当药药材指纹图谱的建立方法及其指纹图谱和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于中药材指纹图谱构建和中药材质量控制方法技术领域，尤其当药药材指纹图谱的建立方法及其指纹图谱和应用。
【背景技术】
[0002]当药又名猜芽菜为龙胆科猜芽菜属植物瘤毛猜牙菜(SwertiapseudochinensisHara)，《内蒙古中草药》中有记载当药生长在500 — 600米的灌木、林下或山坡中。当药全草入药、性寒、味苦、当药有清肝利胆、清湿热、健胃、抗炎、改善微循环的功效，目前主要用于急慢性黄疸型肝炎、胆囊炎等疾病的治疗。中国专利CN104013638A公开了当药黄素或其衍生物药效学分析，提出了当药黄素在抗抑郁药物中的新用途。
[0003]目前，其主要的中药制剂有当药片、愈肝片、当飞利肝宁胶囊，主要用于肝病的防治与治疗，并取得了良好的效果。当药作为治疗肝病的首选药物，需求量巨大，拥有广泛的临床应用前景。当药作为传统治疗肝炎的药物已被收入《中华人民共和国药典2015版一部》药材标准中以獐芽菜苦苷、当药苷为对照品用高效液相色谱法用于当药的鉴别。众多獐芽菜属植物都含有獐牙菜苦苷和当药苷，当药替代品种类繁多，依产地不同各有差异，使用及其混乱，如标准只能粗略地鉴别当药的真伪，为全面、准确、有效地控制当药的质量及合理利用当药有必要建立当药的指纹图谱，弥补当药质量控制不足，使其更加完善、科学。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种当药药材指纹图谱的建立方法，通过此方法可以保证当药药材的质量稳定性、一致性和可控性，从而确保当药药材的安全性和有效性。同时提供由此方法所得到的当药药材的指纹图谱及应用。
[0005]为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下:
技术方案一:
一种当药药材指纹图谱的建立方法，其具体包括如下步骤:
(1)供试品溶液的制备:取当药药材，粉碎后，提取溶液提取，过滤，得到供试品溶液；
(2)制作当药药材指纹图谱:将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，在高效液相色谱检测条件下进行分析，得到当药药材的指纹图谱，所述高效液相色谱检测条件如下:
色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，流动相为甲醇-乙腈-pH为2.5-5.0的磷酸二氢钠缓冲液，采用梯度洗脱，进样量为10?30yL;流速0.8-1.0mL/min，紫外检测波长200?400nm，柱温 20~40°C。
[0006]作为本发明进一步的改进，所述供试品溶液的制备方法中以25mL乙醇为提取溶液。
[0007]作为本发明进一步的改进，步骤(1)中，提取方法为浸渍/超声提取。
[0008]作为本发明进一步的改进，所述供试品溶液的制备方法为:取当药药材0.5?1.0g至于锥形瓶中，加50?80%乙醇25mL，精密称重，浸泡12h，超声20min，放冷，用50?80%乙醇补足减失重量，经ο.22μπι微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液。
[0009]作为本发明进一步的改进，所述高效液相色谱检测条件:
色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶为填料；
流动相:Α有机相:甲醇-乙腈，B水相:pH为2.5-5.0的磷酸二氢钠缓冲液，梯度洗脱程序为:0min—6 min^20 min^30 min^40 min^70 min^80 min^95 min—120min，A有机相5?10% —12?15% —18?20% —22?25% —30?36% —40?44% —46?50% —58?65% —70?90%；
进样量:10~30yL;
流速:0.8?1.0mL/min；
柱温为20?40°C;
检测波长:200?400nm。
[0010]作为本发明进一步的改进，所述高效液相色谱检测条件:
色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶为填料；
流动相:A有机相:体积比为5: 3的甲醇-乙腈，B水相:pH为3.5-4.0的磷酸二氢钠缓冲液，梯度洗脱程序为:0min—6 min—20 min—30 min—40 min—70 min—80 min—95 min— 120min，A有机相5?10% -^12-15% -^18-20% -^23% -^35% -^40% -^48% -^60% -^90%；进样量:10-20yL;
流速:0.8?1.0mL/min；
柱温为25-35°C;
检测波长:247nm0
[0011]作为本发明进一步的改进，所述高效液相色谱检测条件:
色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶为填料；
流动相:A有机相:体积比为5: 3的甲醇-乙腈，B水相:pH为3.9的磷酸二氢钠缓冲液，梯度洗脱程序为:Omin—6 min^20 min^30 min^40 min^70 min^80 min^95 min—120min，A有机相5%— 12%^ 18%^23%^35%^40%^48%^60%^90%；色谱柱:Cosmosi 1 C18柱(4.6mm X 250mm, 5μηι)；进样量:10yL ；流速:0.8mL/min ；柱温为:30°C ；检测波长:247nm。
[0012]作为本发明进一步的改进，还包括步骤(3)标准指纹图谱的确定:
按照步骤(1)和步骤(2)提供的方法，对11批当药药材建立了 HPLC指纹图谱，通过分析比较，确定了 23个共有特征峰，所述23个共有特征峰的相对保留时间如下:
1号峰平均保留时间为22.23min;
2号峰平均保留时间为23.35 min；
3号峰平均保留时间为26.22 min；
4号峰平均保留时间为28.17 min；
5号峰平均保留时间为30.43 min；
6号峰平均保留时间为39.32min;
7号峰平均保留时间为39.92min;
8号峰平均保留时间为40.45min;
9号峰平均保留时间为43.84min;
10号峰平均保留时间为44.60min; 11号峰平均保留时间为45.91min;
12号峰平均保留时间为49.86min;
13号峰平均保留时间为52.01min;
14号峰平均保留时间为61.59min；
15号峰平均保留时间为68.06min;
16号峰平均保留时间为84.60min;
17号峰平均保留时间为85.53min;
18号峰平均保留时间为91.20min;
19号峰平均保留时间为98.85min;
20号峰平均保留时间为105.1 lmin;
21号峰平均保留时间为108.37min;
22号峰平均保留时间为115.67min;
23号峰平均保留时间为117.22min;
以上23个共有特征峰构成了当药药材的指纹特征，可作为当药药材的标准指纹图谱。
[0013]技术方案二:
一种当药药材指纹图谱，包括23个共有特征峰，相对保留时间如下:
1号峰平均保留时间为22.23min;
2号峰平均保留时间为23.35 min；
3号峰平均保留时间为26.22 min；
4号峰平均保留时间为28.17 min；
5号峰平均保留时间为30.43 min；
6号峰平均保留时间为39.32min;
7号峰平均保留时间为39.92min;
8号峰平均保留时间为40.45min;
9号峰平均保留时间为43.84min;
10号峰平均保留时间为44.60min;
11号峰平均保留时间为45.91min;
12号峰平均保留时间为49.86min;
13号峰平均保留时间为52.01min;
14号峰平均保留时间为61.59min；
15号峰平均保留时间为68.06min;
16号峰平均保留时间为84.60min;
17号峰平均保留时间为85.53min;
18号峰平均保留时间为91.20min;
19号峰平均保留时间为98.85min;
20号峰平均保留时间为105.11π?η;
21号峰平均保留时间为108.37min;
22号峰平均保留时间为115.67min;
23号峰平均保留时间为117.22min。
[0014]技术方案三:
本发明所提供的当药药材指纹图谱的建立方法在当药药材的质量检测中的应用。
[0015]本发明所指当药是《中华人名共和国药典一部》(2010版)记载的的当药(Swertiaeherba)干燥全草。
[0016]本发明原理是通过建立当药的指纹图谱，比较不同品种当药及其市售当药代用品的化学成分差异。其指纹图谱能从整体上体现不同獐芽菜属植物化学成分的含量差异，本方法适用于正品当药及其代用品的指纹图谱的测定。
[0017]与现有技术相比，本发明当药药材的指纹图谱的建立方法及其特征指纹图谱有以下显著的效果:
(1)供试品溶液的制备方法简便，易于操作，提取得到的当药化学成分全面，便于当药药材的指纹图谱的建立。
[0018](2)用本发明所提供的方法所建立的HPLC指纹图谱，能有效地表征当药药材信息，可有效控制药材质量。
[0019](3)本发明建立的方法简便、重现性好、精密度高、稳定性好、特征峰全面，适于对当药药材真伪、产地和品质的鉴别与控制。
[0020](4)综合运用了指纹图谱的共有峰比较、聚类分析和主成份分析的方法实现对当药药材的基源鉴别和有效分类，为当药药材的质量控制、有效临床使用提供依据。
[0021](5)本发明提供的方法通过研究确定了最优的参数条件，采用梯度洗脱方法获得了较好的分离效果，确定23个主要特征峰为共有峰，建立了能够使多数化学成分有效分离的当药药材指纹图谱。
【附图说明】
[0022]附图1为本发明的当药特征指纹图谱；
附图2为11批当药药材的特征指纹图谱。
【具体实施方式】
[0023]以下结合具体实施例对本发明进行进一步详细的叙述。
[0024]仪器和试药
实验用当药药材共11批，均购自不同的中草药店;使用Shimadzu LC-lOATvp高效液相色谱仪(日本岛津);试剂为色谱纯或分析纯。
[0025]实施例1
(1)供试品溶液的制备
取当药药材0.5g至于锥形瓶中，加70%乙醇25mL，精密称重，浸泡12h，超声20min，放冷，用70%乙醇补足减失重量，经0.22μπι微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液。
[0026](2)高效液相色谱检测条件
色谱柱Cosmosil (318柱(4.6111111\2501]1111，5口111)，流动相为A有机相(甲醇:乙腈=5:3)B水相(pH为3.9磷酸二氢钠缓冲盐)，采用梯度洗脱，洗脱程序如下:0min—6 min—20 min—30min440min470min480min—95min4l20min，A 有机相 5%4l2%4l8%423%435%—40%-^48%^60%^90% ；进样量为10yL ；流速0.8mL/min，柱温为30°C，检测波长:247nm ；精密吸取供试品溶液20yL注入高效液相色谱仪，经照高效液相色谱分离检测，得到当药材的指纹图谱，如附图1所示。
[0027](3)按照步骤(1)和步骤(2)的方法，对11批当药药材建立了 HPLC指纹图谱(见附图2)，通过分析比较，确定了 23个共有特征峰，所述23个共有特征峰的相对保留时间如下:
1号峰平均保留时间为22.23min;
2号峰平均保留时间为23.35 min；
3号峰平均保留时间为26.22 min；
4号峰平均保留时间为28.17