改变紫杉烷类和紫杉烷类相关化合物的生物合成的组合物和方法

专利名称：改变紫杉烷类和紫杉烷类相关化合物的生物合成的组合物和方法
技术领域：
本申请要求享有于2002年2月8号提交的第60/355,144号美国申请的专利优先权益，其全部公开内容均引入本文以供参考。
本发明提供了苯丙氨酸氨基变位酶的分离的核苷酸以及推得的氨基酸序列，还提供了纯化此酶的方法。本发明还提供了利用苯丙氨酸氨基变位酶基因改变植物细胞培养物中化合物的生物合成的方法。例如，将苯丙氨酸氨基变位酶基因转移到紫杉属植物细胞中改变这些细胞的紫杉烷类和紫杉烷类相关化合物的生物合成。本发明还涉及通过在生产培养基中给细胞单独补加β-苯丙氨酸或者补加β-苯丙氨酸与苯甲酸或其盐来改变体内紫杉烷类和紫杉烷类相关化合物的产生的方法。
背景技术：
紫杉醇用于各种癌症的治疗，包括但不仅限于卵巢癌、乳腺癌和肺癌。这个紫杉烷类双萜化合物首先由紫杉属紫杉科的植物短叶红豆杉(Taxus brevifolia)NUTT分离鉴定得到。紫杉醇在此植物体各部分均有存在，在树皮中含量最高。当前，紫杉醇由天然或种植的植物体收集得到。然而，紫杉属的植物生长极为缓慢，大约需要超过十年的时间才能长到离地面20厘米高度。而且，剥取树皮通常会导致树木死亡。这样，要从天然资源中获取治疗需要的大量紫杉醇如果不说是不可能，至少也会是极端的困难。
人们已经尝试用化学的方法合成紫杉醇。然而，紫杉醇分子很大，结构复杂，由可得到的简单化合物原料进行大规模的合成目前在商业上不是一个可行的选择。
用种植得到的紫杉醇前体10-去乙酰基浆果赤霉素经过化学连接上侧链来半合成生产的方法也已经有提出(美国专利4,924,011；美国专利5,015,744)。10-去乙酰基浆果赤霉素来自紫杉种树木的针状叶。但是，要获得这种前体决不简单并且针状叶中10-去乙酰基浆果赤霉素可能不像最初报道的那么高。因此，半合成制造的方法相当昂贵而且也不大可能满足化疗所需要的紫杉醇量。
最能够保证获得治疗需要的足量紫杉醇的方法是植物细胞培养。
多种通过植物细胞培养来生产紫杉醇和其它紫杉烷类或紫杉烷类相关化合物的方法已经有了描述。
美国专利5,019,504说明了通过培养短叶红豆杉细胞生产紫杉醇及其衍生物的方法。然而，其产量为1到3mg/L，并不足以用于工业生产。
美国专利5,015,744说明了通过植物细胞培养生产浆果赤霉素III的方法，可用于半合成生产紫杉醇。
美国专利5,407,816和WO 93/17121说明了由接种到营养培养基上的紫杉细胞生产紫杉醇以及紫杉醇类似化合物的方法。用这种方法，可以得到至少十倍于天然紫杉细胞的紫杉醇。利用该方法，红豆杉(Taxus chinensis)细胞紫杉醇和紫杉烷类的产量可达到153mg/L。然而，对营养培养基的要求相当复杂并且生长条件非常限定，这样工业应用此方法也很成问题。
利用在植物细胞培养基中添加刺激物来增加紫杉醇产量的方法也已经提出。例如，美国专利5,637,484说明了在培养基中加入茉莉酮酸酯和含银化合物来增加紫杉醇产量的方法。Yukimune等人(NatureBiotechnology 1996 141129-1132)和Mirjalili及Linden(Biotechnol.Prog.1996 12110-118)也发现添加茉莉酮酸甲酯以增加紫杉细胞培养中紫杉醇的产量。WO 97/44476说明了获得高产量的紫杉醇、浆果赤霉素III以及其它紫杉醇类似化合物的方法，该方法在培养紫杉细胞时增高了诸如银离子或复合物、茉莉酮酸、植物激素相关生长调节因子、苯丙酮酸通路抑制剂如3，4-亚甲二氧基-6-硝基肉桂酸等试剂。美国专利5,871,979说明了在含糖培养基中接种紫杉属植物细胞半连续培养以获得高产量的紫杉醇的方法。美国专利6,248,572也描述了在单独含糖或与AgNO3结合的含糖培养基中大规模培养紫杉属植物细胞生产紫杉醇的方法。EP 0 727 492 A2说明了植物细胞或组织中生产紫杉烷类双萜化合物的方法，该方法要求在冠缨碱、冠缨碱产生菌、这样的细菌的培养液或提取物、环多糖、脂肪酸或茉莉酮酸的亚氨基或氨基衍生物存在的条件下培养细胞或组织。Furmanowa等(Biotechnology Letters 2000 221449-1452)描述了通过添加硫酸氧钒、苯丙氨酸或壳聚糖在培养东北红豆杉(Taxuscuspidate)细胞时增加紫杉醇产量的方法以及通过添加氨基苯甲酸在培养Taxus media细胞时增加浆果赤霉素III产量的方法。此外，通过研究可以在体内增加紫杉醇产量的化合物发现β-苯丙氨酸可以提高紫杉醇产量；但是，在研究中使用的是α和β-苯丙氨酸的混合物。并没有单独使用β-苯丙氨酸(WO 97/44476)。
发明概要本发明的一个目的是提供从植物细胞纯化苯丙氨酸氨基变位酶的方法。作为一个优选的实施方案，苯丙氨酸氨基变位酶由紫杉属植物细胞纯化得到。
本发明的另一个目的是提供纯化的苯丙氨酸氨基变位酶。
本发明还有一个目的是提供编码苯丙氨酸氨基变位酶的分离的核酸序列。
本发明的再一个目的是提供含有编码苯丙氨酸氨基变位酶的核酸序列的载体以及提供含有可表达苯丙氨酸氨基变位酶的这些载体的宿主细胞。
本发明再有一个目的是提供通过苯丙氨酸氨基变位酶基因遗传转化来改变植物细胞培养物生物合成化合物的方法。在本发明的一个实施方案中，苯丙氨酸氨基变位酶基因遗传转化到植物细胞中，优选紫杉属植物细胞内，进而改变紫杉烷类和紫杉烷类相关化合物的生物合成。在此实施方案中，可将含有编码苯丙氨酸氨基变位酶的核酸序列的载体转化到细胞中从而增加了苯丙氨酸氨基变位酶的表达。
本发明再有一个目的是提供改变植物细胞培养物中紫杉烷类和紫杉烷类相关化合物的水平的方法，包括用β-苯丙氨酸(3-氨基-3-苯丙酸)培养植物细胞。在本发明的优选实施方案中，此方法还包括向植物细胞培养物中添加苯甲酸或其盐。
本发明再有一个目的是提供改变植物细胞培养物中紫杉醇与浆果赤霉素III比例的方法，包括用β-苯丙氨酸和/或苯甲酸或其盐培养植物细胞。
本发明仍有一个目的是利用纯化的苯丙氨酸氨基变位酶和/或编码苯丙氨酸氨基变位酶的分离的核酸序列鉴定其它物种的苯丙氨酸氨基变位酶基因，鉴定改变了其编码的蛋白的生物催化活性的苯丙氨酸基因突变，分离植物细胞中与苯丙氨酸氨基变位酶基因毗邻的基因组序列的方法。
附图简述

图1提供了一种生物合成紫杉醇的方案。数字标记的结构的化合物名称如下1，二磷酸香叶基香叶基酯；2，紫杉烷二烯；3，紫杉烷-4(20)，11-二烯-2-α-9，10β-13α-四羟基-5α-乙酸酯；4，苯甲酰基CoA；5，9，10β-13α-三羟基-5α-乙酸酯-2α-苯甲酸酯-紫杉烷-4(20)，11-二烯；6，α-苯丙氨酸；7，β-苯丙氨酸；8，苯基异丝氨酸；9，浆果赤霉素III；10，苯甲酸；11，去苯甲酰基紫杉醇；12，紫杉醇。
图2提供了编码苯丙氨酸氨基变位酶的核酸序列(SEQ ID NO1)，它起始于第9位核苷酸终止与2069位核苷酸。
图3为推得的苯丙氨酸氨基变位酶的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
图4提供了源自红豆杉的苯丙氨酸氨基变位酶(PAM)基因组聚合酶链式反应(PCR)产物(SEQ ID NO3)的核酸序列。起始的甲硫氨酸密码子(ATG)起始在63位核苷酸，终止密码子(TAG)起始在2239位核苷酸，片段全长2411个核苷酸。基因组片段含有一个起始于1154位核苷酸终止于1322位核苷酸的内含子。
图5提供了源自T.Media的苯丙氨酸氨基变位酶基因组PCR产物(SEQ ID NO4)的核酸序列。起始的甲硫氨酸密码子(ATG)起始在1位核苷酸，终止密码子(TAG)起始在2231位核苷酸，片段全长2233个核苷酸。基因组片段含有一个起始于1091位核苷酸终止于1260位核苷酸的内含子。
图6提供了源自加拿大红豆杉(T.Canadensis)的苯丙氨酸氨基变位酶基因组PCR产物(SEQ ID NO5)的核酸序列。起始的甲硫氨酸密码子(ATG)起始在1位核苷酸，终止密码子(TAG)起始在2231位核苷酸，片段全长2235个核苷酸。基因组片段含有一个起始于1091位核苷酸终止于1260位核苷酸的内含子。
图7是显示DL-β-苯丙氨酸(DL-3-氨基-3-苯丙酸)对分批培养红豆杉细胞中紫杉醇和浆果赤霉素III产量影响的条线图。每一个数值代表四个样本的平均数值。图7A显示在DL-β-苯丙氨酸为0(空心柱)、1mM(灰色柱)和5mM(实心柱)条件下培养1、2、3、4和5周后植物细胞中紫杉醇的产量。图7B显示在DL-β-苯丙氨酸为0(空心柱)、1mM(灰色柱)和5mM(实心柱)条件下培养1、2、3、4和5周后植物细胞中浆果赤霉素III的产量。
图8是显示DL-β-苯丙氨酸(DL-3-氨基-3-苯丙酸)和苯甲酸对分批培养红豆杉细胞中紫杉醇和浆果赤霉素III产量影响的条线图。每一个数值代表六个样本的平均数。图8A显示对照细胞(空心柱)、暴露在DL-β-苯丙氨酸下的细胞(灰色柱)和暴露在DL-β-苯丙氨酸和苯甲酸下(实心柱)培养2、3、4和5周后细胞中紫杉醇的产量。图8B显示对照细胞(空心柱)、暴露在DL-β-苯丙氨酸下的细胞(灰色柱)和暴露在DL-β-苯丙氨酸和苯甲酸下(实心柱)培养2、3、4和5周后细胞中浆果赤霉素III的产量。
图9提供了苯丙氨酸氨基变位酶与源自火炬松(Pinus taeda)的苯丙氨酸氨基裂解酶的推得的氨基酸序列的对比。相同的氨基酸残基以高亮显示。
发明详述紫杉醇是由衍生自苯丙氨酸的C13侧链与高度修饰的二萜(浆果赤霉素III)构成的很复杂的二萜类生物碱。就C13侧链针对多种潜在中间体进行补料研究得到的生物化学证据提供了以下的生物合成方案(也见图1)。第一步是将α-苯丙氨酸变成β-苯丙氨酸(3-氨基-3-苯丙酸)。接着羟化β-苯丙氨酸生成苯基异丝氨酸，将苯基异丝氨酸转移到浆果赤霉素III的C13羟基基团上(Fleming等人.J.Am.Chem.Soc.1994 1164137-4138)。得到的去苯甲酰基紫杉醇再苯甲酰化即生成了紫杉醇(Fleming等人.J.Am.Chem.Soc.1994 1164137-4138)。另已发现β-苯丙氨酸是紫杉醇合成最终酶促步骤里转移到C13侧链上的苯甲酸部分的来源(Fleming等人.J.Am.Chem.Soc.1994 1164137-4138)。
浆果赤霉素III的生物合成路径由普遍存在的初级代谢物二磷酸香叶基香叶基酯开始，经过随后的13到15个酶促步骤，最后对10-去乙酰基浆果赤霉素III进行酰基转移得到浆果赤霉素III(Fleming等人.J.Am.Chem.Soc.1994 1164137-4138)。如图1所示，浆果赤霉素III在C2位苯甲酰化，这表明浆果赤霉素III的生物合成需要苯甲酸的来源。使用苯甲酸和β-苯丙氨酸进行的补料研究显示苯甲酸来源于将并入紫杉醇C13侧链的β-苯丙氨酸，这就说明紫杉细胞内有两种苯甲酸供应池，针对C13侧链的一种源于β-苯丙氨酸，而另一种针对浆果赤霉素III的源于传统的苯丙氨酸到肉桂酸通路(Bjorklund and Leete，Phytochemistry 1992 313883)。两种截然不同的苯甲酸供应池的存在表明了在浆果赤霉素III生物合成路径与C13侧链/紫杉醇之间存在空间的分隔。
在紫杉醇的生物合成中苯丙氨酸氨基变位酶催化α-苯丙氨酸转化成β-苯丙氨酸是实行的第一步反应，而且β-苯丙氨酸经鉴定是侧链生物合成的第一个中间体，这表明对β-苯丙氨酸和苯丙氨酸氨基变位酶的调控会对紫杉醇的生物合成产生直接的影响。本发明通过提供苯丙氨酸氨基变位酶的纯化方法、分离苯丙氨酸氨基变位酶的cDNA、阐明添加β-苯丙氨酸和/或苯甲酸对紫杉醇的产量和紫杉醇与浆果赤霉素III的比例的改变来实现对紫杉烷类成分及其水平的调控。因此，本发明提供了用于改变如紫杉醇和像浆果赤霉素III、浆果赤霉素VI这样的紫杉烷类相关化合物的生物合成的组合物和方法。此外，本发明的组合物可按照众所周知的技术用来鉴定其它物种的苯丙氨酸氨基变位酶基因。能产生生物催化活性改变的酶的苯丙氨酸氨基变位酶基因突变体也可用众所周知的技术得到。而且，利用苯丙氨酸氨基变位酶基因序列采取常规技术可分离毗邻此基因的含有调节基因表达的顺式作用元件的基因组序列。
“苯丙氨酸氨基变位酶”是一种能够催化氨基基团从L-α-苯丙氨酸2位转移以形成3-氨基-3-苯丙酸(β-苯丙氨酸)的酶。
在本发明的一个方面，提供了从植物细胞培养物纯化同性质的苯丙氨酸氨基变位酶的方法。而且，还提供了纯化的苯丙氨酸氨基变位酶。
这里的“纯化”或“纯化的”是指苯丙氨酸氨基变位酶经SDS-PAGE检测同质性等于或者更优选大于95％。
这样的纯化方法中，首先制得植物细胞的粗提物。在优选的实施方案中，粗提物经将冰冻的植物细胞悬浮在含有二硫苏糖醇(DTT)的磷酸钾缓冲液中。处理提取物以除去苯酚化合物，优选通过添加XAD-4树脂(Sigma Aldrich Corp.，St.Louis，MO)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP；Sigma Aldrich Corp.，St.Louis，MO)来进行。接着在4℃搅拌提取物数小时后再离心，优选以10,000×g离心两小时以除去细胞碎片和苯酚化合物。而后浓缩上清液，优选浓缩至约50ml，并且通过加入至少200ml含有DTT的磷酸钾缓冲液来透析该浓缩级分。透析后的级分通过超滤去除其中的β-苯丙氨酸而浓缩。粗提物经过上述步骤后的全部体积约为约40到50ml并含有100到150mg蛋白。
接着将蛋白从粗提物中沉淀下来，优选通过添加分成两等份的固体硫酸铵的方法。硫酸铵分级沉淀的方法可得到良好的收率和适中的纯度。在此步骤中，搅拌加入一等份的硫酸铵固体成30％饱和度的溶液。将溶液离心，优选以10,000×g离心60分钟，弃去沉淀。而后，搅拌加入另一等份的硫酸铵固体成50％饱和度的溶液，再次以10,000×g将溶液离心60分钟，留得沉淀。苯丙氨酸氨基变位酶接着通过两步附加步骤纯化150倍以上。
这些附加步骤的第一步，第二次加硫酸铵浓度为50％时得到的沉淀溶解于含1mM DTT和1mM MgCl2的Tris-HCl(pH7.0)缓冲液。此溶液接着上用同样的缓冲液平衡过的亲和色谱柱，例如含有连接到葡聚糖上的染料的Reactive Green 19(Sigma Aldrich Corp.，St.Louis，MO)色谱柱(2×10cm)，收集流出液和额外的15ml洗涤液。这步亲和层析步骤对于纯化方案中将苯丙氨酸氨基变位酶同另一种紧密相关的酶，即苯丙氨酸氨基裂解酶分离开至关重要。苯丙氨酸氨基裂解酶与之有相同的底物并且分子量也近似。因为苯丙氨酸氨基裂解酶只有在Mg2+存在的条件下才与亲和色谱柱相结合，因而Mg2+对于此步骤也极为重要。
接着，经过超滤混合并且透析流出液和洗涤液级分，最后的缓冲液变为含1mM DTT和1mM MgCl2，pH为9.0的Tris-HCl缓冲液，终体积为7-8ml。
得到的7-8ml再过第二个亲和层析柱，优选含有Heparin-Agarose Type I(Sigma Aldrich Corp.，St.Louis，MO)的10ml(2×10cm)柱，该柱用含1mM DTT和1mM MgCl2、pH为9.0的Tris-HCl缓冲液平衡。用约30ml的这种缓冲液洗柱。用含有0.1M NaCl的此缓冲液将酶洗脱。洗脱液可进一步浓缩。最后一步的产量相对较低，主要原因是肝素-琼脂糖与苯丙氨酸结合作用弱。典型的结合在缓冲液的pH低于9.0时不会发生。相应的，缓冲液的pH值优选为至少9.0。
从植物细胞培养中典型的纯化苯丙氨酸氨基变位酶的结果总结在表1中。
表1.苯丙氨酸氨基变位酶的纯化(PAM)
每一步都用SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离蛋白来验证苯丙氨酸氨基变位酶的纯化均一。
接着测定纯化的苯丙氨酸氨基变位酶的特性。经SDS-PAGE检测变性的苯丙氨酸氨基变位酶的分子量约为80KDa，而天然的苯丙氨酸氨基变位酶的分子量测定为162KDa。这些结果显示苯丙氨酸氨基变位酶是同源二聚体蛋白。不同于赖氨酸氨基变位酶，纯化的苯丙氨酸氨基变位酶的活性不依赖于任何辅助因子。吡啶醇-5-磷酸酯(PLP)和S-腺苷甲硫氨酸(SAM)都不能影响酶的活性，并且酶在没有任何辅助因子的情况下也会发挥完全的功能。底物特异性研究显示L-α-苯丙氨酸是该酶的唯一底物。D-α-苯丙氨酸或其它氨基酸经检验都不能作为纯化的苯丙氨酸氨基变位酶的底物。
用一级动力学模式测量纯化的苯丙氨酸氨基变位酶动力学常数。当Vmax值是303.1μg/min/mg蛋白时L-α-苯丙氨酸的Km值是1.1mM。纯化的苯丙氨酸氨基变位酶在4℃和室温下都相对稳定。
用乙酸钠、磷酸钾和不同pH的Tris-HCl来测定苯丙氨酸氨基变位酶的最佳pH值。结果发现在50mM磷酸钾或50mM的Tris-HCl缓冲液存在下苯丙氨酸氨基变位酶的最佳pH值在7.5到8.0之间。
对纯化的苯丙氨酸氨基变位酶进行了测序。更具体的，用EnhancedHewlett-Packard G1005A氨基酸测序仪(Hewlett-Packard，PaloAlto，CA)对全蛋白和用反相HPLC纯化的胰酶消化片段进行N-末端测序。每个样本都分析15到20个循环并且将测定的氨基酸残基和循环列在表2中。
大写字母代表最高可信度的，小写字母代表适中的可信度的，在圆括号的小写字母代表低可信度的。
表2PAM肽的氨基酸序列
在本发明的另一方面，提供了编码苯丙氨酸氨基变位酶的分离的核酸序列并因而提供了其编码的多肽。编码苯丙氨酸氨基变位酶的cDNA在图2中SEQ ID NO1有列出。甲硫氨酸起始密码子(ATG)开始于第9位核苷酸，终止密码子(TAG)开始于第2136位核苷酸，cDNA全长2277个核苷酸。推得的苯丙氨酸氨基变位酶多肽的氨基酸序列在图3中SEQ ID NO2有列出。由纯化的苯丙氨酸氨基变位酶得到的九个肽中(表二中所列)有八个在推得的苯丙氨酸氨基变位酶氨基酸序列里出现，这确证已单独的正确的cDNA。
用Basic Logic Alignment Search Tool(BLAST，MCBI，Bethesda，MD；Altschul等人.J.Mol.Biol.215(3)4-3-410(1990))搜索显示苯丙氨酸氨基变位酶与苯丙氨酸氨基裂解酶相关。例如，BLAST搜索显示，从火炬松分离的cDNA所推得的苯丙氨酸氨基裂解酶氨基酸序列(Genbank Accession number AAA84889)与苯丙氨酸氨基变位酶的有43％相同和68％近似。图9提供了这些序列的对比，揭示至少有四个确信为有显著功能且可用于设计简并PCR引物以从其它植物物种中获得苯丙氨酸氨基变位酶的高度保守的氨基酸区域。这四个区域位于图9所示苯丙氨酸氨基变位酶氨基酸序列的79-87，423-428，453-460和477-482处。
三种名为红豆杉、T.Media和加拿大红豆杉的不同紫杉中编码苯丙氨酸氨基变位酶的基因组PCR产物的核酸序列分别在图4(SEQ IDNO3)、图5(SEQ ID NO4)和图6(SEQ ID NO5)中列出。在SEQ IDNO3核酸序列中，甲硫氨酸起始密码子(ATG)开始于第63位核苷酸，终止密码子(TAG)开始于第2293位核苷酸，片段全长2411个核苷酸。基因组片段含有一个起始于1154位核苷酸终止于1312位核苷酸的内含子。在SEQ ID NO4核酸序列中，甲硫氨酸起始密码子(ATG)开始于第1位核苷酸，终止密码子(TAG)开始于第2231位核苷酸，片段全长2233个核苷酸。基因组片段含有一个起始于1091位核苷酸终止于1260位核苷酸的内含子。在SEQ ID NO5核酸序列中，甲硫氨酸起始密码子(ATG)开始于第1位核苷酸，终止密码子(TAG)开始于第2231位核苷酸，片段全长2235个核苷酸。基因组片段含有一个起始于1091位核苷酸终止于1260位核苷酸的内含子。
用反向的遗传学方法实现苯丙氨酸氨基变位酶cDNA的分离和功能表达。由纯化的苯丙氨酸氨基变位酶蛋白产生的九个肽(见表2)中的四个设计得到表3所示的简并引物。
表3选择的苯丙氨酸氨基变位酶肽的简并引物
在基于八个肽序列中的四个重新设计简并引物之后，经3’RACE PCR合成两个DNA片段(长度约800和600bps)。反应的体系包括诱导的载体cDNA文库模板和用于定位的简并引物PAM1.2(设计针对中间肽，LSDRLENEMTAVR(SEQ ID NO10))和M13F引物(5’TGACCGGCAGCAAAATG3’(SEQ ID NO30))。对两个片段测序显示与由poly A添加位点起600bp的片段100％相同，而800bp片段则是在3’端再伸长200bp，这说明这些片段是同一基因利用不同poly(A)添加位点的例子。
为了克隆cDNA的5’末端，用MARATHONTMcDNA扩增试剂盒(Clontech，Palo Alto，CA)合成RACE(Rapid Amplification of cDNAEnds)文库。该文库是利用分离自在生产培养基中生长6天的红豆杉细胞的mRNA构建的。针对600bp PAM 3’RACE片段设计5’RACE基因特异性引物(5’TGCATCGAACACTTTCTGCACGTCCTCT3’)。PCR得到的扩增片段长为2.2kb，将其亚克隆到PCR-ScriptTM(Stratagene，La Jolla，CA)中。全长的cDNA采用在起始的ATG处含有限制性酶NdeI酶切位点的5’特异引物pam93mutTCCTTGCTCTCATATTATGGGGTTTGC(SEQ IDNO32)，以及含有限制性酶BamHI酶切位点并含有227个核苷酸的3’非翻译区的3’特异引物pam2350mutcGGGATCCTTTTAAAACAAAAATTAATTAGGGTT(SEQ ID NO33)单独的。获得的全长的苯丙氨酸氨基变位酶cDNA亚克隆到PCR-ScriptTM(Stratagene，La Jolla，CA)中并且测序。此序列在图2中列出。经NdeI、BamHI酶切的苯丙氨酸氨基变位酶DNA片段亚克隆到pBMS2000大肠杆菌蛋白表达载体(在美国专利6,068,991中有说明，在此完整的引入作为参考)并且接着转化大肠杆菌菌株EpicuriancoliXL1-Blue(Stratagene，La Jolla，CA)。接下来进行表达和酶活性分析，每毫克大肠杆菌蛋白中此功能性的酶平均合成558ng的β-苯丙氨酸。表达具有此功能的酶决定性的证明了已经扩增和克隆了苯丙氨酸氨基变位酶cDNA。
图4中列出了基因组DNA，SEQ ID NO3。它由基因特异性引物PAM5F2TCAGTTTTATCTCGCTCAAGT(SEQ ID NO34)以及PAM3RTACAGTCGCTTCTGCGGAAT(SEQ ID NO34)经PCR产生，引物设计针对的是苯丙氨酸氨基变位酶cDNA和由红豆杉细胞系P97-1细胞培养物中分离的基因组DNA的5’和3’非翻译区。基因组PCR的产物直接测序。这样，由于产物仅有很小百分比的序列不一致，在等位基因间只引起轻微的不同，可认为该序列与苯丙氨酸氨基变位酶序列一致。克隆得到的cDNA和基因组PCR产物在核苷酸水平上有99.8％的一致性，在氨基酸水平上也有99.7％一致性(见表4)。
源自其它两种T.Media和加拿大红豆杉的基因组PCR产物也用类似的方法合成和测序。为了确保PCR得到特异性的产物，设计针对苯丙氨酸氨基变位酶编码区的起始和终止处的5’引物pam63ATGGGGTTTGCCGTGGAATCG(SEQ ID NO36)和3’引物pam2173cCTAGACGCCGTTGGCGCA(SEQ ID NO37)。T.Media的序列在图5 SEQID NO4中列出，加拿大红豆杉的序列在图6 SEQ ID NO5中列出。两序列都含有一个起始于1091位核苷酸终止于1260位核苷酸的内含子。
所有三种苯丙氨酸氨基变位酶序列都高度保守。红豆杉在核苷酸水平上与T.Media有98.6％相同，与加拿大红豆杉有98.7％相同。导致氨基酸改变的不同之处列在表4中。
表4在苯丙氨酸氨基变位酶cDNA和基因组PCR片段中鉴定的氨基酸差异。
I为PAM红豆杉cDNAII为PAM红豆杉基因组III为PAM T.Media cDNAIV为PAM加拿大红豆杉cDNA由于遗传密码有简并性，本发明相关的核酸序列也可以含有不同于图2、4和5所示的核酸序列，它们编码同样的苯丙氨酸氨基变位酶。本发明相关核酸序列还包括在严格的条件下能与上述核酸序列杂交的多聚核苷酸。在此处，“严格的条件”是指至少有60％，更优选至少80％同源性，在60℃、2×SSC缓冲液条件下进行杂交。更优选的是能与图2、4或5所示核酸序列或者与图2、4或5所示核酸序列的互补序列杂交的分离的核酸分子，杂交的条件3×SSC缓冲液、65℃下16小时，且这些核酸分子在0.5×SSC缓冲液、55℃下30分钟的洗涤条件下能与图2、4或5所示核酸序列或者图2、4或5所示核酸序列的互补序列保持杂交状态。本发明相关的核酸序列也包含片段、衍生物或者各种编码这些酶的衍生物、突变型或活性片段的核酸序列。术语“突变型”包括天然产生的突变型如等位基因突变型，也包括用众所周知的诱变技术产生的诱变型。对于突变型或核酸序列衍生物来说，差异一般有限，这样由这些核苷酸编码的多肽具有与苯丙氨酸氨基变位酶近似的活性。本发明“近似的活性”意味着酶的变异型依然能够催化氨基基团从L-α-苯丙氨酸2位转移形成3-氨基-3-苯丙酸。因此，本发明相关的突变型或衍生物的核酸序列的改变可能属于沉默突变。这就是说，它们可能不更改核苷酸编码的氨基酸。另一种情况是，核酸序列的改变与苯丙氨酸氨基变位酶相比改变了氨基酸序列。这样的改变可能包括与苯丙氨酸氨基变位酶相比氨基酸的替代、添加、删除、融合和截短。“片段”是指与SEQ ID NO1、3、4或5或2相比分别含有较少的核苷酸或氨基酸的核酸序列或编码多肽。当提到核酸序列时，本发明优选的片段、突变型和衍生物是那些编码保留有如同苯丙氨酸氨基变位酶的生物功能的多肽的核酸序列。当提到多肽时，本发明优选的片段、突变型和衍生物是那些编码保留有如同苯丙氨酸氨基变位酶的生物功能的多肽。这样的优选片段可通过测定其催化氨基基团从L-α-苯丙氨酸2位转移形成3-氨基-3-苯丙酸的酶活性来鉴定。
除了在生产苯丙氨酸氨基变位酶方面有用外，本发明的核酸序列也用于分离毗邻苯丙氨酸氨基变位酶基因的基因组序列，作为杂交探针分离其它物种的苯丙氨酸氨基变位酶基因或近似基因，鉴定改变了其编码的酶的生物催化特性的突变。
例如，毗邻苯丙氨酸氨基变位酶基因的调控基因组序列可以采用众所周知的技术确定基因中本发明相关的核酸序列并分离毗邻的基因组序列而鉴定出来。这些序列含有调控基因表达的顺式作用元件。因此，这些序列的获得可能对于鉴定苯丙氨酸氨基变位酶基因表达的调控单位有用。
本发明的核酸序列，特别是其片段也可作为杂交探针用于在其它物种中鉴定和分离苯丙氨酸氨基变位酶基因或近似基因。这些探针的制备和使用采用与这里提供的常用方法一致的手段，与众所周知的技术一致。
本发明相关的核酸序列还用来鉴定编码那些与野生型苯丙氨酸氨基变位酶相比生物催化活性改变的蛋白的突变型苯丙氨酸氨基变位酶基因。在本发明的这个方面，编码野生型苯丙氨酸氨基变位酶的分离的核酸序列，例如图2、4或5所示的核酸序列，用众所周知的标准技术进行突变。接着表达由这些突变的核酸序列编码的多肽，并且评估表达的多肽的一个或更多的生物催化性质。可检测的多肽的生物催化性质包括但不限于底物特异性、Km、转化率、最佳pH、最佳温度和溶剂环境。接着将表达的多肽中一个或更多的生物催化性质与苯丙氨酸氨基变位酶作相应的比较，鉴定出使多肽相对于野生型的苯丙氨酸氨基变位酶生物催化活性发生变化的任何核酸序列突变。
已知有多种增加植物细胞中生物合成酶的基因表达水平致使全部特异的次级代谢产物增加的例子。例如，紫花苜蓿对受伤的反应是合成大量的异黄酮类植物抗毒素。因为此生物合成途径需要8到12种酶，它与紫杉醇需要12到14种酶的路径类似。已经证实通过增强甲基转移酶的表达植物抗毒素显著增加(He，X.Z.and Dixon，R.A.ThePlant Cell 2000 12(9)1689-1702)。此外，当薄荷中生物合成路径中一种还原异构酶在遗传上过表达时，单萜的产量增加(Mahmound，S.S.and Croteau，R.B.Proc.Natl Acad.Sci.USA2001 988915-8920)。有趣的是，Mahmoud和Croteau还发现在基因经遗传调控使其低表达时单萜的成分可发生改变。过度表达苯丙氨酸氨基变位酶可望增加紫杉醇的滴度并且在下游步骤中以相似的方式提高紫杉醇与浆果赤霉素III的比例。作为对比，显著减少苯丙氨酸氨基变位酶的表达可望降低紫杉醇的水平并且增加包括但不仅限于浆果赤霉素III、浆果赤霉素IV的浆果赤霉素含量。
在将编码苯丙氨酸氨基变位酶的核酸序列加入植物细胞的实施方案中，优选的是用含有核酸序列的载体进行遗传转化。在含有本发明相关核酸序列的载体进行转化后的宿主细胞中酶可以实现过度表达。例如，本申请书实施例4说明了用含有本发明相关核酸序列的载体转化大肠杆菌并在宿主细胞中表达苯丙氨酸氨基变位酶的一种方法。然而，苯丙氨酸氨基变位酶的底物L-α-苯丙氨酸在所有的活生物中广泛存在。因此，苯丙氨酸氨基变位酶基因可能在几乎所有的酵母、细菌或哺乳动物宿主细胞。
因此，本发明的另一方面涉及含有编码苯丙氨酸氨基变位酶的核酸序列的载体以及含有这些载体并表达苯丙氨酸氨基变位酶的宿主细胞。
本发明的另一方面涉及改变通过生物合成生产紫杉烷类和紫杉烷类相关化合物产量的方法，包括给生产培养基补加β-苯丙氨酸和/或苯甲酸或其盐。此外，给生产培养基补加β-苯丙氨酸和/或苯甲酸或其盐提高了紫杉烷类相对于紫杉烷类相关化合物的比例。
在添加有1mM DL-β-苯丙氨酸的情况下分批培养红豆杉细胞，观察到紫杉醇的产率得到了提高。进而，仅到了培养的第二周，对照组浆果赤霉素III的滴度就与5mM DL-β-苯丙氨酸的一批显示出显著的差别。这些实验的结果显示在图7中。在添加有5mM DL-β-苯丙氨酸的情况下，观察发现在第二周末紫杉醇增加了40％(见图7A)并且浆果赤霉素III减少了80％(见图7B)。然而，紫杉醇产量的增加程度在随后的几周降低了并且在第五周末与对照组相比不再显著增加。这些结果告诉我们5mM DL-β-苯丙氨酸在短期内可保证浆果赤霉素III向紫杉醇的快速转化。培养基中添加有1mM DL-β-苯丙氨酸的细胞同样表现出紫杉醇产率的增高，并且在第五周末与对照组相比多产了26％的紫杉醇(192单位/L对对照组的152单位/L)。
在用DL-β-苯丙氨酸和苯甲酸分批培养的红豆杉细胞中也同样观察到了紫杉醇产量的上升。实验的结果显示在图8中。在2.2mM DL-β-苯丙氨酸存在下，细胞在第五周末与对照组相比多产生了29％的紫杉醇(171单位/L对对照组的132单位/L)(见图8A)。在培养基中补加DL-β-苯丙氨酸和苯甲酸的混合物，细胞在第五周末与对照组相比进一步提高到多产生43％的紫杉醇(189单位/L对对照组的132单位/L)(见图8A)。而在任何补料分批培养中都没观察到浆果赤霉素III滴度有降低，在单独补加DL-β-苯丙氨酸(2.9)或同时添加苯甲酸(3.6)时培养的细胞中紫杉醇与浆果赤霉素III的比例都高于对照组的(2.2)(见图8B)。
这些结果表明β-苯丙氨酸和苯甲酸都提高了红豆杉细胞中紫杉醇的产量。相应的，在植物细胞培养基中单独补加β-苯丙氨酸或者苯甲酸或其盐，或者更优选的将β-苯丙氨酸与苯甲酸或其盐一起补加，为提高如紫杉醇这样的紫杉烷类的产量提供了有效手段。
现举出如下非限定性的实施例来进一步说明本发明。
实施例实施例1苯丙氨酸氨基变位酶蛋白的分离和表征酶的分析和HPLC方法标准的PAM活性分析体系中含有5mM L-α-苯丙氨酸、1到10μg酶及50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)，终体积为0.5ml。酶反应在28℃下150rpm进行18个小时后加50μl乙醇沉淀蛋白来终止。离心5分钟后，用反相HPLC分析上清液。生成的β-苯丙氨酸由其峰区域同β-苯丙氨酸标准曲线的对比来进行定量。酶活性是通过每小时每毫克蛋白生成多少微克β-苯丙氨酸来表述的。HPLC使用的是YMC Ph柱(4.6×150mm；Waters，Milford，MA)，流速1.2ml/min。在210nm波长监测吸收情况。此方法使用两种溶剂A水和B CH3CN，0％到12％B的梯度6分钟，1分钟后12％到90％的B，再1分钟回到0％。L-α-苯丙氨酸和β-苯丙氨酸的保留时间分别为4.3分钟和3.5分钟。
蛋白分析用正比(propositional)蛋白结合染色法和由Bio-RadLaboratories(Hercules，CA)购买的微量分析试剂盒来检测蛋白的浓度。
酶的纯化为制备粗提物，将100克(湿重)冰冻的植物细胞悬浮于含有1mM二硫苏糖醇(DTT)、50mM磷酸钾的500ml冷的缓冲液(pH7.5)中。加入50克非离子聚合吸附剂的XAD-4树脂(Sigma Aldrich Corp.，St.Louis，MO)和50克PVP后，提取物在4℃搅拌2小时，接着在10,000×g下离心2小时。通过用PM-30膜(Amicon，Inc.Beverly，MA)经超滤浓缩仪将上清浓缩到约50ml，浓缩的级分进一步用至少200ml的缓冲液透析并用超滤浓缩去除内源的β-苯丙氨酸。一般经过上述步骤后粗提物的终体积约40到50ml，含蛋白100到150mg。
在搅拌下向粗提物中加入硫酸铵固体成30％饱和度的溶液。将溶液离心，优选以10,000×g离心60分钟，弃去沉淀。而后，在搅拌下加入硫酸铵固体成50％饱和度的溶液，再次以10,000×g将溶液离心60分钟，留取沉淀。
硫酸铵浓度为50％时得到的沉淀溶解于15ml含1mM DTT和1mMMgCl2的10mM Tris-HCl(pH7.0)缓冲液。将此溶液接着上含有连接到葡聚糖上的染料的Reactive Green 19(Sigma Aldrich Corp.，St.Louis，MO)色谱柱(2×10cm)，亲和色谱柱先用含1mM DTT和1mM MgCl2的10mM Tris-HCl(pH7.0)缓冲液平衡过，收集流出液和额外的15ml洗涤缓冲液。经过超滤混合并且透析流出液和洗涤液级分，最后的缓冲液变为含1mM DTT(二硫苏糖醇)和1mM MgCl2的Tris-HCl缓冲液(pH9.0)，终体积为7-8ml。
接着将活性级分上10ml Heparin-Agarose Type I(SigmaAldrich Corp.，St.Louis，MO)柱(2×10cm)，色谱柱预先用含1mM DTT和1mM MgCl2的Tris-HCl(pH 9.0)缓冲液平衡过。用约30ml的这种缓冲液洗柱，用含有0.1M NaCl的此缓冲液将酶洗脱。洗脱液可进一步浓缩到很小的体积。
SDS-PAGE用来自Bio-Rad(Hercules，CA)的10％成品凝胶来进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。凝胶用考马斯亮蓝染色。用来自Bio-Rad(Hercules，CA)的大范围蛋白标准品来估计变性的酶的分子量大小。
测定天然分子量用含1mM DTT的10mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)平衡的SephacrylS-200 HR(Sigma Aldrich Corp.，St.Louis，MO)100ml凝胶过滤柱(2.5×3.5cm)，进行分子排阻色谱分析。将酶的样品和来自Bio-Rad(Hercules，CA)的分子量标准品(670KDa、158KDa、44KDa、17KDa、1.35KDa)上柱。柱子用缓冲液以1ml/min的速度洗脱，每4ml收集一次在280nm监测的级分。酶的天然分子量通过与洗脱体积的标准曲线比较可计算得到。
其它测定制备纯化的酶用来测定酶得性质，包括所需辅助因子、底物特异性、动力学常数、热稳定性和最佳pH。测定所需辅助因子时，标准反应体系含有1mM的吡啶醇-5-磷酸酯(PLP)或S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，用HPLC分析生成的β-苯丙氨酸。为测定底物特异性，L-和D-型的各种氨基酸，包括但不仅限于赖氨酸、酪氨酸、色氨酸和组氨酸以5mM的浓度替代标准反应体系中的L-α-苯丙氨酸。测定动力学常数时，反应混合液中L-α-苯丙氨酸的浓度在0.156mM到15mM的范围内变动以测量酶的活性。热稳定性和最佳pH通过在不同温度或不同pH的缓冲液中培养酶反应混合物来测得。
苯丙氨酸氨基变位酶肽谱纯化的苯丙氨酸氨基变位酶蛋白跑SDS-PAGE胶，用PVDF(聚二氟乙二烯)膜(Bio-Rad，Hercules，CA)上进行印迹实验，且下约80KDa处的条带。所有的蛋白分析操作都按照Hewlett-Packard(PaloAlto，CA)测序方案来进行(Miller C.G..，蛋白序列分析和化学修饰中的二相吸附柱技术。方法酶学方法的伙伴第6卷No.3，315-333页，(Academic Press)，1994年9月)。结合到PVDF的样品(约4μg)和PVDF对照样品均用Hewlett-Packard Protein Chemistrystation进行烷化。PVDF条在50℃下氩气的环境中用含有10mM二硫苏糖醇用pH8.3的6M胍处理，随后用溶于同样溶媒的2M丙烯酰胺进行烷化。PVDF条接着置于含有100ng修饰的猪胰蛋白酶(Promega，Madison，WI)、1％氢化的Triton X-100、10％乙腈、20mM碳酸氢铵和5mM碳酸铵(pH 8)的溶液中。接着在40℃温育4小时，向反应混合物另加100ng胰酶继续温育到总共12小时。将溶液上RP-18柱(EMScience，Hawthorne，NY)，接着在进行HPLC分析前用1ml 2％三氟乙酸(TFA)洗柱。
实施例2分离苯丙氨酸氨基变位酶cDNARNA的提取从在营养培养基(对照)和生产培养基(诱导)生长6天的紫杉细胞中提取RNA。用Qiagen，Inc.(Valencia，CA)的RNA提取试剂盒按照产品说明提取总RNA，其中两处有所修改。提取缓冲液的体积增加两倍以保证说明书上建议的组织重量与缓冲液体积的比例。按照Levinsohn等人(Plant Mol.Bio.Rep.1994 12(1)20-25)用10％乙醇沉淀来去除多聚糖杂质。按照产品说明书用Qiagen，Inc.(Valencia，CA)的乳胶珠分离得到Poly A RNA。
载体cDNA文库的构建，噬菌体DNA的分离以及RACE(cDNA末端快速扩增)cDNA文库的构建用Stratagene(La Jolla，CA)的cDNA合成试剂盒以5μg诱导mRNA按产品说明书合成载体cDNA。用Ausubel等人(分子生物学的当前方案当前方案1987卷11.13.7)中描述的方法将含有紫杉cDNA的细菌噬菌体DNA从大肠肝菌DNA杂质中分离出来。用MARATHONTMcDNA扩增试剂盒(Clontech，Palo Alto，CA)以1μg诱导的poly A RNA按照产品说明书构建RACE文库。
PCR方案和DNA测序用Taq DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)按照产品说明书进行PCR扩增。PCR采用RACE文库为模板，用ADVANTAGETM2 PCR试剂盒Clontech，Palo Alto，CA)按照产品说明书进行。DNA测序用ABIPRISMBig DyeTM终止循环测序试剂盒(Applied Biosystem，FosterCity，CA)按照产品说明书进行。
实施例3通过给生产培养基补加DL-β-苯丙氨酸和苯甲酸来提高紫杉醇的生物合成将红豆杉植物细胞以200克/L的密度接种到生产培养基中。采用以下两步进行培养。
首先用含有1或5mM的DL-β-苯丙氨酸的TAXOL生产培养基进行分批培养，该培养基含培养基N另加上α-萘乙酸、3，4-(亚甲二氧基)肉桂酸、茉莉酮酸甲酯和硫代硫酸银(WO97/44476)。未加入DL-β-苯丙氨酸的生产培养基作为对照。连续五周每周收集样品用高压液相色谱法(HPLC)分析。
第二个培养步骤是补料分批培养，它最开始使用的培养基中含1.2X强度的缺乏谷氨酰胺的培养基N，另加上3，4-(亚甲氧基)肉桂酸和硫代硫酸银(WO97/44476)。接着从第3天到第35天添加甲基茉莉酮酸酯、α-萘乙酸、谷氨酰胺和DL-β-苯丙氨酸。按5ml/L/天的添加比例每三到四天添加一次。在五周的生产期内添加的DL-β-苯丙氨酸总量是2.2mmol/L。用缺乏DL-β-苯丙氨酸的补料溶液进行补料分批培养作为对照。同时也进行使用DL-β-苯丙氨酸以及苯甲酸的补料分批培养。在五周的生产期内补加的DL-β-苯丙氨酸和苯甲酸总量都是2.2mmol/L。在第2、3、4和5周末取样作HPLC分析。
实施例4在大肠杆菌表达体系中表达苯丙氨酸氨基变位酶为在大肠杆菌中表达苯丙氨酸氨基变位酶，将cDNA(SEQ ID NO1)亚克隆到pBMS2000大肠杆菌蛋白表达载体并且接着转化大肠杆菌菌株Epicurian coliXL1-Blue(Stratagene，La Jolla，CA)。接下来通过NdeI、BamHI酶切来确认克隆的正确，将质粒命名为pPAM2000而且开始苯丙氨酸氨基变位酶cDNA的蛋白表达。
将含有pPAM2000或pBMS2000的XL1-Blue细胞培养过夜并接种到新鲜的LB培养基上30℃下培养。当培养物的光密度为0.5-1.0时，加入100μM IPTG诱导它们合成苯丙氨酸氨基变位酶蛋白。以5000×g离心10分钟的条件下收集菌体，在检测缓冲液(50mM Tris pH7.5)中洗涤，重悬于检测缓冲液。用超声裂解菌体(2×20脉冲，冰上)。加入L-α-苯丙氨酸检测酶活。样品在18℃下反应过夜后加乙醇终止。样品16,000g下离心10分钟。上清转移到HPLC仪上分析L-β-苯丙氨酸的产量。此HPLC法使用μBONDAPAKTMC18柱(Millipore，Milford，MA)和反相的层析，水(A)对乙酰腈(B)梯度变化为1分钟后0％到20％B、6分钟20％到30％B、再1分钟30％到90％B。L-α-苯丙氨酸在5.2分钟洗脱而L-β-苯丙氨酸在4.9分钟洗脱。在两个实验中，重组PAM产生了694和483ng的β-苯丙氨酸/mg大肠杆菌蛋白，而含有pBMS2000的大肠杆菌提取物没有合成足可检测到的β-苯丙氨酸。
权利要求
1.从植物细胞纯化苯丙氨酸氨基变位酶的方法，包括(a)制备植物细胞粗提物；(b)从粗提物中沉淀出蛋白；(c)通过以下步骤将苯丙氨酸氨基变位酶与其它沉淀的蛋白分离开(i)在Mg2+存在下将含有沉淀的蛋白和pH7.0的缓冲液的溶液用亲和色谱处理；(ii)通过超滤法透析步骤(i)中的流出及洗涤得到的级分，使缓冲液变为pH至少达到9.0的缓冲液；并且(iii)对步骤(ii)中透析和超滤获得的级分进行亲和色谱分离；并且(d)将经步骤(iii)亲和色谱处理得到的纯化的苯丙氨酸氨基变位酶用含有0.1M NaCl的缓冲液洗脱下来。
2.纯化的苯丙氨酸氨基变位酶。
3.权利要求2的纯化的苯丙氨酸氨基变位酶，其中所述酶是从紫杉属物种分离的。
4.含有SEQ ID NO2的权利要求2的纯化的苯丙氨酸氨基变位酶。
5.编码苯丙氨酸氨基变位酶的分离的核酸序列。
6.含有SEQ ID NO1、3、4或5或其片段或变型的权利要求5的分离的核酸序列。
7.权利要求5的分离的核酸序列，其中苯丙氨酸氨基变位酶含有SEQ ID NO2或其片段或其变型。
8.含有权利要求5的核酸序列的载体。
9.表达权利要求8的载体的宿主细胞。
10.分离毗邻苯丙氨酸氨基变位酶基因的调控基因组序列的方法，包括(a)在基因中鉴定权利要求5的分离的核酸序列；并且(b)分离与所鉴定的序列毗邻的基因组序列。
11.鉴定物种中苯丙氨酸氨基变位酶基因的方法，包括将得自所述物种的DNA或RNA与能够同权利要求5的分离的核酸序列杂交的探针接触。
12.鉴定编码与野生型苯丙氨酸氨基变位酶相比生物催化活性改变的蛋白的突变型苯丙氨酸氨基变位酶基因的方法，包括(a)使权利要求5的分离的核酸序列突变；(b)表达由此突变型分离的核酸序列编码的多肽；并且(c)将表达的多肽的生物催化特性与野生型苯丙氨酸氨基变位酶的同样生物催化特性相比较。
13.改变植物细胞培养物生物合成化合物的方法，包括改变植物细胞培养物中的苯丙氨酸氨基变位酶的水平或活性。
14.权利要求13的方法，其中通过用含有苯丙氨酸氨基变位酶的核酸序列的载体转化植物细胞培养物来提高苯丙氨酸氨基变位酶的水平。
15.权利要求13的方法，其中植物细胞培养物包括紫杉属物种，并且生物合成的化合物包括紫杉烷类和紫杉烷类相关化合物。
16.改变植物细胞培养物产生的紫杉烷类和紫杉烷类相关化合物水平的方法，包括用β-苯丙氨酸培养植物细胞。
17.权利要求16的方法，所述方法还包括用苯甲酸或其盐培养植物细胞。
18.权利要求16或17的方法，其中植物细胞培养物所产生的紫杉烷类水平得到增加。
19.权利要求18的方法，其中所述紫杉烷类为紫杉醇。
20.改变植物细胞培养物中紫杉醇与浆果赤霉素III的比例的方法，包括用β-苯丙氨酸培养植物细胞。
21.权利要求20的方法，所述方法还包括用苯甲酸或其盐培养植物细胞。
全文摘要
本发明提供了苯丙氨酸氨基变位酶的分离的核酸和氨基酸序列以及纯化此酶的方法。本发明还提供了改变植物细胞培养物中化合物生物合成的方法。本发明尤其提供了改变紫杉烷类和紫杉烷类相关化合物的生产的方法。
文档编号C07H21/04GK1871357SQ03807679
公开日2006年11月29日 申请日期2003年2月10日 优先权日2002年2月8日
发明者C·L·斯特勒, 陈宜俊, B·A·杜赫尔蒂, S·霍夫斯蒂, 林剑声, 李文莹, 邢自琢 申请人:布里斯托尔-迈尔斯斯奎布公司