子原料为苯磺酸。
具体的，将式(IA)化合物在较高的温度(35-45℃范围适宜)悬浮于适当的C1-6烷基醇中(乙醇、异丙醇和水适宜)中。加入苯磺酸阴离子原料(优选苯磺酸)的水溶液。在溶液中可选择的加入合适的反溶剂(乙酸异丙酯适宜)，混合物降温至0-25℃。可选择的加入非极性溶剂如脂肪烃，例如环己烷。混合物可选择地用式(I)化合物的晶种结晶。混合物保持在合适的低温下让产品结晶，通过过滤分离。合适的式(I)化合物的晶种可以与式(IA)化合物和苯磺酸的混合物于低温下(0-25℃适宜)在水与C1-6烷基醇的混合溶液中自发结晶制备。
式(IA)化合物可以通过式(II)化合物或其盐 与式(III)化合物或其盐
在适宜的胺偶联剂(如N，N′-羰基二咪唑)的存在下反应来制备。
具体地，式(II)化合物在合适的第一溶剂中与同一溶剂中的N，N′-羰基二咪唑在在低温的条件下(例如-10-20℃的范围内)反应一段合适的时间(例如5-60分钟)。适合的溶剂包括四氢呋喃、C3-4烷基醇、乙酸异丙酯、N-甲基吡咯烷酮、N，N-二甲基甲酰胺。混合物被加热至合适的温度(例如5-30℃适宜)，并保持这个温度一段合适的时间(例如10-60分钟)。在合适的温度下(20-30℃适宜)加入合适的溶剂(异丙醇)，并保持这个温度一段合适的时间(15-60分钟)。然后加入式(III)化合物，再将混合物加热至合适的温度(如40-65℃)，搅拌一段合适的时间(如60-360分钟)。反应随后冷却至适当的温度，加入适当的第二溶剂(例如乙酸异丙醇)，然后加入适当的酸性盐的水溶液如磷酸二氢钾或适合的酸如醋酸。除去下层，上层先用酸或酸性盐萃洗，再用水水萃洗。有机相在常压下蒸去第一溶剂，剩余式(IA)化合物的第二溶剂的结晶浆液或溶液。这可以直接用于制备式(I)化合物，或过滤得到式(IA)化合物。
式(I)化合物也可以通过式(II)化合物或其盐与式(III)化合物或其盐反应，随后加入苯甲酸(苯甲酸水溶液适宜)在原位(in situ)制备，即不需要分离式(IA)化合物。
相应的，提供了一种制备式(I)化合物的方法，该方法包括式(II)化合物或其盐与式(III)化合物或其盐反应，随后加入苯甲酸或其水溶液，得到式(I)化合物。
具体地，式(II)化合物在合适的第一溶剂中与同一溶剂中的N，N′-羰基二咪唑在在低温的条件下(-10-20℃的范围适宜)反应一段合适的时间(例如5-60分钟)。合适的溶剂包括四氢呋喃、C3-4烷基醇、乙酸异丙酯、N-甲基吡咯烷酮、N，N-二甲基甲酰胺。混合物加热至合适的温度(5-30℃适宜)，并保持这个温度一段合适的时间(例如10-60分钟)。在合适的温度下(5-30℃适宜)加入合适的溶剂(异丙醇适宜)，并保持这个温度一段合适的时间(如15-60分钟)。然后加入式(III)化合物，混合物加热至合适的温度(40-65℃的范围适宜)，搅拌一段合适的时间(例如60-360分钟)。反应随后冷却至适当的温度，加入适当的第二溶剂(例如乙酸异丙醇)，然后加入适当的酸性盐的水溶液如磷酸二氢钾或酸如醋酸。如有必要，澄清溶液，除去下面水层，上层进一步先用酸或酸性盐溶液萃洗，再用水萃洗。常压下将有机相蒸馏至较小的体积，加入适当的溶剂(异丙醇为宜)，重复浓缩步骤。在合适的温度下(15-45℃适宜)加入苯磺酸水溶液，在加入适当的反溶剂(异丙醇为宜)。混合物可选择的用式(I)化合物的晶种结晶。再加入反溶剂，混合物冷却至0-10℃，在低温下保持一段合适的时间。过滤混合物，得到式(I)化合物。
式(II)化合物(II)的制备可以通过反应(a)、反应(b)或反应(c任意一个反应来制备。
反应(a)。式(IV)化合物与式(V)化合物的反应 其中A是一个保护的氨基，苯二酰亚氨基适宜，得到式(IIAR)化合物 其中A的定义同上，接着去氨基保护，生成式(IIR)化合物
接下来是将产生的式(IIR)化合物的对映异构体分离；或者反应(b)。上文定义的式(IV)化合物与式(VA)化合物的反应 其中A的定义同上文式(V)中定义，得到式(IIA)化合物 其中A的定义同上，接下来进行脱氨基保护，得到式(II)化合物。
反应(c)。式(VI)化合物的水解； 随后将产生的式(IIR)化合物的对映异构体分离。
具体的，对于反应(a)和反应(b)，式(IV)化合物与式(V)化合物或与式(VA)化合物的反应都是在如下所述的Mitsonobu条件下进行的具体的，在适当的溶剂如四氢呋喃或甲苯中、适当的温度(混合物的回流温度适宜)及在惰性气体中(氮气适宜)将式(IV)化合物与式(V)化合物或与式(VA)化合物混合物搅拌，2-36小时适宜。然后进一步地加入溶剂，四氢呋喃或甲苯较适宜，并冷却混合物至0-40℃较合适。加入磷化氢(亚磷酸三苯酯适宜)，并且搅拌混合物。然后在一段时间内(5-120分钟适宜)加入偶氮二甲酸(偶氮二甲酸二异丙酯适宜)，同时保持温度＜40℃。允许混合物是温的，20-40℃适宜。如果必要，可以进一步的加入磷化氢和偶氮二甲酸。再过一段时间之后，反应混合物被浓缩至近干燥。加入适量的乙醇，2-丙醇或甲醇也适宜，然后重复浓缩的步骤。如必要，这个步骤可以再重复。再加入乙醇，将混合物加热至一定的温度，55-75℃适宜。经过适当的一段时间后(20-40分钟适宜)，冷却生成物结晶浆液，冷却到15-25℃较适宜，然后允许放置一段时间(1.5-3小时适宜)，这段时间过后过滤分离产物。使用大量的乙醇冲洗过滤器底床，随后在35-45℃的真空中干燥，分别可获得式(IIAR)或式(IIA)化合物。
保护基的切除是在适当的极性溶剂(水适宜)，且当存在无机酸(硫酸较适宜)的情况下加热式(IIAR)化合物或式(IIA)化合物而进行的。升高温度将混合物(混合物的回流温度较适宜)加热适当长的时间(8-24小时适宜)。然后冷却混合物，加以适当的极性溶剂(二氯甲烷较适宜)和碱(0.88G的氨水较适宜)，保持温度低于25℃。进一步使用极性溶剂萃取液相，用水冲洗结合的有机相。通过蒸发至干燥分离式(IIR)或式(II)化合物。
上面描述的式(IIAR)或式(IIA)化合物的制备方法也可以分为两个步骤进行，其中式(IIBR)或式(IIB)中间产物分别被分离；
其中，其中A的定义同上文式(V)和(VA)中的定义；具体地，将式(V)化合物与(V)化合物或与式的(VA)化合物的混合物溶解在适当的溶剂中，例如四氢呋喃、C3-4阿卡诺尔、甲苯、N-甲基吡咯烷酮和N，N二甲基酰胺，在适当的温度(混合物的回流温度适宜)下和在惰性气体(氮气适宜)中搅拌2-36小时。如果必要，再加入式(V)化合物，在适当的温度(混合物的回流温度较适宜)加热混合物，且在惰性气体(氮气适宜)中，加热适当长的时间。然后冷却反应混合物，20-25℃适宜，加入共溶剂(二异丙醚较适合)将化合物沉淀，式(IIBR)化合物或式(IIB)化合物分别通过过滤分离，再用混合溶剂洗涤，真空干燥。
式(IIAR)或式(IIA)化合物可以分别通过式(IIBR)或式(IIB)化合物利用上文中所述的式(IV)化合物和式(V)或(VA)化合物反应的条件来制备。
具体的，反应(c)是通过往式(VI)化合物的合适的溶剂如甲醇和水混合物的溶液中，加入适当的碱如碳酸钾搅拌进行的。混合物在合适的温度下如20-25℃的范围搅拌适当的时间如16-20小时，随后在真空中抽干有机溶剂。然后加入水，混合物用合适的有机溶剂如乙酸乙酯萃洗。合并的有机相用水和饱和氯化钠溶液萃洗，之后用合适的干燥剂例如硫酸钠干燥，过滤，蒸干有机溶剂。粗品再用闪式柱层析纯化。
从外消旋产物如式(IIR)化合物中分离式(II)化合物可以使用本领域技术人员熟知的技术来进行，比如制备手性高效液相色谱(手性HPLC)或者非对映异构体盐的分馏结晶。
可以通过式(VII)化合物与3，4-二氯苯甲酰氯反应制备式(VI)化合物。
具体的，式(VII)化合物与3，4-二氯苯甲酰氯的反应是在适当的溶剂如N，N二甲基酰胺中，及在惰性气体如氮气中进行，并加入适当的碱如碳酸钾和适当的激活剂如碘化钠。在真空中除去挥发性成分之前，在适当的温度(如在20-25℃之间)下搅拌混合物，，搅拌应持续适当长的时间如16-20小时。
式(VII)化合物是在惰性气体的保护下(例如氮气)，将吗啉-2-基甲胺在合适的有机溶剂如甲醇中的溶液与乙基-α，α，α-三氟乙酸在合适的无水溶剂如乙醚中的溶液反应来制备。混合物在合适的温度下如20-25℃的温度范围，搅拌一段合适的时间如20-40分钟，蒸出挥发性成分。然后残余物溶于合适的有机溶剂如甲醇中，再蒸出挥发性成分。
认为式(IIA)、(IIBR)和(IIB)化合物是新化合物，并构成本发明另一个方面。
式(IIR)化合物是已知的(J.Med.Chem.，1991，34(2)，616-624)。
吗啉-2-基甲胺、乙基-α，α，α-三氟乙酸、式(IV)和(V)化合物和式(V)化合物的旋光异构体是已知的、市售的化合物，或者可以通过类似的已知步骤如在标准参考文献例如J.March，Advanced OrganicChemistry，3rd Edition(1985)，Wiley Interscience中已经公开的合成方法制备。
在上面提及的所有反应中的合适的保护基都是本领域文献中常规的。这些保护基的形成和脱去的方法是那些常规的适用于保护分子的方法，如那些合成方法学标准参考文献上例如P J Kocienski，ProtectingGroups，(1994)，Thieme)中的方法。
上面描述的任何一种合成步骤中，可采用常规的加热和冷却方法，例如电加热套和冰/盐浴。
本发明化合物的稳定性可以通过常用的定量分析方法测定例如固体形式的该化合物稳定性可以通过加速稳定性试验如差示扫描量热法(DSC)，热重量分析(TGA)和包括常规的储存试验的提高温度的等温试验，其中，在温度和湿度控制的条件下，待测化合物被储存超过已知的时间间隔。在储存期间和储存期过后对待测化合物进行的定量分析，并与以前的适当参考标准品比较，可以来确定该化合物的稳定性，例如，在以下的检测中本发明的化合物没有表现出显著的降解40℃/20％相对湿度，25天；40℃/75％相对湿度，25天；50℃/周围环境，25天；光厨，周围环境，14天。
正如所阐明的，本发明化合物要比相应的游离碱在水中更易溶。因此，一种方便的检测本发明化合物在水溶液中稳定性的方法包括在已知的温度和时间间隔测定待测化合物水溶液中的杂质。我们已经发现式(1)化合物在有光和避光以及pH范围为2-10的情况下能够保持良好的水溶稳定性超过8天。
上面提到的检测本发明化合物中杂质的定量分析可以用常规的方法进行，通常采用色谱方法如高效液相色谱(HPLC)。
本发明的化合物可以按照以下的试验来检测其体内和体外的生物活性(a)CCR-3结合试验使用CCR-3竞争性结合SPA(闪烁接近试验)来评价新化合物对CCR-3的亲和力。将由能够稳定表达CCR-3(2.5μg/well)的K562细胞制备的膜与0.25mg/孔的小麦胚凝集素珠(SPA beads)(Amersham)混合，然后在4oC的粘合缓冲液(HEPES 50mM，CaCl25mM，0.5％BSA)中孵育1.5hr。孵育结束后，加入20pM的[125I]嗜酸细胞活化趋化因子和浓度递增的化合物(1pM到30μM)，在96孔板中于22℃孵育2小时，随后使用Microbeta板计数器计数。总试验体积为100μl。将竞争结合的数据用一个有四个参数的logistic方程拟合数据分析。使用至少两次试验的pIC50(能够抑制嗜酸细胞活化趋化因子结合50％的化合物浓度的负对数)平均值来表示结果。
(b)嗜酸性细胞趋化性试验评价化合物对嗜酸性细胞趋化性的抑制作用。通过以前公开的应用Miltenyi细胞分离柱和一个有磁性的Super Macs磁体(Motegi &Kita，1998；J.Immunology.1614340-6)所进行的标准CD16细胞清除的方法从人的外周血中纯化嗜酸性细胞。将细胞重新悬浮在RPMI1640/10％FCS溶液中，然后在37℃孵育30分钟。孵育后，将嗜酸性细胞在400g离心5分钟，并再次悬浮在2.2million/ml的RPMI/FCS中。然后在浓度递增的化合物存在条件下，细胞在37℃孵育30分钟。而对照反应细胞仅与RPMI/FCS孵育。将嗜酸细胞活化趋化因子激动剂(对于浓度反应曲线或是功能抑制曲线中EC80的浓度)加入到96孔趋化板(5μm过滤器Receptor Technologies)的下层。将嗜酸性细胞(50μl的2million/ml细胞)加到过滤板的下层，并在37℃下孵育45分钟。移走仍然保留在趋化过滤器顶端的细胞，通过也荧光板阅读器上已经迁移的嗜酸性细胞的数目。用一个有四个参数的logistic方程拟合数据分析化合物对嗜酸性趋化效果的抑制曲线。使用下面的方程来计算功能pKi值(fpKi)(Lazareno & Birdsall，1995.Br.J.Pharmacol1091110-9)。
(c)豚鼠卵清蛋白模型对豚鼠的嗜酸性细胞浸润和超敏反应的抑制基于Danahay等人在1997年描述的方法，给予卵清蛋白致敏的豚鼠美吡拉敏(30mg kg-1 ip)预防过敏性支气管痉挛。将测试化合物溶解在10％DMSO与90％PEG200中，在卵清蛋白致敏(呼吸由0.5％卵清蛋白产生的气溶胶10分钟)之前的30分钟经口途径给予测试化合物。在卵清蛋白致敏24小时后，使用全身性的体积描记仪(Buxco Ltd.，USA)测量气道对于凝血烷类物质U46619的超敏反应。然后将豚鼠处死，进行肺灌注。对支气管肺泡灌洗液的总白细胞和分类白细胞计数，确定嗜酸性细胞计数降低的百分比(Sanjar et al.，1992)。作为具体剂量抑制效应的数据用占赋形剂对照的百分比来表示。
本发明的化合物对于多种疾病具有潜在的抗炎症作用，例如呼吸道疾病如支气管炎(包括慢性支气管炎)、支气管扩张、气喘(包括过敏原诱导的气喘反应)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)，囊性纤维化、窦炎和鼻炎。还有其它的一些相关疾病，包括胃肠道疾病如肠内炎症性疾病包括肠炎(例如Crohn′s病或溃疡性结肠炎)以及继发于放射线或是过敏原暴露的肠炎。
另外，本发明的化合物可以用来治疗肾炎，皮肤病如牛皮癣、湿疹、过敏性皮炎和过敏反应，及含有炎症成分的中枢神经系统疾病(例如阿尔茨海默病、脑膜炎、多发性硬化)HIV与AIDS性痴呆。
本发明的化合物还可以用来治疗鼻息肉、结膜炎或是瘙痒症。
本发明的化合物具有潜在有益作用的疾病状态的其它例子还包括心血管疾病如动脉粥样硬化、外周血管病和原发性的高嗜酸粒细胞综合征。本发明化合物可能对其有益的其它疾病还包括其它的高嗜酸粒细胞疾病，如Churg-strauss综合症。另外，嗜酸性粒细胞增多普遍见于寄生虫感染，尤其是蠕虫感染，因此本发明的化合物可用于治疗高嗜酸性状态疾病如包虫囊肿(Echinococcus sp.)，绦虫感染(Taenia sp.)，血吸虫(schistosomiasis)和线虫(round worms)感染，比如钩虫(Ancylostoma sp.)、蛔虫属、类圆线虫属、毛线虫属、尤其是淋巴丝虫属包括盘尾属、布鲁格氏丝虫属、Wucheria(Elephantiasis)所引起的炎症。
本发明的化合物可作为一种免疫抑制剂应用，因此能够用来治疗自身免疫性疾病如同种移植器官排斥、类风湿性关节炎和糖尿病。本发明的化合物在于抑制转移方面也有用。
主要相关的疾病包括哮喘、COPD和包含季节性和常年性鼻炎的上呼吸道的炎性疾病。
主要相关的疾病中，优选疾病包括哮喘和包含季节性和长期的鼻炎的上呼吸道的炎性疾病。
其它主要相关的疾病包括胃肠道的炎症性疾病如肠炎。
如果能将对确定疾病状态的治疗或缓解由此作为从治疗引申到预防的参考，这将受到本领域技术人员的赞赏。
正如上面所提到的，式(I)化合物作为治疗剂是有用的。
因此，作为本发明的另一方面，提供了式(I)化合物作为治疗剂的应用，尤其是治疗患有炎症如哮喘或是鼻炎的患者。
根据本发明的另一个方面，提供了式(I)化合物在制备治疗炎症状况如哮喘或鼻炎的药物中的应用。
此外，提供了治疗患有炎症或对炎症如哮喘或是鼻炎易感的人类或动物患者的方法，该方法包括给予所述的人类或动物有效量的式(I)化合物。
本发明的化合物可以制成任何便于给药的制剂，并且本发明含有在它的范围内的药物组合物，该组合物包括式(I)化合物及一种或是多种生理可以接受的稀释剂或载体。
也提供了制备包含混合组分的药物制剂的方法。
本发明的化合物可以被制备成如口服、吸入、鼻内、口腔、胃肠外或直肠给药，优选口服给药。
用于口服的片剂和胶囊可以含有常规的赋形剂，例如粘合剂，如糖浆、阿拉伯树胶、凝胶、山梨醇、黄芪胶、淀粉粘液、纤维素或是聚乙烯吡咯烷酮；填充剂，如乳糖、微晶纤维素、蔗糖、玉米淀粉、磷酸钙或是山梨醇；润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸、滑石粉、聚乙二醇或是硅石；崩解剂，如马铃薯淀粉、交联羧甲纤维素钠或是淀粉乙醇酸钠；润湿剂，如十二烷醇硫酸钠。片剂可以根据本领域技术进行包衣。口服液体制剂可以制成的形式，如水性或是油性悬浮剂、溶液、乳状液、糖浆或酏剂，或者也可以制成干剂，在使用前配以水或是其它载体。这样的液体制剂可以包括常规的添加剂如悬浮剂，例如山梨醇糖浆、甲基纤维素、葡萄糖/蔗糖糖浆、凝胶、羟甲基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或是氢化可食用脂肪；乳化剂如卵磷脂、山梨聚糖单油酸盐或阿拉伯树胶；非水性载体(可包括可食用油)，例如杏仁油、分馏椰子油、油脂、丙烯乙二醇或是乙烷乙醇；或防腐剂，例如甲基或是丙基p-羟苯酸酯或山梨酸。该制剂也可以包括适量的缓冲盐、调味剂、着色剂和/或甜味剂(例如甘露醇)。
口腔给药的组合物可按照常规给药方式制成片剂或是锭剂。
该化合物也可以被制成栓剂，例如含有常规的栓剂基质，如椰子油或其它的甘油酯。
本发明的化合物也可以被制成静脉注射(bolus inection)或是持续输注的非肠道给药形式，并可以分成单元剂量形式，如以安瓿、小瓶、小体积输注或预装满注射器的形式，或者放置在多次给药容器中，并加入防腐剂。组合物可采取溶于水性或非水性载体的溶液、悬浮液或乳状液形式，并且含有formulatory agent，如抗氧化剂、缓冲液、抗菌剂和/或等渗调节剂。可选择的是活性成分可以制成粉末，在使用前配以适当的载体如无菌无致热原的水。干固体形式可以通过将无菌粉末在无菌操作下装入单独的无菌容器或是通过将无菌溶液在无菌操作下装入每一个容器，然后冷冻干燥。
本发明的化合物或是药物组合物也可以同其它的治疗药物联合使用，例如抗组胺药、抗胆碱能药、抗炎药(如皮质类固醇(例如丙酸氟替卡松、丙酸倍氯松、糠酸莫米松、曲安奈德或布地奈德)、或NSAIDs(如色甘酸钠、奈多罗米钠、PDE-4抑制剂、白三烯拮抗剂、iNOS抑制剂、类胰蛋白酶和弹性蛋白酶抑制剂、β-2粘附分子拮抗剂及腺苷2a激动剂))或β肾上腺素药物(比如沙美特罗、沙丁胺醇、氟莫特罗、非诺特罗或特布他林及其盐)、抗组胺药(比如美沙吡林或氯雷他定)或抗感染药(比如抗生素、抗病毒药)。
认识到，当本发明的化合物与其它通常以吸入或是鼻内给药的治疗药物联合使用时，合成的药物组合物可以通过吸入或是鼻内途径给药。
本发明化合物可以以常规给药剂量给药，0.001到500mg/kg体重，优选0.01到500mg/kg体重，更优选0.01到100mg/kg体重，每天1到4次。当然，精确的剂量根据患者的年龄和疾病状况以及所选择的给药途径而定。
生物学数据在CCR-3结合试验和/或嗜酸性细胞趋化试验(试验(a)和(b))中检测式(I)的化合物。在CCR-3结合试验中，本发明化合物的具有大于5的pIC50值。在CCR-3嗜酸性细胞趋化试验中，本发明化合物的具有大于5的fpKi值。
在整个说明书和权利要求书中，除非文中要求，否则单词“comprise”和其变体如“comprises”和“comprising”应该被理解为隐含着包含阐明的整体或步骤或是一组整体，但并不排除任何其它整体或是步骤或一组整体或一组步骤。
下面的实施例进一步证实本发明，但并不以任何形式限定本发明。
图1是式(I)化合物的二水合物的X-光衍射图；图2是式(I)化合物的二水合物经热重量分析/差示扫描量热法结合迹线图；图3是式(I)化合物的二水合物的差示扫描量热法迹线图；图4是式(I)化合物的二水合物的热重量分析迹线图。
通用实验描述(general experimental detail)NMR使用Bruker DPX250或DPX400仪器获得核磁共振谱。
IR使用应用锗标记(ATR)探针的Nicolet Avatar 360仪器获得红外光谱。
LC/MS系统A使用了以下的液相色谱质谱系统(LCMS)3mm ABZ+PLUS(内径3.3cm×4.6mm)柱，洗脱液A-0.1％甲酸+0.077％w/v醋酸铵的水溶液；和B-95∶5乙腈∶水+0.05％v/v甲酸，流速为每分钟3ml。使用以下的梯度方案0.7分钟100％A；A+B混合物，梯度方案0-100％B，用时3.5分钟；100％B持续1.1分钟；再用100％A用时0.2分钟。
LC/MS系统B3μm Phenomenex Luna(50×2mm i.d.)柱，洗脱液A-0.05％三氟乙酸的水溶液，B-0.05％三氟乙酸的乙腈溶液，40℃，流速为每分钟1ml。使用以下的线性梯度0到95％B，用时8分钟。
分析性HPLC柱、条件和洗脱液进行反相高效液相色谱柱采用Luna 3mm C18(2)(50×2.0mm i.d.)柱，洗脱液为A-100％水，0.05％TFA；与B-100％乙腈，0.05％TFA，流速为每分钟2ml，并且在60℃下。使用以下的梯度方案0-95％B用时2.00分钟，再用0％B，用时0.01分钟。
实施例14-({[({[(2S)-4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}氨基)羰基]氨基}甲基)苯甲酰胺苯磺酸盐二水合物将4-({[({[(2S)-4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}氨基)羰基]氨基}甲基)苯甲酰胺(15g)悬浮于40℃的乙醇(60ml)和水(7.5ml)的混合溶液中。加入苯磺酸(6.0g)的水溶液(7.5ml)，随后进一步加入水(15ml)。在40℃加入乙酸异丙酯(300ml)，随后加入乙醇(40ml)。混合物冷却到0℃，用环己烷(10ml)稀释，并用已确认的4-({[({[(2S)-4-(3，4-二氯苯基)吗啉-2-基]甲基}氨基)羰基]氨基}甲基)苯甲酰胺苯磺酸盐二水合物作为晶种结晶。混合物淬冷至0℃1小时，加入环己烷(100ml)，用时15分钟，在℃成化。产物通过真空过滤分离，用乙酸异丙酯(2×30ml)洗涤，在25±5℃真空干燥，得到白色固体状标题化合物(16.44g)。
NMR(DMSO d-6)2.81δ(1H)宽t；3.0-3.45(5H)m；3.67δ(2H)m；4.02δ(1H)d of d，J＝12.7Hz，2.5Hz；4.25δ(1H)d，5.9Hz；4.37δ(2H)m；6.24δ(1H)t，J＝5.6Hz；6.58δ(1H)t，J＝5.9Hz；7.3δ(6H)m7.48δ(1H)dofd，J＝8.3Hz，2.0Hz；7.61δ(2H)m[基磺酸盐]；7.75δ(1H)d，J＝8.3Hz；7.81δ(1H)d，2.0Hz；7.82δ(2H)m；7.91δ(1H)宽s；9.85(1H)宽s[NH+]。
实施例24-({[{[(2S)-4-(3，4-二氯苯基)吗啉-2-基]甲基}氨基)羰基]氨基}甲基)苯甲酰胺苯磺酸盐二水合物详述9中的结晶浆液冷却至50±3℃，加入异丙醇(30ml)，再加入苯磺酸水溶液(32％w/v，10ml)。混合物大约1小时冷却至22±3℃，用已确认的4-({[({[(2S)-4-(3，4-二氯苯基)吗啉-2-基]甲基}氨基)羰基]氨基}甲基)苯甲酰胺苯磺酸盐二水合物作为晶种结晶，在22±3℃成化72小时。混合物冷却至0±3℃1小时并过滤。滤饼用乙酸异丙酯/异丙醇/水4∶1∶0.1的混合物(2.5ml)洗涤，在25±5℃真空干燥，得到白色固体状标题化合物(6.9g)。
实施例34-({[({[(2S)-4-(3，4-二氯苯基)吗啉-2-基]甲基}氨基)羰基]氨基}甲基)苯甲酰胺苯磺酸盐二水合物在0-5℃用25分钟将悬浮在四氢呋喃(600ml)中的羰基二咪唑(38.8g)加入1-[(2S)-4-(3，4-二氯苯基)吗啉-2-基]甲基胺(60g)的四氢呋喃溶液(120ml)中。混合物加热至10-15℃，并持续15分钟。用10分钟加入异丙醇(30ml)，混合物在10-15℃继续搅拌45分钟。加入4-氨甲基苯甲酰胺(35.9g)，混合物升温至55-60℃，并保持90分钟。蒸馏除去四氢呋喃(240ml)，混合物冷却至20-25℃。混合物用乙酸异丙酯(480ml)和5％的磷酸二氢钾水溶液(480ml)处理，弃去水相。有机相再先用5％的磷酸二氢钾水溶液(2×480ml)洗涤，再用水(480ml)洗涤。
蒸馏浓缩有机相至250ml，用异丙醇(850ml)稀释，再浓缩至终体积420ml。混合物在20-25℃冷却，用苯磺酸(38.5g)水溶液(110ml)处理，加热到35℃。加入乙酸异丙酯(720ml)，混合物冷却到20-25℃，用已确认的4-({[({[(2S)-4-(3，4-二氯苯基)吗啉-2-基]甲基}氨基)羰基]氨基}甲基)苯甲酰胺苯磺酸盐二水合物作为晶种结晶。混合物在这个温度下搅拌3小时，再用乙酸异丙酯(180ml)处理，再搅拌30分钟，冷却至0-5℃。产物通过真空过滤分离，用乙酸异丙酯∶异丙醇∶水(6∶1∶0.1，350ml)洗涤，在35+5℃真空干燥，得到白色固体状标题化合物(115.6g)。
详述详述12，2.2-三氟-N-( 2-甲基-吗啉基)乙酰胺在氮气的保护下，往搅拌着的2-甲基-吗啉基乙酰胺(3.1g)的甲醇溶液(70ml)中加入乙基-α，α，α-三氟乙酸的乙醚溶液(20ml乙醚中含有5ml)。该乙醚溶液已经用饱和碳酸氢钠、水和饱和食盐水萃洗和干燥过。混合物在22℃搅拌30分钟，在真空中蒸馏除去所有的挥发性物质。残余物溶解于甲醇(10ml)中，挥发性物质再一次在真空中蒸馏除去，得到白色泡沫状标题化合物(4.9g)。
热喷雾质谱m/z213[MH+]详述2N-{[4-(3，4-二氯苯基)吗啉-2-基]甲基}-2，2，2-三氟乙酰胺在氮气的保护下，往搅拌的详述1(3.3g)的N，N-二甲基甲酰胺溶液(50ml)中加入碳酸钾(2.46g)和碘化钠(2.12g)。将3，4-二苯基氯(2ml)的N，N-二甲基甲酰胺(10ml)溶液逐滴加入混合物中。混合物在22℃搅拌18小时，之后在真空中除去挥发性物质。残余物在二氯甲烷(100ml)和饱和碳酸钠溶液(50ml)中萃取分液。接着有机相用饱和碳酸钠水溶液(2×50ml)和水(50ml)萃洗，之后用硫酸镁干燥、过滤、在真空中蒸去溶剂得到黄白色油状物。油状物用含有90克硅胶cartridge的Biotage闪式色谱纯化，洗脱剂为25％的乙酸乙酯的环己烷溶液，得到无色油状标题化合物(2.97g)。
LC/MS(系统A)，保留时间2.63分钟，质谱m/z 371[MH+]。
详述3[4-(3，4-二氯苯基)吗啉-2-基]甲基胺往搅拌着的详述2(2.97g)的甲醇(15ml)和水(5ml)的混合溶液中加入饱和碳酸钾(5.53g)。混合物在22℃搅拌18小时，之后在真空中蒸去甲醇。加入水(25ml)，并用乙酸乙酯(3×30ml)提取混合物。合并的有机相用水(5ml)和饱和氯化钠水溶液(10ml)萃洗，之后用硫酸钠干燥、过滤、在真空中蒸去溶剂得到黄白色油状物。油状物用含有90克硅胶cartridge的Biotage闪式色谱纯化，洗脱剂为75∶8∶1二氯甲烷/乙醇/0.880氨水。合并需要的部分，在真空中蒸干溶剂，得到无色油状标题化合物(1.85g)。
LC/MS(系统A)，保留时间1.77分钟，质谱m/z 275[MH+]。
详述4[4-(3，4-二氯苯基)吗啉-2-基]甲基胺(替代合成法)在氮气的保护下2-[(3，4-二氯苯基)氨基]乙醇(0.980g)与2-(环氧乙烷基-2-甲基)-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮(1.10g)的混合物在80℃下加热3小时。合成的固体物质用浓硫酸处理(1.5ml)，然后在150℃下搅拌24小时。混合物用水(100ml)处理，然后用乙酸乙酯(2×100ml)萃洗。深色的水相用5M的氢氧化钠水溶液碱化至大约pH12，然后用乙酸乙酯(2×100ml)萃取。合并的有机相用水和饱和食盐水萃洗、干燥(Na2SO4)并在真空中蒸干，得到棕色油状标题化合物(1.02g)。
详述51-[(2S)-4-(3，4-二氯苯基)吗啉-2-基]甲基胺将详述3(外消旋混合物，8g)用制备手性HPLC分离成单个的对映异构体。分离采用2″×22cm Chiralpak AD 20μm柱，Merck self packDAC系统，洗脱剂为庚烷∶无水乙醇∶二乙胺95∶5∶0.1(v/v)(流速55ml/min over 40min，紫外检测225nm)；样品填充制备400mg样品溶于20ml的无水乙醇∶系统洗脱剂3∶2的混合溶剂中。
得到如下的标题化合物(2.49g)制备HPLC保留时间23.0分钟。
详述61-[(2S)-4-(3，4-二氯苯基)吗啉-2-基]甲酰胺与其D-酒石酸盐1∶1将详述3(0.613g)溶于甲醇(12.3ml)中。加入D-酒石酸(0.335g)，结晶浆液加热回流50分钟。混合物冷却至0-5℃，过滤分离沉淀，得到白色固体状标题化合物(0.4g)。
ee76％ee手性分析HPLC(Chiralpak AD柱，4.6×250mm，洗脱剂50∶50∶0.1甲醇∶乙醇∶丁胺，流速0.5ml/min，在220nm进行紫外检测)，保留时间8.9分钟。
详述7制备2-{[(2R)-4-(3，4-二氯苯基)吗啉-2-基]甲基)-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮在氮气保护下，将2-[(3，4-二氯苯基)氨基]乙醇(2.038 g)与(S)-2-(环氧乙烷基-2-甲基)-1 H-异吲哚-1，3(2H)-二酮(2.032g)的四氢呋喃(3.3ml)混合物搅拌加热至回流。用时21.5小时后再加入四氢呋喃(12.5ml)，混合物冷却至3℃。加入三苯基膦(2.793g)，混合物搅拌至所有固体溶解。加入二异丙基偶氮二羧酸酯(Diisopropylazodicarboxylate)(2.1ml)，用时12分钟，保持温度小于7℃。2.25小时后，混合物可升温至22℃。用时5.3小时后，再加入三苯基膦(121mg)和二异丙基偶氮二羧酸酯(0.09ml)。22.5小时后，反应混合物浓缩至近干。加入2-丙醇(12ml)，再次浓缩，此步骤再重复一次。再加入2-丙醇(12ml)，混合物升温至70℃。0.5小时后将结晶浆液冷却至22℃，再过2小时收集产物。产物层(The bed)用2-丙醇(2×4ml)洗涤，在40℃真空干燥，得到标题化合物(2.622g)。
NMR(DMSO d-6)1.93δ(1H)d of d，J＝11.0Hz，8.8Hz；2.10δ(1H)dof t，J＝3.5Hz，11.3Hz；2.52δ(1H)宽d，J＝11.3Hz；2.77δ(1H)宽d，J＝11.3Hz；3.3-3.8δ(7H)m；7.31δ(1H)d of d，J＝8.2Hz，1.9Hz；7.55δ(1H)d，J＝1.9Hz；7.68δ(1H)d，J＝8.2Hz；7.86δ(4H)m。
详述8制备[(2S)-4-(3，4-二氯苯基)吗啉-2-基]甲胺详述7(1.00g)的结晶浆液的水(8.5ml)溶液加热至75℃，然后滴加入浓硫酸(2.5ml)。混合物加热回流。23小时后反应混合物冷却至22℃，然后用二氯甲烷(6ml)处理。在降温的过程中逐滴加880氨溶液(7ml)。再加入二氯甲烷(10ml)。分离水相，再用二氯甲烷(10ml)萃取。合并的有机相用水(5ml)萃洗，然后蒸干。残余物再在二氯甲烷(DCM)中蒸干，得到油状标题化合物(662mg)。
NMR(DMSO d-6)1.78δ(1H)t，J＝10.5Hz；2.06δ(1H)d oft，J＝3.4Hz，11.3Hz；2.45-2.65δ(3H)m；2.738(1H)d oft，J＝11.3Hz，1.7Hz；3.38δ(1H)m；3.46δ(2H)AB q；3.51δ(1H)d of d，J＝11.3Hz，2.5Hz；3.77δ(1H)d of m，J＝11.3Hz；7.31δ(1H)d of d，J＝8.3Hz，2.0Hz；7.55δ(1H)d，J＝2.0Hz；7.58δ(1H)d，J＝8.3Hz。
详述94-({[({[(2S)-4-(3，4-二氯苯基)吗啉-2-基]甲基}氨基)羰基]氨基}甲基)苯甲酰胺在5-10℃下，用时大约10分钟，(5g)的THF溶液中加入N，N′-羰基二咪唑(3.2g)的THF(30ml)溶液。混合物加热至15±3℃，保持这种温度大约15分钟。随后加入4-氨甲基苯甲酰胺(3.0g)，混合物加热至60+3℃，在这个温度下搅拌75分钟。反应冷却至22+3℃，加入乙酸异丙酯(40ml)，随后加入磷酸二氢钾溶液(5％w/v，40ml)。溶液通过硅藻土(2g)过滤，除去下面的水层，上面的有机层先用磷酸二氢钾溶液(5％w/v，2×40ml)萃洗，再用水(40ml)萃洗。有机相在大气压下蒸馏除去THF，剩下4-({[({[(2S)-4-(3，4-二氯甲苯)吗啉-2-基]甲基}氨基)羰基]氨基}甲基)苯甲酰胺的乙酸异丙酯结晶浆液(大约60ml)。
将包含4-({[({[(2S)-4-(3，4-二氯甲苯)吗啉-2-基]甲基}氨基)羰基]氨基}甲基)苯甲酰胺的结晶浆液直接用于实施例2的制备过程，或将过滤得到分离形式的4-({[({[(2S)-4-(3，4-二氯甲苯)吗啉-2-基]甲基}氨基)羰基]氨基}甲基)苯甲酰胺用于实施例1的制备过程。
详述102-{(2R)-3-[(3，4-二氯苯基)(2-羟乙基)氨基]-2-羟丙基}-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮在氮气保护并且搅拌的条件下向2-[3，4-(二氯苯基)氨基]乙醇(2.8g)的四氢呋喃溶液中加入(S)-2-(环氧乙烷基-2-甲基)-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮(3.1g)。混合物加热至90℃用时1小时，并保持这个温度18小时。再加入2-[3，4-(二氯苯基)氨基]乙醇(0.14g)，反应混合物再次加热至90℃，恒温5小时。反应混合物冷却至22℃，加入异丙醚(21ml)，产物通过真空过滤分离。滤饼用异丙醚(3ml)洗涤，40℃真空干燥，得到白色固体状标题化合物(4.79g)。
LC/MS(系统B)，保留时间3.85min，质谱m/z 423[MH+]详述11制备[(2S)-4(3，4-二氯苯基)吗啉-2-基]甲基胺(可选择脱保护)详述7(70.00g)的结晶浆液的40％w/w的甲胺水溶液(560ml)中的加热至50-60℃，并保持3小时。混合物中滴加入10N的氢氧化钠(35ml)，冷却至＜25℃，然后用二氯甲烷(210ml)处理。分离水相，再用二氯甲烷(210ml)萃洗。合并的有机相水(70ml)萃洗，然后蒸干。残余物再从二氯甲烷(DCM)中蒸干，得到油状的标题化合物(47.7g)。
详述124-({[({[(2S)-4-(3，4-二氯苯基)吗啉-2-基]甲基}氨基)羰基]氨基}甲基)苯甲酰胺在15-25℃下，往[(2S)-4-(3，4-二氯苯基)吗啉-2-基]甲基胺及其D-酒石酸盐1∶1(20g)、水(100ml)和二氯甲烷(120ml)混合物中加入氨水(10ml)。分层，水层用二氯甲烷(30ml)萃取，合并有机相，并用2％氯化钠水溶液(20ml)萃洗。有机相浓缩成油状物，加入到THF(20ml)中。在0-5℃，用时大约10分钟，往该溶液中加入N，N′-羰基咪唑(7.8g)的THF(80ml)结晶浆液。混合物加热至15±3℃，并保持这个温度大约15分钟。加入异丙醇(6ml)，在15±3℃继续搅拌5分钟。然后加入4-氨甲基苯甲酰胺(7.2g)，混合物加热至60±3℃，并在这个温度搅拌120分钟。
反应冷却至22±3℃，加入乙酸异丙酯(96ml)，随后加入加入磷酸二氢钾(5％w/v，96ml)溶液。有机相进一步先用磷酸二氢钾(5％w/v，2×96ml)萃洗，再用水(96ml)萃洗。有机相通过硅藻土过滤，滤饼用乙酸异丙酯洗涤。滤液浓缩至半固体，再悬浮在乙酸异丙酯(200ml)中回流。结晶浆液冷却至22-25℃，用时1小时，冷却至0-5℃并且成化15分钟。产物通过过滤分离，用乙酸异丙酯(50ml)洗涤，真空干燥，得到白色固体状标题化合物(17.4g)。
LC-MS(系统A)，保留时间2.27分钟，质谱m/z 451/453(MH+)详述13制备2-{[(2R)-4-(3，4-二氯苯基)吗啉-2-基]甲基}-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮在氮气的保护下，2-[(3，4-二氯苯基)氨基]乙醇(400g)和(S)-2-(环氧乙烷基-2-甲基)-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮(399.6g)的甲苯(1150ml)混合物搅拌并加热至103-107℃。22.5小时后，混合物冷却至＜60℃，加入四氢呋喃(2800ml)。加入三苯基膦(548g)，搅拌直至所有固体溶解，冷却至5-9℃。加入二异丙基偶氮二羧酸酯(412ml)，温度维持在＜12℃，用时70分钟。混合物加热至21-25℃，搅拌1.5小时。反应混合物蒸馏浓缩至终体积2800ml。加入甲醇(2800ml)，再次浓缩至2800ml。再加入甲醇(2000ml)，混合物加热至55℃。在0.75小时后结晶浆液冷却至18℃，1小时后收集产物。产物层(bed)用甲醇(2×1200ml)洗涤，真空干燥，得到标题化合物(526.9g)。
X-光衍射图1中显示4-({[({[(2S)-4-(3，4-二氯苯基)吗啉-2-基]甲基}氨基)羰基]氨基}甲基)苯甲酰胺苯磺酸盐二水合物的X-光衍射数据。下面的表1列出了所用的仪器和参数。下面的表2列出了峰数据列表。
表1.用于收集数据的仪器和仪器参数
表2.峰数据列表(peak listing)
差示扫描量热法用差示扫描量热法测定4-({[({[(2S)-4-(3，4-二氯苯基)吗啉-2-基]甲基}氨基)羰基]氨基}甲基)苯甲酰胺苯磺酸盐二水合物的稳定性。表3列出了所用的仪器和参数，图2和图3中显示结果。
表3
热重量分新用热重量分析测量4-({[({[(2S)-4-(3，4-二氯苯基)吗啉-2-基]甲基}氨基)羰基]氨基}甲基)苯甲酰胺苯磺酸盐二水合物的稳定性。表4列出了所用的仪器和参数，图4显示结果。
表4
权利要求
1.式(I)化合物 其中A-代表苯磺酸盐(besylate)阴离子；R代表H或C1-6烷基；并且n为0.8到2.2的数字。
2.根据权利要求1的式(I)化合物，其中R是H。
3.根据权利要求1或2的式(I)化合物，其中n为1.1到2.1之间的数字。
4.根据权利要求1至3中任一项的式(I)化合物，其中n大约是2。
5.根据权利要求1至4中任一项的式(I)化合物，其是4-({[({[(2S)-4-(3，4-二氯苯基)吗啉-2-基]甲基}氨基)羰基]氨基}甲基)苯甲酰胺苯磺酸盐二水合物。
6.权利要求1所定义的式(I)化合物的制备方法，该方法包括式(IA)化合物； 与苯磺酸阴离子和合适的C1-6烷基醇及水组成的原料之间的反应。
7.权利要求1所定义的式(I)化合物作为治疗剂的应用，尤其是治疗患有炎症如哮喘或鼻炎的患者。
8.权利要求1所定义的式(I)化合物在制备治疗炎症如哮喘或鼻炎的药物中的应用。
9.治疗患有炎症或对炎症如哮喘或鼻炎易感的人类或动物患者的方法，该方法包括给予所述的人类或动物有效量的式(I)化合物。
10.药物组合物，包含权利要求1所定义的式(I)化合物，可选择的含有一种或多种生理上可接受的稀释剂或载体。
11.式(IIA)化合物
12.式(IIBR)化合物
13.式(IIBR)化合物
全文摘要
式(I)化合物，其中A
文档编号C07D301/00GK1642554SQ03807364
公开日2005年7月20日 申请日期2003年3月27日 优先权日2002年3月28日
发明者J·S·库克, R·P·兰顿, A·J·瓦尔克, M·威尔金逊 申请人:葛兰素集团有限公司