一种痰热清胶囊指纹图谱的建立方法及其指纹图谱的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种痰热清胶囊指纹图谱的建立方法及其指纹图谱。本发明的痰热清胶囊由黄芩、熊胆粉、山羊角、金银花、连翘五种提取物组成，通过采用高效液相色谱法检测痰热清胶囊成分建立痰热清胶囊指纹图谱；色谱条件为：色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充材料；以乙腈?0.2％甲酸水溶液为流动相，进行梯度洗脱；流速：0.8～1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：280nm。采用本发明的建立方法，获得的指纹图谱中有16个共有特征峰，检测到的化学成分较多，避免了因测定个别化学成分而判定痰热清胶囊整体质量的片面性，从而保证产品的安全有效，且具有操作简便、结果稳定、重现性好、精密度高等优点。
【专利说明】
一种痰热清胶囊指纹图谱的建立方法及其指纹图谱
技术领域
[0001] 本发明涉及药物分析检测技术领域，尤其涉及一种痰热清胶囊指纹图谱的建立方 法及其指纹图谱。
【背景技术】
[0002] 痰热清胶囊由黄芩(君药）、熊胆粉(臣药）、山羊角（臣药）、金银花(佐药）、连翘(使 药)制成，全方五味中药互相配伍，具有疏风清热、化痰解毒之功效，主要用于风温肺热病属 风热袭肺证，症见发热、恶风、咳嗽、咯痰，或咽痛、流涕、口干等。
[0003] 痰热清胶囊现有质量标准中仅采用薄层色谱法，以熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸、丙氨 酸、苯丙氨酸、绿原酸作为对照品，以金银花、连翘作为对照药材，分别进行定性鉴别，同时 采用高效液相色谱法对痰热清胶囊中黄芩苷和熊去氧胆酸两个成分进行定性鉴别和含量 测定，质控指标成分较少，无法全面表征中药复方制剂的物质基础以及化学成分群的整体 性和复杂性，因此，有必要建立痰热清胶囊的标准指纹图谱，从而较全面有效地控制痰热清 胶囊的的内在质量。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种痰热清胶囊指纹图谱的建立方法，该方法操作简便、结 果稳定、重现性好、精密度高。
[0005] 本发明的另一个目的是提供一种采用建立方法得到的痰热清胶囊指纹图谱。该指 纹图谱能够更全面表征痰热清胶囊的物质基础以及化学成分群的整体性和复杂性。
[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。
[0007] 本发明提供一种痰热清胶囊指纹图谱的建立方法，所述痰热清胶囊由黄芩、熊胆 粉、山羊角、金银花、连翘组成;通过采用高效液相色谱法检测痰热清胶囊成分建立痰热清 胶囊指纹图谱，具体步骤如下：
[0008] 1)制备对照品溶液:取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异连翘酯苷A、连翘酯 苷A、野黄芩苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、黄芩苷、连翘苷、千层纸素A-7-0-葡萄糖 醛酸苷、白杨素-7-0-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷和黄芩素，加甲醇制成各个对照品浓度为100 yg/mL的混标溶液，作为对照品溶液，对照品溶液中每个对照品的浓度均为100μg/ml;
[0009] 2)制备供试品溶液:取痰热清胶囊内容物1 Omg，加70%甲醇lmL，超声lOmin，离心， 取上清溶液，经〇. 22mi微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品溶液；
[0010] 3)制作痰热清胶囊指纹图谱:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液注入高效液 相色谱仪，根据以下色谱条件进行测定，记录90分钟的色谱图，得到指纹图谱;其中：所述色 谱条件为：
[0011]采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱;柱温为30°C;检测波长为280nm;以 乙腈为A相，0.2 %甲酸水溶液为B相组成流动相，采用梯度洗脱方式，其洗脱时间、流动相体 积和流速分别为：
[0012] 〇-l〇min，A相：10-12%、B相：90-88%，流速为 1.0mL/min;
[0013] l〇-15min，A相：12-12%、B相：88-88%，流速为l.OmL/min;
[0014] 15-20min，A相：12-19%、B相：88-81 %，流速为 1 ? OmL/min;
[0015] 20-38min，A相：19-20%、B相：81-80%，流速为 1 ? OmL/min;
[0016] 38-40min，A相：20-30%、B相：80-70%，流速为 1 ? 0-0 ? 8mL/min;
[0017] 40-60min，A相：30-30%、B相：70-70%，流速为0 ? 8mL/min;
[0018] 60-65min，A相：30-90%、B相：70-10%，流速为0 ? 8-1 ? OmL/min;
[0019] 65-75min，A相：90-90%、B相：10-10%，流速为 1 ? OmL/min;
[0020] 75-80min，A相：90-10%、B相：10-90%，流速为 1 ? OmL/min;
[0021 ] 80-90min，A相：10-10%、B相：90-90%，流速为 1 ? OmL/min。
[0022] 上述表述，洗脱时间为38_40min时，流速由1 .Oml/min变为0.8ml/min。洗脱时间为 60_65min 时，流速由 0 ? 8ml/min 变为 1 ? Oml/min。
[0023] 本发明还提供一种上述的痰热清胶囊指纹图谱的建立方法得到的指纹图谱，所述 建立方法得到的指纹图谱中共有16个特征峰，其中10号峰为对照品异绿原酸C，各峰以10号 峰为参照峰的相对保留时间和相对峰面积如下：
[0024] 相对保留时间：
[0025] 峰1:0.190~0.191;峰2:0.305~0.306;峰3:0.336~0.337;峰4:0.414~0.415; 峰5:0.628~0.630;峰6:0.668~0.670;峰7:0.717~0.718;峰8:0.794~0.796;峰9:0.846 ~0.847;峰10:1.000;峰11:1.109~1.003;峰12:1.137~1.140;峰13:1.222~1.225;峰 14:1.231~1.234;峰15:1.297~1.301;峰16:1.565~1.571;
[0026] 相对峰面积：
[0027] 峰1:0.116~0.119;峰2:0.633~0.651;峰3:0.233~0.244;峰4:0.211~0.217; 峰5:0?634~0?650;峰6:1?306~1?368;峰7:0?636~0?655;峰8:0?561~0?588;峰9:0?505 ~0.527;峰10:1.000;峰11:52.040~54.917;峰12:0.204~0.212;峰13:1.518~1.559;峰 14:0.723~0.746;峰15:0.139~0.148;峰16:1.385~1.452。
[0028] 本发明中，通过对所述痰热清胶囊复方与全方药材的相关性研究，确认了所述痰 热清胶囊指纹图谱中16个特征峰的来源，其中对应于原料药，7、11、13、14、15、16号峰归属 于痰热清胶囊中的黄芩，1、2、3、4、8、9、10号峰归属于金银花，5、6、12号峰归属于连翘;并 且，采用与按照痰热清胶囊指纹图谱测定方法获取的对照品指纹图谱比对，利用相同成分 色谱峰保留时间的一致性，进行色谱峰进行指认，其中，1号峰为新绿原酸、2号峰为绿原酸、 3号峰为隐绿原酸、4号峰为咖啡酸、5号峰为异连翘酯苷A、6号峰为连翘酯苷A、7号峰为野黄 芩苷、8号峰为异绿原酸B、9号峰为异绿原酸A、10号峰为异绿原酸C、ll号峰为黄芩苷、12号 峰为连翘苷、13号峰为千层纸素A-7-0-葡萄糖醛酸苷、14号峰为白杨素-7-0-葡萄糖醛酸 苷、15号峰为汉黄苳苷、16号峰为黄苳素。
[0029] 在检测待测产品痰热清胶囊，如痰热清胶囊的质量时，可以将待测产品的指纹图 谱与上文所获得的标准指纹图谱进行比较，计算相似度，识别两者所具有的特征峰的数量， 以确定广品是否合格。
[0030] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0031] 1)本发明指纹图谱建立方法对供试品的前处理方法简单，具有操作简便、结果稳 定、重现性好、精密度高等优点。
[0032] 2)本发明指纹图谱中特征性成分保留完整，具有16个共有峰，且对其进行了指认 和归属分析，各特征峰分离效果较好，能够较全面的反映出产品的质量信息，有利于全面监 控产品质量，及鉴别产品的真伪。
[0033] 3)在相同测试条件下，所提供的痰热清胶囊指纹图谱建立方法可获取痰热清胶囊 中以黄芩、金银花和连翘有效成分为特征的高效液相色谱标准指纹图谱。
【附图说明】
[0034]图1为实施例3中痰热清胶囊内容物HPLC标准指纹图谱。
[0035]图2为实施例4中不同流动相系统考察HPLC图（1:0.2%甲酸-甲醇，2:0.2%甲酸-乙腈，3:0.1%甲酸-乙腈，4:水-乙腈）。
[0036] 图3为实施例4中不同色谱柱考察HPLC图（Ultimate XB-C18柱，2:Shiseido Capcell PAK C18-MG柱，3:Agilent Zorbax SB-C18柱）〇
[0037] 图4为实施例4中不同柱温考察HPLC图（1:35°C，2:30°C，3:25°C)。
【具体实施方式】
[0038] 为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结 合具体实施例和附图，进一步阐述本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非 全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得 的其他实施例，都属于本专利的保护范围。
[0039] 以下各实施例中所使用的对照品来源如下：
[0040] 绿原酸（批号140601)、新绿原酸（批号X-014-140801)、隐绿原酸（批号Y-067-140801)、异绿原酸4(批号140615)、异绿原酸8(批号￥-069-141122-1)、异绿原酸(：(批号￥-070-140801 )、咖啡酸（批号MUST-14100803)、黄芩苷（批号150517)、野黄芩苷（批号 150024)、千层纸素A-7-0-葡萄糖醛酸苷(批号141007)、白杨素-7-0-葡萄糖醛酸苷（批号 MUST-15011215 )、连翘苷(批号150118 )、连翘酯苷A (批号L-012-140730 )、异连翘酯苷A (批 号Y-184-140801)、汉黄芩苷(批号141214)、黄芩素(批号150320)，质量分数均彡98%，均购 自上海欣拓贸易有限公司。
[00411以下各实施例中所使用的供试品痰热清胶囊(批号S1:1406101、S2:1407101、S3: 1407102)，S1批胶囊的黄芩提取物(批号1405101)、熊胆提取物(批号1405101)、山羊角取物 (批号1405101)、金银花提取物(批号1405101)、连翘提取物(批号1405101)均由上海凯宝药 业股份有限公司提供。
[0042]其它仪器及试剂：
[0043] Agilent 1260系列，包括四元栗、UV检测器、柱温箱、自动进样器、工作站，美国安 捷伦公司；BT25S电子分析天平，德国Sartorius公司；Vortex Mixer祸旋仪，美国Labnet公 司；Sorvall Legend Micro 21R离心机，美国Thermo公司；KQ-250DB型数控超声仪，昆山市 超声仪器有限公司。
[0044] 乙腈、甲醇、甲酸为色谱纯，美国Fisher公司；水为超纯水。
[0045]实施例1采用HPLC法建立痰热清胶囊内容物的指纹图谱
[0046] 对照品溶液的制备:取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异连翘酯苷A、连翘酯 苷A、野黄芩苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、黄芩苷、连翘苷、千层纸素A-7-0-葡萄糖 醛酸苷、白杨素-7-0-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、黄芩素对照品适量，加甲醇制成每个对照品 浓度为1 〇〇yg/mL的混标溶液，作为对照品溶液。
[0047 ] 供试品溶液的制备:取痰热清胶囊内容物约1 Omg，加7 0 %甲醇1 mL，超声1 Om i n，离 心，取上清溶液，经〇. 22mi微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
[0048] 指纹图谱的测定:精密吸取对照品溶液与供试品溶液注入高效液相色谱仪，按照 高效液相色谱法测定，得到痰热清胶囊内容物HPLC标准指纹图谱，其中测定色谱条件包括：
[0049] 色谱柱为Ultimate XB-C18柱（5wii，4.6mmX250mm);检测波长为280nm;柱温：30 °C ;进样量：10此。流动相A为乙腈，流动相B为0.2%甲酸水溶液，进行梯度洗脱，洗脱程序见 下表1，其中流动性比例均为体积百分比：
[0050] 表1梯度洗脱程序表
[0052]实施例2指纹图谱建立方法的方法学考察 [0053] 1)精密度试验
[0054] 采用和实施例1相同的操作和条件，精密吸取同一供试品溶液，连续进样6次，考察 色谱峰相对保留时间和相对峰面积的一致性。以异绿原酸C(10号峰)为参照峰，计算其中各 个色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。
[0055] 结果表明，各个色谱峰相对保留时间的相对标准偏差RSD均低于0.5%，各个色谱 峰相对峰面积的相对标准偏差RSD均低于2.0%，符合指纹图谱要求。
[0056] 2)稳定性考察
[0057]采用和实施例1相同的操作和条件，制备供试品溶液，温室封闭放置，分别在0、2、 4、8、12、24h进样分析，考察色谱峰相对保留时间和相对峰面积的一致性。以异绿原酸C(10 号峰)为参照峰，计算其中各个色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。
[0058]结果表明，各个色谱峰相对保留时间的相对标准偏差RSD均低于0.5%，各个色谱 峰相对峰面积的相对标准偏差RSD均低于1.7%，表明供试品溶液在24h内基本稳定。
[0059] 3)重复性试验
[0060] 采用和实施例1相同的操作和条件，取同一批号样品，制备供试品溶液6份，考察色 谱峰相对保留时间和相对峰面积的一致性。
[0061] 结果表明，各个色谱峰相对保留时间的相对标准偏差RSD均低于0.5%，各个色谱 峰相对峰面积的相对标准偏差RSD均低于2.8%，符合指纹图谱要求。
[0062 ]实施例3痰热清胶囊内容物的对照指纹图谱的建立
[0063] 按照实施例1所述方法对S1至S3批次痰热清胶囊内容物进行分析测定，获得指纹 图谱。
[0064] 所获得指纹图谱中共有16个特征峰，以10号峰为参照峰，16个特征峰的相对保留 时间范围分别为:峰1:0.190~0.191;峰2:0.305~0.306;峰3:0.336~0.337;峰4:0.414~ 0?415;峰5:0?628~0?630;峰6:0?668~0?670;峰7:0?717~0?718;峰8:0?794~0?796;峰 9:0.846~0.847;峰10:1.000;峰11:1.109~1.003;峰12:1.137~1.140;峰13:1.222~ 1.225;峰14:1.231~1.234;峰15:1.297~1.301;峰16:1.565~1.571;
[0065] 通过对痰热清胶囊与组成复方的各个药材进行相关性研究：采用HPLC法，按照痰 热清胶囊指纹图谱测定方法获取痰热清胶囊供试品、各个药材样品以及其阴性复方供试品 的指纹图谱，利用色谱保留时间相对偏差指标考察其相关性，对痰热清胶囊化学指纹图谱 的峰归属进行分析;在此基础上，取绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异 绿原酸C、咖啡酸、黄芩苷、野黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、千层纸素A-7-0-葡萄糖醛酸苷、白 杨素-7-0-葡萄糖醛酸苷、连翘苷、连翘酯苷A、异连翘酯苷A对照品，制成单一成分的对照品 溶液，分别按照痰热清胶囊指纹图谱测定方法获取指纹图谱，利用相同成分色谱峰保留时 间的一致性确定各成分;经分析比较确定16个特征峰的来源，其中对应于原料药，7、11、13、 14、15、16号峰归属于痰热清胶囊中的黄芩，1、2、3、4、8、9、10号峰归属于金银花，5、6、12号 峰归属于连翘;并且，1号峰为新绿原酸、2号峰为绿原酸、3号峰为隐绿原酸、4号峰为咖啡 酸、5号峰为异连翘酯苷A、6号峰为连翘酯苷A、7号峰为野黄芩苷、8号峰为异绿原酸B、9号峰 为异绿原酸A、10号峰为异绿原酸C、ll号峰为黄芩苷、12号峰为连翘苷、13号峰为千层纸素 A-7-0-葡萄糖醛酸苷、14号峰为白杨素-7-0-葡萄糖醛酸苷、15号峰为汉黄芩苷、16号峰为 黄芩素。
[0066]将这3批痰热清胶囊内容物的HPLC色谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价 系统》(2.0版)软件中，进行色谱峰匹配，软件自动生成痰热清胶囊内容物的对照指纹图谱， 见图1，并获得3批痰热清胶囊内容物的相似度，结果为3批痰热清胶囊供试品的相似度均为 1.000。以10号峰(异绿原酸C)为参照峰(S)，计算各个色谱峰相对保留时间和相对峰面积结 果见表2。
[0067] 本发明提供的对照指纹图谱可用于检测痰热清胶囊的质量，可以计算待测样品的 指纹图谱与对照指纹图谱的相似度，如果相似度大于0.900，则为合格产品。
[0068] 表2 3批痰热清胶囊内容物共有峰的相对保留时间和相对峰面积
[0070] 实施例4色谱条件的选择和优化
[0071] 由于痰热清胶囊为复方，成分复杂，在确定本发明的色谱条件之前，进行多次比较 实验。主要包括：
[0072] 1)流动相系统的考察
[0073]由于痰热清胶囊的化学成分复杂且极性较大，采用等度洗脱时各组分峰分离不理 想，不能有效检测样品中的各成分峰，故选择梯度洗脱进行色谱分离，分别考察了〇 . 2 %甲 酸-甲醇、0.2%甲酸-乙腈、0.1%甲酸-乙腈以及水-乙腈等不同流动相系统，色谱图见图2， 经过比较四种不同流动相系下统获得的色谱图，0.2%甲酸-乙腈的流动相系统获得的图谱 基线平稳、各峰分布均匀、分离效果较好，因此选择0.2%甲酸-乙腈作为流动相。
[0074] 2)色谱柱的考察
[0075]分别使用Ultimate XB_C18(5iim，4.6mmX250mm)柱、Shiseido Capcell PAK C18-MG(5tim，4.6mmX250mm)柱、Agilent Zorbax SB_C18(5iim，4.6mmX250mm)柱三种色谱柱对 样品进行测定，色谱图见图3,由图可知，Ultimate XB-C18(5iim，4.6mmX250mm)柱对成分的 保留分离效果较好，因此选用Ultimate XB_C18(5iim，4.6mmX250mm)柱。
[0076] 3)柱温的考察
[0077] 分别使用柱温25°C、30°C、35°C对样品进行测定，色谱图见图4,由图可知，柱温为 30°C时，各峰分布均匀，分离度较好，因此选择柱温为30°C。
[0078]以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的特点。本行业的技术 人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明 的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种 变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所 附的权利要求书及其等效物界定。
【主权项】
1. 一种痰热清胶囊指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述痰热清胶囊由黄芩、熊胆 粉、山羊角、金银花和连翘组成;通过采用高效液相色谱法检测痰热清胶囊成分建立痰热清 胶囊指纹图谱，具体步骤如下： 1) 制备对照品溶液:取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异连翘酯苷A、连翘酯苷A、 野黄芩苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、黄芩苷、连翘苷、千层纸素 A-7-0-葡萄糖醛酸 苷、白杨素-7-0-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷和黄芩素，加甲醇制成各个对照品浓度为IOOyg/ mL的混标溶液，作为对照品溶液； 2) 制备供试品溶液:取痰热清胶囊内容物IOmg，加70 %甲醇ImL，超声IOmin，离心，取上 清溶液，经0.22μπι微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品溶液； 3) 制作痰热清胶囊指纹图谱:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液注入高效液相色 谱仪，根据以下色谱条件进行测定，记录90分钟的色谱图，得到指纹图谱;其中：所述色谱条 件如下： 采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱;柱温为30°C;检测波长为280nm;以乙腈 为A相，0.2%甲酸水溶液为B相组成流动相，采用梯度洗脱方式，其洗脱时间、流动相体积和 流速分别为： O-IOmin，A相：10-12%、B相：90-88%，流速为 1.0mL/min; 10-15min，A相：12-12 %、B相：88-88 %，流速为 1 · OmL/min; 15-20min，A相：12-19 %、B相：88-81 %，流速为 1 · OmL/min; 20-38min，A相：19-20 %、B相：81-80 %，流速为 1 · OmL/min; 38-40min，A相：20-30 %、B相：80-70 %，流速为 1 · 0-0 · 8mL/min; 40-60min，A相：30-30 %、B相：70-70 %，流速为O · 8mL/min; 60-65min，A相：30-90 %、B相：70-10 %，流速为O · 8-1 · OmL/min; 65-75min，A相：90-90 %、B相：10-10 %，流速为 1 · OmL/min; 75-80min，A相：90-10 %、B相：10-90 %，流速为 1 · OmL/min; 80-90min，A相：10-10 %、B相：90-90 %，流速为 1 · OmL/min。2. -种如权利要求1所述的痰热清胶囊指纹图谱的建立方法得到的指纹图谱，其特征 在于，所述建立方法得到的指纹图谱中共有16个特征峰，其中10号峰为对照品异绿原酸C， 各峰以10号峰为参照峰的相对保留时间和相对峰面积如下： 相对保留时间： 峰I:O·190~O·191;峰2:O·305~O·306;峰3:O·336~O·337;峰4:O·414~O·415;峰5: O·628~O·630;峰6:O·668~O·670;峰7:O·717~O·718;峰8:O·794~O·796;峰9:O·846~ 0.847;峰10:1.000;峰11:1.109~1.003;峰12:1.137~1.140;峰13:1.222~1.225;峰14: 1.231~1.234;峰15:1.297~1.301;峰16:1.565~1.571; 相对峰面积： 峰I:O·116~O·119;峰2:0·633~O·651;峰3:0·233~O·244;峰4:0·211~O·217;峰5: O·634~O·650;峰6:1·306~1·368;峰7:O·636~O·655;峰8:O·561~O·588;峰9:O·505~ 0.527;峰10:1.000;峰11:52.040~54.917;峰12:0.204~0.212;峰13:1.518~1.559;峰 14:0.723~0.746;峰15:0.139~0.148;峰16:1.385~1.452。
【文档编号】G01N30/02GK105891353SQ201610192503
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年3月30日
【发明人】徐英, 刘绍勇, 薛东升, 钟苹苹, 张小利
【申请人】上海凯宝药业股份有限公司