利用低分子量有机两性离子的外泌体回收方法
【专利摘要】一种分离外泌体的方法包括在分子量小于约350道尔顿的有机两性离子的存在下进行至少一个纯化步骤，所述有机两性离子的带负电荷部分的缓冲pK比进行所述至少一个纯化步骤所处的操作pH低至少一个完整的pH单位，并且所述有机两性离子的带正电荷部分的缓冲pK比所述操作pH高至少一个完整的pH单位。
【专利说明】
利用低分子量有机两性离子的外泌体回收方法
技术领域
[0001 ]本文公开的实施方案涉及纯化外泌体(exosome)的方法，并且更具体地涉及低分子量有机两性离子在纯化外泌体中的用途。
【背景技术】
[0002]外泌体是与范围广泛的生物流体相关的约30nm到120nm的细胞来源的囊泡。尽管它们的生物学功能还没有被完全表征，但它们在各种诊断和治疗应用中的潜在效用已经得到了考虑。它们通常通过基于尺寸区分的技术如超速离心、流式细胞术、过滤、尺寸排阻色谱和场流分级分离来纯化(Kang,D.等人，J.Proteome Res.,7(2008)3475-3480;Lasser，C.等人，J.Vis.Exp.59(2012)e3037 ； Soko 1va ,V.等人，Co Ilo ids Surf.B: Bi o interfaces ,87(2011)146-150)。
[0003]A.Vlasso V 等人(B1chim.B1phy s.Acta 1820 (2012)940-948)对外泌体的组成进行了讨论。它们含有由估计小于10,000个核苷酸单位和小于300个蛋白质组成的核苷酸和蛋白质负荷(cargo)。这些被包封在脂质双层膜内，取决于外泌体的来源，所述脂质双层膜多样地富含胆固醇、神经酰胺、鞘脂和具有饱和的长脂肪酰基链的磷酸甘油酯(phophoglyceride)。外表面还携带有糖基，包括甘露糖、聚乳糖胺、α-2，6-唾液酸和复合的N-连接的聚糖。
[0004]甘氨酸是天然存在的氨基酸，其在生理pH下以两性离子形式存在。它在外泌体研究领域中经常以10mM的浓度使用以在外泌体与固体颗粒共价连接后猝灭此类颗粒上的未反应的氨基反应性酸(Vincent-Schneider ,H.等人，Intl.Tmmunol., 14(2002)713-722)。它也已被描述作为纯化的外泌体制剂中的填充剂(H.Lamparski等人，美国专利6，812，023B1，2004)。已知甘氨酸促进蛋白质和疏水表面之间的非特异性相互作用(Gagnon，P.，J.Chromatog.A.1221 (2012)57-70 ;Muller，E.等人，J.Sep.Sc1.，36(2013) 1327-1334)。细胞膜的高脂质含量被认为介导升高的表面疏水性。
【发明内容】
[0005]在一些方面，本文公开的实施方案涉及分离外泌体的方法，所述方法包括在分子量小于约350道尔顿的有机两性离子的存在下进行至少一个纯化步骤，其中所述有机两性离子的带负电荷部分的缓冲PK比进行所述至少一个纯化步骤所处的操作pH低至少一个完整的PH单位，并且所述有机两性离子的带正电荷部分的缓冲pK比所述操作pH高至少一个完整的pH单位。
【具体实施方式】
[0006]已经发现外泌体与小有机两性离子的组合可以增强纯化期间外泌体的回收。不受理论限制，增强的回收似乎由外泌体和它们所接触的表面之间的非特异性相互作用的减小所介导。这看起来是违反直觉的，因为已知甘氨酸(一种适宜的两性离子物质的一个示例)促进蛋白质和疏水表面之间的非特异性相互作用，并且外泌体外膜的脂质组分被认为是强疏水性的。合格的两性离子降低非特异性相互作用的表观能力可以反映由两性离子升高水溶液极性的能力所介导的外泌体溶解度的增加。在纯化期间可以与外泌体非特异性地相互作用的表面可以包括过滤介质和色谱介质。降低非特异性相互作用和增加溶解度是否是不同的现象或同一现象的不同方面仍然有待阐明，但在任一种情况下，根据本文公开的实施方案，将外泌体与两性离子组合均可改进纯化期间的外泌体回收率。
[0007]适于实施本文公开的方法的小有机两性离子尤其包括分子量为约75道尔顿(Da)的氨基酸甘氨酸或分子量为约89Da的丙氨酸。甘氨酸由与伯氨基、羧基和两个氢原子连接的中心碳组成，其中电荷驻留于分子的相对侧上。由于氨基和羧基之间的布置和距离，因此两性离子形式具有升高的偶极矩，这具有增加其所驻留的水溶液的整体介电常数的效应。出于相同的原因，甘氨酸类似物如甜菜碱、牛磺酸和牛磺甜菜碱具有基本上类似的效应，不同之处在于在甜菜碱中，氨基被化学修饰(三甲基化)从而在大于9的pH值下保持其正电荷；而在牛磺酸中，羧基被磺基取代从而在小于2的pH下保持其负电荷;而在牛磺甜菜碱中，氨基和羧基两者被修饰使得该分子在约3到约12的整个pH范围都是两性离子。由于正电荷和负电荷之间的较大距离产生的偶极矩较大，因此类似或相关的结构如二氨基酸、三氨基酸和更大的多联体(multiple)在较低浓度下可以更为有效。此类化合物的示例包括但不限于甘氨酰甘氨酸和甘氨酰甘氨酰甘氨酸，尤其是具有同源或异源组成的至多达五氨基酸。如在这些示例中一样，这些示例在分子的相对末端处携带有各自的带电荷基团，并且中间碳上的侧基基本上不带电荷，在具有至少一个中间碳的分子的相对末端处携带相反的电荷并且其中所述中间碳上的侧基基本上不带电荷的其它两性离子也是合格的。
[0008]在一些实施方案中，甘氨酸或丙氨酸可以是特别有用的，因为它们是FDA批准的USP列举的已知对于人注射是安全的无活性成分。甘氨酸和丙氨酸可以进一步是有用的，因为它们还可低成本地从多个供应商广泛地获得。
[0009]如本文中所使用的，甘氨酸作为非穷尽的示例被提供，目的是为了描述本发明的实施方案，并且不应当解释为限制本发明。根据一些实施方案，甘氨酸可以以下列的浓度存在:5111]\1、10111]\1、20111]\1、501111、1001111或更高，包括至多达謂、21或饱和的(约310。在一些此类实施方案中采用10mM或更小的浓度以将摩尔渗透压浓度合理地保持接近于正常生理值可以是有益的。实验数据表明，当外泌体与水溶液中的10mM甘氨酸组合时，对纯化的有益效果至少与以IM甘氨酸获得的效果一样好。在一些实施方案中，甘氨酸的浓度可以超过1M、2M、3M，或可以是饱和的。
[0010]甘氨酸或本文公开的其它两性离子剂可以与一种或多种所谓的两性离子缓冲液如Hepes (羟乙基哌嗪乙烷磺酸)组合。Hepe s的pK为约7且通常以约I OmM到约20mM的浓度用作外泌体缓冲剂。当此类试剂用于缓冲(在它们的PK的I个pH单位内)时，它们不被计入产生所公开的效果的两性离子中，因为在这些情况下，氨基被部分离子化，留下具有非中性电荷的物质，这据信会降低其偶极矩和升高溶剂的介电常数的能力。
[0011]在一些实施方案中，甘氨酸或其它两性离子剂可以与表面活性剂组合。一些表面活性剂如CHAPS和CHAPSO虽然是两性离子型，但不被计入产生所公开的效果的物质中，因为电荷的位置彼此靠近，而不是在分子的相对末端处，因此不产生强的偶极矩并且因而缺少升高介质的介电常数的能力。
[0012]在一些实施方案中，甘氨酸或其它两性离子剂可以与常规的无机缓冲剂和盐组合。在一些此类实施方案中，缓冲剂可以包括常用的试剂如磷酸钠和/磷酸钾、氯化钠和/氯化钾以及其它无机缓冲剂和盐。
[0013]在一些实施方案中，甘氨酸或其它两性离子剂可以与糖组合，糖包括单糖和多糖。在一些此类实施方案中，这些可以包括诸如甘露醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖的糖或其它糖。
[0014]在一些实施方案中，甘氨酸或其它两性离子剂与缓冲剂如Hepes或MES组合。尽管这些是作为两性离子缓冲剂被销售的，但它们在其被使用的PH值下并不是适当的两性离子的，因为至少一个带电荷的残基被部分地滴定。因此，它们并不有助于所公开的方法的有益效果。
[0015]在一些实施方案中，甘氨酸或其它两性离子剂可以与有机溶剂或聚合物组合，所述有机溶剂或聚合物包括甘油、乙二醇、丙二醇、二甲亚砜、聚乙二醇、聚丙二醇、或聚乙烯吡咯烷酮、或其它。
[0016]在一些实施方案中，甘氨酸或其它两性离子剂可以与特定的金属离子物质组合。在一些此类实施方案中，金属物质可以是选自由下列各项组成的组中的一种或多种:钙、镁、铁、其它金属离子物质、或多于一种的金属离子物质的组合。
[0017]在一些实施方案中，甘氨酸或其它两性离子剂可以与特定的螯合剂物质组合。在一些此类实施方案中，螯合物质可以是来自包括下列的组的一种或多种:EDTA(乙二胺四乙酸)、EGTA(乙二醇四乙酸)、TREN(三(2-氨基乙基)胺)、其它螯合剂、或螯合剂的组合。
[0018]在一些实施方案中，当与其它物质结合使用时，甘氨酸或其它两性离子剂可以采用此类其它物质的这样的浓度，所述浓度被降低以允许足够高的甘氨酸浓度而不超过生理摩尔渗透压浓度的限值。在一个此类实施方案中，例如，盐浓度可以被降低使得组合物的电导率低于约15mS/cm的正常生理值。在一个此类实施方案中，具体地地说，氯化钠的浓度可以被降低至约25mM，且磷酸盐缓冲液的浓度可以限于约20mM，使得甘氨酸的浓度可以为约75mM，而不显著超过约250m0sm/kg到约300m0sm/kg的摩尔渗透压浓度目标。在另一个此类实施方案中，氯化钠的浓度可以被降低至约50mM，与约20mM磷酸盐组合，使得甘氨酸的浓度可以为约50mM。在一些实施方案中，糖或其它渗透剂的浓度可以被类似地管理。
[0019]在一些实施方案中，当与外泌体组合时，甘氨酸或其它两性离子剂可以在下列的条件下被处理，在所述条件下甘氨酸可以被连续地供应使得外泌体总是处于甘氨酸的存在下。在其它实施方案中，甘氨酸可以在纯化的至少一个阶段期间与外泌体一起存在，但不一定连续地存在。
[0020]在一些实施方案中，与外泌体结合使用的甘氨酸或其它两性离子剂可以包括在含有未纯化的、部分纯化的或高度纯化的外泌体的制剂中使用。
[0021]定义
[0022]定义下面的术语使得可以更容易地理解本发明。其它的定义在整个【具体实施方式】中有陈述。
[0023]“两性离子”是指具有驻留在同一个分子上的单独的和不同的带正电荷部分和带负电荷部分的分子。两性离子包括范围广泛的氨基酸和含有两个或更多个氨基酸亚基的氨基酸聚合物，其中特定聚合物中的各个亚基可以彼此相同或不同。
[0024]“外泌体”是指直径为30nm到10nm的细胞来源的囊泡，诸如存在于许多生物流体包括细胞培养物中。
[0025]“摩尔渗透压浓度(osmolarity)”是指一种或多种渗透活性物质在溶液中的渗透压浓度，其被表示为每升溶液中溶质颗粒的渗透压摩尔数。溶液的摩尔渗透压浓度经常是生物分子或生物分子装配物的功能性和/或稳定性的关键参数。
[0026]“渗透压摩尔(osmole)”是指与在溶液中离解而形成I摩尔(阿伏伽德罗数，Avogadro ’ s number)颗粒(分子和离子)的溶质的量等同的渗透压单位。
[0027]在一些实施方案中，分离外泌体的方法包括在分子量小于约350道尔顿的有机两性离子的存在下进行至少一个纯化步骤，其中所述有机两性离子的带负电荷部分的缓冲PK比进行所述至少一个纯化步骤所处的操作PH低至少一个完整的pH单位，并且所述有机两性离子的带正电荷部分的缓冲PK比所述操作pH高至少一个完整的pH单位。
[0028]在一些实施方案中，有机两性离子包含所述有机两性离子上的带正电荷的氮基和在所述带正电荷的氮基远侧的带负电荷的基团，使得存在至少一个碳原子的间隔。
[0029]在一些实施方案中，所述至少一个碳原子包含不带电荷的侧链。
[0030]在一些实施方案中，在至少一个纯化步骤的操作条件下有机两性离子的摩尔介电增量大于20。在一些实施方案中，在至少一个纯化步骤的操作条件下有机两性离子的摩尔介电增量大于约17。在一些实施方案中，摩尔介电增量是甘氨酸的摩尔介电增量，其已经被指示为在约I 8 (较早的测量)到约2 2.6的范围。例如，参见万维网上的b1.groups.et.byu.net/Dielectric_Increments.phtml。
[0031]在一些实施方案中，其中有机两性离子是氨基酸或包含2到5个氨基酸的肽，所述氨基酸或肽氨基酸选自由下列各项组成的组:甘氨酸、丙氨酸、N，N，N_三甲基甘氨酸(S卩，甜菜碱)和牛磺酸。
[0032]在一些实施方案中，至少一种有机两性离子剂是甘氨酸或丙氨酸。
[0033]在一些实施方案中，有机两性离子的浓度选自由下列各项组成的组:(a)约20mM到约50mM、( b)约50mM到约 10mM、( c)约 10mM到约300mM、( d)约300mM到约3M和(e)饱和的。在一些实施方案中，浓度可以是其间的任何中间值或范围。
[0034]在一些实施方案中，有机两性离子的浓度选自由下列各项组成的组:(a)约5mM到约 20mM、(b)约20mM到约50mM、( c)约50mM到约 10mM、( d)约 10mM到约300mM、( e)约300mM到约3M和(f)饱和的。在一些实施方案中，浓度可以是其间的任何中间值或范围。
[0035]在一些实施方案中，在进行至少一个纯化步骤之前，外泌体是未纯化的、部分纯化的或高度纯化的。在一些此类实施方案中，纯化水平是约5%、10%、20%、40%、80%、90%、95 %、99 %或约99.9 %纯化的。即，在至少一个纯化步骤之前可以获得任何纯化水平。在一些实施方案中，外泌体的纯度水平表示小于1%的污染物质量，大于1%的污染物质量，大于10%的污染物质量，大于50%的污染物质量，大于90%的污染物质量，大于95%的污染物质量，或大于99%的污染物质量，或这些范围内的中间值。
[0036]在一些实施方案中，至少一个纯化步骤期间的摩尔渗透压浓度在约250毫渗摩尔/kg到约300毫渗摩尔/kg的范围。
[0037]在一些实施方案中，至少一个纯化步骤期间的摩尔渗透压浓度小于约250毫渗摩尔/kg。
[0038]在一些实施方案中，至少一个纯化步骤期间的摩尔渗透压浓度大于约300毫渗摩尔/kg。在一些实施方案中，摩尔渗透压浓度在约250到约300的范围，尽管两性离子在更高和更低的浓度下也可以具有有益的效果。
[0039]在一些实施方案中，至少一个纯化步骤包括过滤步骤。
[0040]在一些实施方案中，至少一个纯化步骤包括色谱(chromatography)步骤。
[0041 ]在一些实施方案中，至少一个纯化步骤包括场流分级分离步骤。
[0042]在一些实施方案中，至少一个纯化步骤包括离心步骤。
[0043]在开发用于本文公开的方法中的具体组合物的有用起始点是用含有10mM甘氨酸的缓冲液平衡外泌体的水性制剂。缓冲液可以体现每升约280到约310毫渗摩尔的所谓生理摩尔渗透压浓度。在缺少渗透压计的情况下，适宜的起始点的一个示例可以是20mM Hepes，25mM NaCl ,10mM甘氨酸，pH 7.0。另一个示例可以是50mM Hepes,50mM NaCl，50mM甘氨酸，pH 7.0t3Hepes可以被另一种两性离子缓冲剂如组氨酸或两性离子缓冲剂的混合物代替。NaCl可以被替代盐或替代盐的混合物代替。甘氨酸可以被另一种两性离子物质或两性离子物质的组合代替。
[0044]在一些实施方案中，用来产生有益效果的给定两性离子物质或两性离子物质混合物的量可以通过运行诸如尺寸排阻色谱的工艺、接着运行允许准确定量外泌体的分析方法来确定。在本文公开的方法中，可以重复地运行实验，其中每次实验采用固定浓度的两性离子物质的单个物质，所述固定浓度如约1mM、约20mM、约40mM、约80Mm、或约160mM、或其它浓度。在一些实施方案中，可以使用两性离子物质的组合运行方法，其中组合的两性离子物质浓度为约I OmM、约20mM、约40mM、约80mM、或约160mM。可以运行后续的处理步骤以鉴别在所期望的任何误差内的最低有效浓度。在一些实施方案中，氯化钠或其它盐的浓度也可以变化。在一些实施方案中，缓冲离子的浓度也可以变化。在一些实施方案中，pH可以变化，通常在6.5到7.5的范围。应当认识到，在评价多个变量的情况下，可以采用统计学技术如实验设计(DoE)来显著减少处理变量的数目以获得有效结果。
[0045]在一些实施方案中，未纯化的制剂可以通过透析过滤平衡到含有两性离子的溶液中，其中透析过滤的过程也具有通过污染物穿过膜中的孔来去除一些污染物的作用。
[0046]在一些实施方案中，外泌体可以通过离心被沉降，并且可以通过将它们再悬浮在含有两性离子的缓冲液中而平衡到含有两性离子的环境中。
[0047]在一些实施方案中，可以通过直接添加干燥的两性离子或添加含有至少两性离子物质的浓缩溶液来将两性离子添加到含有外泌体的制剂中。
[0048]在一些实施方案中，可以将外泌体制剂平衡到含有两性离子的溶液中，然后通过从制剂中有效地去除水的方法如简单干燥、冻干、玻璃化或其它方法将其保存。
[0049]实施例
[0050]实施例1.通过尺寸排阻色谱(SEC)处理外泌体和甘氨酸的组合。用含有25mMHepes，10mM甘氨酸，150mM NaCl ,pH 7.0的缓冲液平衡I.6cm宽 X 15cm高的30mLSephacryl S-400HR柱。向该柱施加由通过切向流微滤浓缩并且含有污染物的7mL外泌体水性制剂(综合UV吸光度大致等于外泌体)组成的样品，并且在以60cm/hr的线性流速供应给该柱的该缓冲液中进行分级分离分离。用IM甘氨酸代替10mM甘氨酸重复实验。使用25mMHepes，15OmM NaCl，pH 7.0的缓冲液进行没有甘氨酸的对照实验。通过NanoSight分析显示利用10mM甘氨酸运行的工艺得到约99 %的外泌体回收率。IM甘氨酸实验得到约95 %的回收率，并且缺少甘氨酸的对照得到约90%的回收率。通过在最高点处的UV吸光度进行的外泌体定量显示相对回收率分别为约100%、约92%和约67%。在所有实验中消除了全部蛋白质污染物的约95%。本实施例指示了可以估计外泌体回收率的两种方式。对于本领域技术人员将显而易见的是，可以使用类似的方法在含有外泌体和两性离子的物质的组合物与其它表面接触之后和/或在其它条件下测量外泌体回收率。
[0051]实施例2.通过尺寸排阻色谱在10mM甘氨酸中处理外泌体。向与实施例1中所述的柱相同的SEC柱施加通过超滤浓缩的外泌体，但所述外泌体被平衡到25mM Hepes , 25mMNaCl, 10mM甘氨酸，pH 7.0。如通过Nanosight测量的外泌体回收率为约99%。非外泌体蛋白质含量降低了约95 %。
[0052]对于本领域技术人员将显而易见的是，对于其中分级分离基于尺寸的所有纯化方法，并且同样对于其中分级分离基于电荷的所有纯化方法如离子交换色谱，都将实现类似的效果，因为就纯化方法来说，两性离子介导的升高介电常数的效果应当是显而易见的。
[0053]本文引用的所有参考文献均以引用方式且出于所有目的整体并入，其并入程度就如同每个单独的出版物或专利或专利申请被明确地且个别地指明出于所有目的以引用方式整体并入一样。当以引用方式并入的出版物和专利或专利申请与说明书中所含的公开内容相冲突时，说明书意在替代和/或优先于任何此类相冲突的材料。
[0054]在说明书和权利要求中使用的所有表示成分的量、色谱条件等的数字应当理解为在所有情况下均被术语“约”修饰。因此，除非有相反的指示，否则在说明书和所附权利要求书中陈述的数字参数是近似值，其可以根据本发明试图获得的所需性能而变化。
[0055]如对本领域技术人员将显而易见的，在不脱离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明做出许多修改和变化。本文描述的具体实施方案仅以举例方式提供，且不意在以任何方式进行限制。说明书和实施例意在被认为仅仅是示例性的，本发明的真正范围和精神由所附权利要求书指示。
【主权项】
1.一种分离外泌体的方法，其包括:在分子量小于约350道尔顿的有机两性离子的存在下进行至少一个纯化步骤，其中所述有机两性离子的带负电荷部分的缓冲PK比进行所述至少一个纯化步骤所处的操作pH低至少一个完整的pH单位，并且所述有机两性离子的带正电荷部分的缓冲PK比所述操作pH高至少一个完整的pH单位。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述有机两性离子包含所述有机两性离子上的带正电荷的氮基和在所述带正电荷的氮基远侧的带负电荷的基团，使得存在至少一个碳原子的间隔。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述至少一个碳原子包含不带电荷的侧链。4.根据权利要求1所述的方法，其中在所述至少一个纯化步骤的操作条件下所述有机两性离子的摩尔介电增量大于约17。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述有机两性离子是氨基酸或包含2到5个氨基酸的肽，所述氨基酸或肽氨基酸选自由下列各项组成的组:甘氨酸、丙氨酸、N，N，N-三甲基甘氨酸(甜菜碱)和牛磺酸。6.根据权利要求1所述的方法，其中至少一种有机两性离子剂是甘氨酸或丙氨酸。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述有机两性离子的浓度选自由下列各项组成的组:(a)约 20mM到约50mM、( b)约50mM到约 10mM、( c)约 10mM到约300mM、( d)约300mM到约3M和(e)饱和的。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述有机两性离子的浓度选自由下列各项组成的组:(a)约 5mM到约 20mM、( b)约 20mM到约 50mM、( c)约50mM到约 I OOmM、( d)约 I OOmM到约 300mM、(e)约300mM到约3M和(f)饱和的。9.根据权利要求1所述的方法，其中在进行所述至少一个纯化步骤之前，所述外泌体是未纯化的、部分纯化的或高度纯化的。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个纯化步骤期间的摩尔渗透压浓度在约250毫渗摩尔/kg到约300毫渗摩尔/kg的范围。11.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个纯化步骤期间的摩尔渗透压浓度小于约250毫渗摩尔/kg。12.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个纯化步骤期间的摩尔渗透压浓度大于约300毫渗摩尔/kg。13.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个纯化步骤包括过滤步骤。14.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个纯化步骤包括色谱步骤。15.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个纯化步骤包括场流分级分离步骤。16.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个纯化步骤包括离心步骤。
【文档编号】A61K35/22GK105849554SQ201480057767
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2014年10月15日
【发明人】彼得·斯坦利·加尼翁
【申请人】新加坡科技研究局