一种感冒灵颗粒的指纹图谱检测方法
【专利摘要】本发明属于中药制剂检测领域，具体涉及一种感冒灵颗粒的指纹图谱检测方法。本发明所述方法利用高效液相色谱法通过对感冒灵颗粒中包含蒙花苷在内的中药成分的检测，能够全面反映感冒灵颗粒的质量信息，有效控制感冒灵颗粒的内在质量；并且所建立的方法稳定性、精密度、重现性较好；采用国家药典委员会规定的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件操作快捷、结果客观准确。
【专利说明】一种感冒灵颗粒的指纹图谱检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于中药制剂检测领域，具体涉及一种感冒灵颗粒的指纹图谱检测方法。
【背景技术】
[0002]中药成分复杂，药效部位常常不是单一成分，以某种单一成分作为质量控制指标已越来越不适应中药质量控制的要求，因此，中药指纹图谱技术应运而生。
[0003]中药指纹图谱技术源于指纹鉴定学，利用现代信息技术和质量分析手段较全面的反映了中药所含化学成分的种类和数量。对于中药材，指纹图谱可以用来鉴别真伪、评判优劣；对于中成药，指纹图谱可以鉴别产品真伪，评判制备工艺的合理性，有效地控制产品质量。现阶段中药的有效成分大多数尚不明确，中药指纹图谱的整体性和模糊性正好适应这一特点，较单一成分的质量控制方法更具有科学性和全面性。目前国际上已认可将中药指纹图谱作为中药质量的控制模式。高效液相色谱法具有分离效能高、分析速度快等优点，已成为当今指纹图谱的主要分析手段。
[0004]感冒灵颗粒收载于中华人民共和国药品标准中药成方制剂第八册，由三叉苦、金盏银盘、野菊花、岗梅、咖啡因、对乙酰氨基酚、马来酸氯苯那敏、薄荷素油共八味原料药组成，具有解热镇痛功效，用于感冒引起的头痛、发热、鼻塞流涕、咽痛等。
[0005]感冒灵颗粒在中药成方制剂第八册标准中公开了用薄层色谱法鉴别马来酸氯苯那敏、对乙酰氨基酚，用永停法测定对乙酰氨基酚的含量的方案。但是存在含量测定方法的终点不易观察、操作繁琐复杂、准确性欠佳的问题。
[0006]吴广等人在《中国药品标准》(2005,6(3):32_35)报道了感冒灵颗粒薄层鉴别和含量测定的方法，即在原标准的基础上增订了咖啡因、野菊花的薄层鉴别，修订了对乙酰氨基酚的含量测定；在后续的研究中，庄幼龄在《海峡药学》(2009,21(12):90-91)中公开了用HPLC法同时测定感冒灵颗粒中对乙酰氨基酚和咖啡因含量的方法；韩正洲等在《中国药学杂志》(2010，45(3) =228-230)中报道了用HPLC测定对乙酰氨基酚、咖啡因、马来酸氯苯那敏的含量的方法；陈在敏在《中国研究与信息》(2005，17(4):50-51)公开了 HPLC法测定蒙花苷的含量的方法；陈怀冰在《海峡药学》(2009，21 (I):53-54)报道了 HPLC法测定绿原酸的含量。
[0007]上述对感冒灵颗粒的质量控制方法中，往往是选取感冒灵颗粒中三个化学成分或一两个中药材中的已知成分进行含量测定，用其含量的多少判定质量好坏。但由于中药材质量受产地、气候、季节等多方面影响，导致所含成分的种类及含量往往不稳定，中药部分只检测其中单一成分的含量具有一定片面性。因此，以上方法均不能系统、全面的反映感冒灵颗粒的内在质量。
[0008]为保障患者用药安全有效，发明一种控制感冒灵颗粒整体质量的检测方法迫在眉睫。
【发明内容】
[0009]为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种可全面反映感冒灵颗粒的内在质量及用药安全的指纹图谱检测方法。
[0010]本发明提供了一种感冒灵颗粒的指纹图谱检测方法，包括如下步骤:
[0011]精密称定蒙花苷，加甲醇溶解稀释，制成每I体积份含0.00001重量份的蒙花苷对照品溶液；
[0012]取感冒灵颗粒粉末2.0-6.0重量份，加甲醇20-30体积份，进行超声处理，放冷后称定并以甲醇补足重量，滤过后取滤液5-15体积份，蒸干，残渣用50%甲醇溶解，并定容至5体积份，微孔滤膜过滤制成供试品溶液；
[0013]照高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，以乙腈为流动相A、以0.1%甲酸溶液为流动相B，控制流速为0.8-1.2ml/min，柱温30°C，检测波长为310nm ;按照如下程序进行梯度洗脱:从0-15min，流动相A:流动相B的体积比由8%:92% — 10%:90% ;从 15-30min，流动相 A:流动相 B 体积比由 10%:90%^ 15%:85% ;从 30_70min，流动相A:流动相B体积比由15%:85%- 30%:70% ;从70_71min，流动相A:流动相B体积比由30%:70% — 8%:92% ;从71-75min，流动相A:流动相B体积比8%:92% ;理论板数按蒙花苷峰计算，应不低于3000 ；
[0014]吸取供试品溶液与对照品溶液10 μ 1-20 μ 1，注入液相色谱仪，测定；
[0015]所述重量份与所述体积份的关系为g/mL的关系。
[0016]优选的，所述供试品溶液制备的步骤具体为:取感冒灵颗粒粉末4.0重量份，加甲醇25体积份，进行超声处理，放冷后称定并以甲醇补足重量，滤过后取滤液10体积份，蒸干，残渣用50%甲醇溶解，并定容至5体积份，微孔滤膜过滤制成供试品溶液。
[0017]优选的，所述供试品溶液制备的步骤具体为:取感冒灵颗粒粉末3.0重量份，加甲醇28体积份，进行超声处理，放冷后称定并以甲醇补足重量，滤过后取滤液8体积份，蒸干，残渣用50%甲醇溶解，并定容至5体积份，微孔滤膜过滤制成供试品溶液。
[0018]优选的，所述供试品溶液制备的步骤具体为:取感冒灵颗粒粉末5.0重量份，加甲醇22体积份，进行超声处理，放冷后称定并以甲醇补足重量，滤过后取滤液12体积份，蒸干，残渣用50%甲醇溶解，并定容至5体积份，微孔滤膜过滤制成供试品溶液。
[0019]优选的，所述供试品溶液制备的步骤中，所述超声处理步骤的功率200W，频率为59KHz，超声处理 20-40min。
[0020]优选的，所述高效液相色谱法检测步骤中，所述色谱柱为Kromasil C18柱。
[0021]本发明所述感冒灵颗粒的相关信息记载于中华人民共和国药品标准中药成方制剂第八册，原料药组成为:三叉苦442-540重量份、金盏银盘295-349重量份、野菊花221-270重量份、岗梅720-750重量份、咖啡因0.36-0.44重量份、对乙酰氨基酚18-22重量份、马来酸氯苯那敏0.36-0.44重量份、薄荷素油0.18-0.22体积份。
[0022]相关方案可详见中国专利CN102147360A。
[0023]本发明还公开了由上述方法构建得到的感冒灵颗粒的指纹图谱，得到的感冒灵颗粒的标准指纹图谱详见图4所示，所得的感冒灵颗粒的标准指纹图谱包括14个共有峰，各峰号的相对保留时间(以14号峰蒙花苷为基准)分别为:1号峰0.070、2号峰0.085、3号峰0.114,4 号峰 0.131,5 号峰 0.150,6 号峰 0.257,7 号峰 0.302,8 号峰 0.455,9 号峰 0.674、
10号峰 0.731、11 号峰 0.754、12 号峰 0.813、13 号峰 0.990、14 号峰 1.000。
[0024]本发明还公开了上述方法用于感冒灵颗粒检测中的用途。
[0025]本发明所述的感冒灵颗粒的指纹图谱检测方法，通过对包含蒙花苷在内的中药成分的检测分析，能够全面反映感冒灵颗粒的质量信息，有效控制感冒灵颗粒的内在质量；并且所建立的方法稳定性、精密度、重现性较好；采用国家药典委员会规定的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件操作快捷、结果客观准确。
[0026]实验例
[0027]实验例一条件优化
[0028]I仪器与试药:
[0029]仪器:Waters e 2695高效液相色谱仪，DAD检测器，Empower色谱工作站，AG245型电子天平(Mettler Toledo)，SK5200H超声波清洗机。
[0030]试药:乙腈为色谱纯，水为超纯水，甲醇和甲酸为分析纯，蒙花苷对照品(由中国药品生物制品检定所提供)，感冒灵颗粒(由华润三九医药股份有限公司提供)。
[0031]2色谱条件优化
[0032]2.1色谱柱的选择
[0033]在同一色谱条件下，选择Kromasil C18 (250mmX 4.6mm, 5um)、Hypersil BDSC18 (250mmX4.6mm, 5um) >Sapphire C18 (250mmX4.6mm, 5um)三种色谱柱进行比较，获得的色谱图结果见图1所示。
[0034]Hypersil柱峰之间未达到基线分离,Sapphire柱各峰对称性较差,而Kromasil分离效果较好、检出峰多、保留时间适宜，故选择Kromasil C18 (250mmX4.6mm, 5um)为感冒灵颗粒指纹图谱分析用色谱柱。
[0035]2.2检测波长的选择
[0036]对不同波长条件下感冒灵颗粒指纹图谱进行了比较，选择了 254nm、280nm、300nm、310nm、320nm五个波长进行比较，获得的色谱图结果见图2所示。
[0037]结果显示，选择310nm时吸收峰较多，峰形较好，各峰分离度好，基线平稳，且在此波长下对乙酰氨基酚、咖啡因、马来酸氯苯那敏均无吸收峰，充分显示感冒灵颗粒中药部分的指纹特征，故选择310nm作为检测波长。
[0038]2.3流速的选择
[0039]考察了流速0.8、1.0、1.2ml/min对分离度的影响，结果表明三种流速均可行。
[0040]2.4流动性梯度选择
[0041]米用Kromasil C18 (250mmX 4.6mm, 5um)色谱柱；流速1.0ml/min ;检测波长310nm ；柱温:30°C ;进样量20 μ I ;以乙腈为A相、0.1 %甲酸溶液为B相，采用以下三种梯度洗脱:
[0042]a)、从 0_15min，A:Β(ν/ν)由 8%:92%—10%:90% ;从 15_30min, A:Β(ν/ν)由10%:90%— 15%:85% ;从 30-70min，A:B(v/v)由 15%:85%— 30%:70% ;从 70_71min，A:B(v/v)由 30%:70% — 8%:92% ;从 71_75min，A:B(v/v)为 8%:92% ;
[0043]b)、从 0-15min，A:B(v/v)由 5%:95%^ 10%:90% ;从 15_30min，A:B(v/v)由10%:90%^ 20%:80% ;从 30-70min，A:B(v/v)由 20%:80% — 30%:70% ;从 70_71min，A:B(v/v)由 30%:70%— 5%:95% ;从 71_75min，A:B(v/v)为 5%:95% ；
[0044]c)、从 0-20min，A:B(v/v)由 8%:92%^ 10%:90% ;从 20_35min，A:B(v/v)由10%:90%^ 20%:80% ;从 35-65min，A:B(v/v)由 20%:80% — 30%:70% ;W65_66min，A:B (v/v)由 30%:70%^ 8%:92% ;从 66_70min，A:B (v/v)为 8%:92%。
[0045]各梯度洗脱程序下得到的对应的色谱图结果见图3所示。
[0046]从图中可见，采用梯度方式a)得到的色谱图分离度较好，基线平稳，保留时间适宜，故选择梯度a)作为感冒灵颗粒指纹图谱分析的色谱条件。
[0047]3感冒灵颗粒样品制备的优化
[0048]3.1供试品溶液制备方法的选择
[0049]采用现有技术中的四种制备方法获得供试品溶液，具体如下:
[0050]a、取感冒灵颗粒粉末2.0g,精密称定，置25ml量瓶中，加50 %甲醇20ml，超声处理30min，取出，放冷，加50%甲醇至刻度，摇匀，滤过，滤液过0.45 μ m微孔滤膜，即得；
[0051]b、取感冒灵颗粒粉末4.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇25ml，称重，超声处理30min，取出，放冷，用甲醇补重，滤过，精密移取上清液5ml置1ml量瓶中，加水定容，摇匀，过0.45 μ m微孔滤膜，即得；
[0052]C、取感冒灵颗粒粉末4.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇25ml，称重，超声处理30min，取出，放冷，用甲醇补重，滤过，精密移取滤液1ml至蒸发皿中，水浴挥干，残渣用50%甲醇溶解置5ml量瓶中并定溶至刻度，摇匀，过0.45 μ m微孔滤膜，即得；
[0053]d、取感冒灵颗粒粉末4.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇25ml，称重，超声处理30min，取出，放冷，用甲醇补重，滤过，滤液过0.45 μ m微孔滤膜，即得。
[0054]分别对上述a_d四种制备方法所得的感冒灵颗粒色图谱按照上述优化后的条件进行检测。结果显示，其指纹图谱的整体相同。但采用方法a时，供试品溶液较难过滤；采用方法b、d时，供试品峰面积较小，需要较大的进样量才能达到预期的峰面积；另外方法d中，甲醇作为供试品溶剂，各色谱峰峰形较差。综合考虑，最终选择方法c作为感冒灵颗粒供试品溶液的制备方法。
[0055]3.2超声处理时间的选择
[0056]试验比较了在供试品溶液制备中，超声处理的时间分别为10min、20min、30min和40min的感冒灵颗粒指纹图谱。结果发现，随着超声时间的延长，各色谱峰峰面积有所增加，但超声30min与40min的无差异,较佳的超声处理时间为30min。
[0057]实验例二:感冒灵指纹图谱方法验证
[0058]I指纹图谱检测
[0059]按照上述实验中优化后的检测条件进行感冒灵颗粒的指纹图谱检测，具体包括:
[0060]精密称定蒙花苷，加甲醇溶解稀释，制成每I体积份含0.00001重量份的蒙花苷对照品溶液；
[0061]取感冒灵颗粒粉末4.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇25ml，称重，超声处理(200W、59KHz)30min，取出，放冷，用甲醇补重，滤过，精密移取滤液1ml至蒸发皿中，水浴挥干，残渣用50%甲醇溶解置5ml量瓶中并定溶至刻度，摇匀，过0.45 μ m微孔滤膜，即得供试品溶液；
[0062]照高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，以乙腈为流动相A、以0.1%甲酸溶液为流动相B，控制流速为0.8-1.2ml/min，柱温30°C，检测波长为310nm ;按照如下程序进行梯度洗脱:从0-15min，流动相A:流动相B的体积比由8%:92% — 10%:90% ;从 15-30min，流动相 A:流动相 B 体积比由 10%:90%^ 15%:85% ;从 30_70min，流动相A:流动相B体积比由15%:85% — 30%:70% ;从70-7Imin，流动相A:流动相B体积比由30%:70% — 8%:92% ;从71-75min，流动相A:流动相B体积比8%:92% ;理论板数按蒙花苷峰计算，应不低于3000 ；
[0063]吸取供试品溶液与对照品溶液10 μ 1-20 μ 1，注入液相色谱仪，测定。
[0064]检测得到的感冒灵颗粒的标准指纹图谱详见图4所示，所得的感冒灵颗粒的标准指纹图谱包括14个共有峰，各峰号的相对保留时间分别为:(1)0.070、(2)0.085、
(3)0.114、(4)0.131、(5)0.150、(6)0.257、(7)0.302、(8)0.455、(9)0.674、(10)0.731、
(11)0.754、(12)0.813、(13)0.990、(14) 1.000。
[0065]2精密度试验
[0066]取同一份感冒灵颗粒供试品，按照上述实验中优化后的检测条件进行指纹图谱检测，并连续进样6次。取同一份感冒灵颗粒供试品溶液，连续进样6次，以蒙花苷为参照峰，结果各主要色谱峰的相对保留时间RSD均小于0.5%，检测结果见表1所示。
[0067]以第一次分析所得指纹图谱为对照图谱，其他5次分析所得指纹图谱与对照图谱相比，相似度计算结果为:1.000、1.000、1.000、1.000、1.000，说明仪器精密度良好。
[0068]表1感冒灵颗粒精密度试验相对保留时间
【权利要求】
1.一种感冒灵颗粒的指纹图谱检测方法，其特征在于，包括如下步骤: 精密称定蒙花苷，加甲醇溶解稀释，制成每I体积份含0.0OOOl重量份的蒙花苷对照品溶液； 取感冒灵颗粒粉末2.0-6.0重量份，加甲醇20-30体积份，进行超声处理，放冷后称定并以甲醇补足重量，滤过后取滤液5-15体积份，蒸干，残渣用50%甲醇溶解，并定容至5体积份，微孔滤膜过滤制成供试品溶液； 照高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，以乙腈为流动相A、以0.1%甲酸溶液为流动相B，控制流速为0.8-1.2ml/min，柱温30°C，检测波长为310nm ;按照如下程序进行梯度洗脱:从0-15min，流动相A:流动相B的体积比由8%:92% — 10%:90% ;从15_30min,流动相A:流动相B体积比由10%:90%^ 15%:85% ;从30_70min,流动相A:流动相B体积比由15%:85% — 30%:70% ;从70_7Imin,流动相A:流动相B体积比由30%:70%- 8%:92% ;从71-75min，流动相A:流动相B体积比8%:92% ;理论板数按蒙花苷峰计算，应不低于3000 ； 吸取供试品溶液与对照品溶液10 μ 1-20 μ 1，注入液相色谱仪，测定； 所述重量份与所述体积份的关系为g/mL的关系。
2.根据权利要求1所述的感冒灵颗粒的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述供试品溶液制备的步骤具体为: 取感冒灵颗粒粉末4.0重量份，加甲醇25体积份，进行超声处理，放冷后称定并以甲醇补足重量，滤过后取滤液10体积份，蒸干，残渣用50%甲醇溶解，并定容至5体积份，微孔滤膜过滤制成供试品溶液。
3.根据权利要求1所述的感冒灵颗粒的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述供试品溶液制备的步骤具体为: 取感冒灵颗粒粉末3.0重量份，加甲醇28体积份，进行超声处理，放冷后称定并以甲醇补足重量，滤过后取滤液8体积份，蒸干，残渣用50%甲醇溶解，并定容至5体积份，微孔滤膜过滤制成供试品溶液。
4.根据权利要求1所述的感冒灵颗粒的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述供试品溶液制备的步骤具体为: 取感冒灵颗粒粉末5.0重量份，加甲醇22体积份，进行超声处理，放冷后称定并以甲醇补足重量，滤过后取滤液12体积份，蒸干，残渣用50%甲醇溶解，并定容至5体积份，微孔滤膜过滤制成供试品溶液。
5.根据权利要求1-4任一所述的感冒灵颗粒的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述供试品溶液制备的步骤中，所述超声处理步骤的功率2 O OW，频率为5 9KHz，超声处理20_40mino
6.根据权利要求1-5任一所述的感冒灵颗粒的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法检测步骤中，所述色谱柱为Kromasil C18柱。
7.根据权利要求1-6任一所述的感冒灵颗粒的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述感冒灵颗粒的原料药组成为: 三叉苦442-540重量份、金盏银盘295-349重量份、野菊花221-270重量份、岗梅720-750重量份、咖啡因0.36-0.44重量份、对乙酰氨基酚18-22重量份、马来酸氯苯那敏0.36-0.44重量份、薄荷素油0.18-0.22体积份。
8.由权利要求1-7任一所述方法构建得到的感冒灵颗粒的指纹图谱，其特征在于，所述感冒灵颗粒的标准指纹图谱包括14个共有峰，各峰号的相对保留时间分别为:1号峰0.070,2 号峰 0.085,3 号峰 0.114、4 号峰 0.131,5 号峰 0.150,6 号峰 0.257,7 号峰 0.302、8号峰 0.455,9 号峰 0.674、10 号峰 0.731、11 号峰 0.754、12 号峰 0.813、13 号峰 0.990、14号峰1.000。
9.权利要求1-7任一所述方法用于感冒灵颗粒检测领域中的用途。
【文档编号】G01N30/02GK104181248SQ201410431650
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年8月28日 优先权日:2014年8月28日
【发明者】李琼娅, 林丽娜, 张跃飞, 马鹏岗 申请人:华润三九医药股份有限公司