青蒲颗粒的检测方法
【专利摘要】本发明提供了对青蒲颗粒或其中间体提取物中咖啡酸和秦皮乙素同时进行检测的方法。本发明通过多次试验研究，对同时测定两种成分的HPLC色谱条件进行了筛选和探索，得到了一种能同时检测青蒲颗粒或其中间体提取物中两种成分的含量测定方法，在该色谱条件下，两种成分色谱峰能够顺利分离，杂质峰无干扰，且保留时间适宜，峰形良好，能够达到顺利测定两种成分含量的目的，为制剂的质量研究奠定了基础，也可为其他同时含有秦皮乙素和咖啡酸两种成分制剂的定量研究提供借鉴方法。
【专利说明】青蒲颗粒的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及青蒲颗粒的检测方法。
【背景技术】
[0002] 兽医临床实践证明，体温反常是猪生理机能被扰乱的重要症状之一，猪的正常体 温为38?40°C，若连续地超过40°C以上，则为发热，长时间的延续高热，对机体损害大，首 先使机体分解代谢加速，营养物质耗费过多，消化机能错乱，导致机体消瘦，抵挡力下降，又 能使中枢神经系统和血液循环系统发生损害，引起病猪精神沉郁，以致昏迷，或心力衰竭等 严重后果。大量的现代研究表明，大量的中药均具有清热解毒，抗菌、抗病毒的作用，在治疗 一些发热性疾病具有自己独特的优势，青蒲颗粒是由紫花地丁、蒲公英等药材制成的中兽 药复方颗粒剂，具有清热解毒，凉血消肿的功效，主要用于猪发热病症的治疗，对猪精神萎 靡、体温升高、呼吸急促、口渴贪饮、食欲不振、尿液短黄、发热持续不退、全身发红等临床病 症均具有很好的治疗效果，治愈率达70%以上，具有很强的研究价值。
[0003] 蒲公英和紫花地丁均为青蒲颗粒处方中的主要药材，咖啡酸为蒲公英的主要有效 成分之一，具有显著的抗菌，抗病毒，中枢兴奋，解毒，凝血等作用；秦皮乙素为紫花地丁主 要有效成分之一，具有明显的抗炎、抑菌、镇痛、抗氧化、抗肿瘤和免疫调节等作用，因此，本 颗粒剂选择秦皮乙素和咖啡酸作为含量测定指标成分，采用高效液相色谱对颗粒剂中两种 成分进行测定研究。
[0004] 本类制剂前期研究表明，分别采用紫花地丁药材或蒲公英药材的高效液相色谱含 量测定方法对青蒲颗粒中秦皮乙素和咖啡酸两种成分同时进行测定时，两种成分的色谱峰 均互相干扰，分离度差，杂质成分干扰严重，峰面积差异大，含量测定较为困难。而当前文献 中还报道了其他产品中秦皮乙素和咖啡酸的含量检测方法，但这些方法多使用梯度洗脱， 其流动相程序较为复杂。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种采用等度洗脱条件对青蒲颗粒或其中间体提取物中 咖啡酸和秦皮乙素同时进行检测的方法。
[0006] 具体地，本发明提供了对青蒲颗粒中咖啡酸和秦皮乙素同时进行检测的方法，它 包括如下操作步骤：
[0007] (1)供试品溶液的制备：取青蒲颗粒研细后的粉末，精密称定，以甲醇提取制备供 试品溶液；
[0008] (2)对照品溶液的制备：取秦皮乙素对照品、咖啡酸对照品，以甲醇为溶剂制备对 照品溶液；
[0009] (3)分别取供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪中，以外标法计算青蒲 颗粒中咖啡酸和秦皮乙素含量即可；
[0010] 其中，青蒲颗粒由如下方法制备得到：
[0011] 取大青叶6?10重量份、蒲公英6?10重量份、紫花地丁 2?4重量份、甘草1? 2重量份；以上四味药材，加水煎煮，合并水煎液，浓缩，加蔗糖粉和淀粉适量，混匀，制成颗 粒。
[0012] 本发明研究表明：
[0013] (1)采用Agilent-ODS (4· 6X 150mm，5 μ m)短色谱柱进行试验时，由于色 谱柱长度限制，秦皮乙素与咖啡酸两种成分根本无法分开；而采用岛津WondaCract 0DS-2 (4. 6 X 250mm，5 μ m)长色谱柱进行试验，秦皮乙素与咖啡酸两种成分基本可分开，因 此，选择岛津 WondaCract 0DS-2(4.6X250mm，5ym)等长色谱柱。
[0014] (2)本发明虽然选定了较为适宜的色谱柱，但其分离效果仍人较差，存在杂质干 扰，尚需进行进一步的试验研究。研究发现，由于制剂中咖啡酸含量极低，样品浓度低， 353nm波长条件下峰面积很小，且秦皮乙素吸收峰后有严重拖尾。为了兼顾使两种成分的均 具有较好的吸收峰，最终选择测定波长为326nm。
[0015] (3)在限定了色谱柱型号和波长以后，虽然能够将秦皮乙素和咖啡酸分离，但分离 度依然较差。本发明发现，对柱温进行调节后，能够改善两色谱峰的分离度：当柱温条件为 25°C、30°C时两色谱峰可达到基线分离，且与其它杂质成分分离较好，优于35°C。
[0016] 因此，综合各方面因素，本发明最终拟定了如下色谱条件：
[0017] 色谱柱为迪马 Diamonsil II (4. 6 X 250mm，5 μ m)或岛津 WondaCract (?5-2(4.6Χ250πιπι，5μπι);以甲醇-0.6%冰醋酸水溶液=20 :80为流动相；检测波长为 326nm ;柱温为 25-30°C。
[0018] 若为了更好地实现各成分的分离，可以优选柱温为25°C。
[0019] 进一步地，步骤（1)中，提取方式为超声。
[0020] 更进一步地，超声功率200W，频率32kHz，30分钟。
[0021] 进一步地，步骤（1)中，粉末与甲醇的质量体积比为3:25g/ml。
[0022] 进一步地，青蒲颗粒的制备方法中，水煎的具体工艺为：加水煎煮二次，第一次加 18倍量水，第二次加15倍量水，每次煎煮1小时。
[0023] 进一步地，青蒲颗粒的制备方法中，水煎液浓缩至80°C测得相对密度为1. 30? 1. 35。
[0024] 进一步地，四味药材的用量配比如下：大青叶8重量份、蒲公英8重量份、紫花地丁 3重量份、甘草1重量份。
[0025] 本发明还提供了对青蒲颗粒中间体提取物中咖啡酸和秦皮乙素同时进行检测的 方法，它包括如下操作步骤：
[0026] (1)供试品溶液的制备：取青蒲颗粒中间体提取物，除去水份，精密称定，以甲醇 提取制备供试品溶液；
[0027] (2)对照品溶液的制备：取秦皮乙素对照品、咖啡酸对照品，以甲醇为溶剂制备对 照品溶液；
[0028] (3)分别取供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪中，以外标法计算青蒲 颗粒中咖啡酸和秦皮乙素含量即可，其中，色谱条件如下：
[0029] 色谱柱为迪马 Diamonsil II (4. 6 X 250mm，5 μ m)或岛津 WondaCract (?5-2(4.6Χ250πιπι，5μπι);以甲醇-0.6%冰醋酸水溶液=20 :80为流动相；检测波长为 326nm ;柱温为 25°C ;
[0030] 其中，青蒲颗粒中间体提取物由如下方法制备得到：
[0031] 取大青叶6?10重量份、蒲公英6?10重量份、紫花地丁 2?4重量份、甘草1? 2重量份；以上四味药材，加水煎煮，合并水煎液，即得青蒲颗粒中间体提取物。
[0032] 进一步地，青蒲颗粒中间体提取物制备过程中，水煎的具体工艺为：加水煎煮二 次，第一次加18倍量水，第二次加15倍量水，每次煎煮1小时。
[0033] 进一步地，四味药材的用量配比如下：大青叶8重量份、蒲公英8重量份、紫花地丁 3重量份、甘草1重量份。
[0034] 本发明通过多次试验研究，对同时测定两种成分的HPLC色谱条件进行了筛选和 探索，得到了一种能同时检测青蒲颗粒或其提取物中两种成分的含量测定方法。虽然本发 明提供的色谱条件，不采用复杂的梯度洗脱程序，但是，通过特定检测波长、柱温、色谱柱型 号等参数，能够将两种成分色谱峰顺利分离，杂质峰无干扰，且保留时间适宜，峰形良好，能 够达到顺利测定两种成分含量的目的，为制剂的质量研究奠定了基础，也可为其他同时含 有秦皮乙素和咖啡酸两种成分制剂的定量研究提供借鉴方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0035] 图1 :流动相为乙腈-0. 6 %冰醋酸水溶液（8:92);色谱柱为 Agilent-ODS (4. 6 X 150mm，5 μ m)，柱温 35?，波长 353nm
[0036] 图2 :流动相为甲醇-0. 6 %冰醋酸水溶液（20:80);色谱柱为 Agilent-ODS (4. 6 X 150mm，5 μ m)，柱温 35?，波长 353nm
[0037] 图3:流动相为乙腈-0.6%冰醋酸水溶液（8:92) ;色谱柱为岛津1〇11(1&(^1(^ 0DS-2 (4· 6 X 250mm，5 μ m)，柱温 35 °C，波长 353nm
[0038] 图4 :流动相为甲醇-0.6%冰醋酸水溶液（20:80);色谱柱为岛津WondaCract 0DS-2 (4. 6 X 250mm，5 μ m)，柱温 35 °C，波长 353nm
[0039] 图5 :流动相为甲醇-0.6%冰醋酸水溶液（20:80);色谱柱为岛津WondaCract 0DS-2 (4. 6 X 250mm，5 μ m)，柱温 35 °C，波长 326nm
[0040] 图6岛津WondaCract 0DS-2柱，甲醇-0· 6%冰醋酸水溶液（20:80)，柱温30°C
[0041] 图7岛津1〇11(1&(^1(^005-2柱，甲醇-0.6%冰醋酸水溶液（20 :80)，柱温251：
[0042] 图8对照品图谱
【具体实施方式】
[0043] 实施例1本发明青蒲颗粒的检测方法
[0044] 本发明所述青蒲颗粒的制备方法如下：
[0045] 处方：大青叶8份蒲公英8份紫花地丁 3份甘草1份
[0046] 工艺：以上四味药材，加水煎煮二次，第一次加18倍量水，第二次加15倍量水，每 次煎煮1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1. 30?1. 35 (80°C )，加蔗糖粉和淀 粉适量，混匀，制成颗粒，干燥，即得。
[0047] 检测方法如下：
[0048] 色谱条件与系统适用性实验岛津WondaCract 0DS-2 (4· 6X 250_，5 μ m);以甲 醇-0. 6 %冰醋酸水溶液（20 :80)为流动相；检测波长为326nm ;柱温为25°C。理论板数按 秦皮乙素峰计算应不低于3000。
[0049] 对照品溶液的制备取秦皮乙素对照品、咖啡酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成 每lml含秦皮乙素80 μ g、咖啡酸16 μ g的混合溶液，即得。
[0050] 供试品溶液的制备取青蒲颗粒研细后的粉末约3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精 密加甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理（功率200W，频率32kHz) 30分钟，放冷，再称定重 量，用甲醇补足减失的重量，摇勻，滤过，取续滤液，即得。
[0051] 测定法分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各10μ 1，注入液相色谱仪，测 定，即得。
[0052] 本品每lg含紫花地丁以秦皮乙素（C9H604)计，不得少0. 45mg，含蒲公英以咖啡酸 (C9H804)计，不得少 0.08mg。
[0053] 实施例2本发明青蒲颗粒的检测方法
[0054] 本发明所述青蒲颗粒的制备方法如下：
[0055] 处方：大青叶10份蒲公英10份紫花地丁 2份甘草1. 5份
[0056] 工艺：以上四味药材，加水煎煮二次，第一次加18倍量水，第二次加15倍量水，每 次煎煮1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1. 30?1. 35 (80°C )，加蔗糖粉和淀 粉适量，混匀，制成颗粒，干燥，即得。
[0057] 检测方法如下：
[0058] 色谱条件与系统适用性实验岛津WondaCract 0DS-2 (4· 6X 250_，5 μ m);以甲 醇-0. 6%冰醋酸水溶液（20 :80)为流动相；检测波长为326nm ;柱温为25°C。理论板数按 秦皮乙素峰计算应不低于3000。
[0059] 对照品溶液的制备取秦皮乙素对照品、咖啡酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成 每lml含秦皮乙素80 μ g、咖啡酸16 μ g的混合溶液，即得。
[0060] 供试品溶液的制备取青蒲颗粒研细后的粉末约3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精 密加甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理（功率200W，频率32kHz) 30分钟，放冷，再称定重 量，用甲醇补足减失的重量，摇勻，滤过，取续滤液，即得。
[0061] 测定法分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各1〇μ 1，注入液相色谱仪，测 定，即得。
[0062] 本品每lg含紫花地丁以秦皮乙素（C9H604)计，不得少0. 45mg，含蒲公英以咖啡酸 (C9H804)计，不得少 0.08mg。
[0063] 实施例3本发明青蒲颗粒的检测方法
[0064] 本发明所述青蒲颗粒的制备方法如下：
[0065] 处方：大青叶6份蒲公英6份紫花地丁 4份甘草2份
[0066] 工艺：以上四味药材，加水煎煮二次，第一次加18倍量水，第二次加15倍量水，每 次煎煮1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1. 30?1. 35 (80°C )，加蔗糖粉和淀 粉适量，混匀，制成颗粒，干燥，即得。
[0067] 检测方法如下：
[0068] 色谱条件与系统适用性实验岛津WondaCract 0DS-2 (4· 6X 250_，5 μ m);以甲 醇-0. 6%冰醋酸水溶液（20 :80)为流动相；检测波长为326nm ;柱温为25°C。理论板数按 秦皮乙素峰计算应不低于3000。
[0069] 对照品溶液的制备取秦皮乙素对照品、咖啡酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成 每lml含秦皮乙素80 μ g、咖啡酸16 μ g的混合溶液，即得。
[0070] 供试品溶液的制备取青蒲颗粒研细后的粉末约3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精 密加甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理（功率200W，频率32kHz) 30分钟，放冷，再称定重 量，用甲醇补足减失的重量，摇勻，滤过，取续滤液，即得。
[0071] 测定法分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各10μ 1，注入液相色谱仪，测 定，即得。
[0072] 本品每lg含紫花地丁以秦皮乙素（C9H604)计，不得少0. 45mg，含蒲公英以咖啡酸 (C9H804)计，不得少 0.08mg。
[0073] 实施例4本发明青蒲颗粒中间体提取物的检测方法
[0074] 本发明所述青蒲颗粒中间体提取物的制备方法如下：
[0075] 处方：大青叶8份蒲公英8份紫花地丁 3份甘草1份
[0076] 工艺：以上四味药材，加水煎煮二次，第一次加18倍量水，第二次加15倍量水，每 次煎煮1小时，合并煎液，即得青蒲颗粒中间体提取物。
[0077] 检测方法如下：
[0078] 色谱条件与系统适用性实验岛津WondaCract 0DS-2 (4· 6X 250_，5 μ m);以甲 醇-0. 6%冰醋酸水溶液（20 :80)为流动相；检测波长为326nm ;柱温为25°C。理论板数按 秦皮乙素峰计算应不低于3000。
[0079] 对照品溶液的制备取秦皮乙素对照品、咖啡酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成 每lml含秦皮乙素80 μ g、咖啡酸16 μ g的混合溶液，即得。
[0080] 供试品溶液的制备取青蒲颗粒中间体提取物，浓缩，干燥，取干燥品研细后的粉 末，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理（功率200W，频 率32kHz) 30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0081] 测定法分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各1〇μ 1，注入液相色谱仪，测 定，即得。
[0082] 实施例5本发明检测方法的考察
[0083] 1仪器、试药和对照品
[0084] 安捷伦1260infinity高效液相色谱仪（OpenLAB CDS色谱数据工作站）；KQ5200DE 超声波清洗器；CPA22?型电子分析天平（十万分之一）；
[0085] 青蒲颗粒、甲醇为色谱纯（fisher公司），水为注射用水，其它试剂均为分析纯（成 都化学试剂厂）。使用前所有试剂均经过0. 45 μ m微孔滤膜滤过。
[0086] 秦皮乙素对照品（由中国食品药品检定研究院提供，批号：110741-200506)，咖啡 酸对照品（由中国食品药品检定研究院提供，批号：110885-200102)，使用前在60°C下减压 干燥4小时。
[0087] 2色谱条件
[0088] 2. 1色谱柱和流动相的选择
[0089] 采用甲醇-0. 6%冰醋酸水溶液（20:80)、乙腈-0. 6%冰醋酸水溶液（8:92)作为流 动相，对 Agilent-ODS (4. 6 X 150mm，5 μ m)、岛津 WondaCract 0DS-2 (4· 6 X 250mm，5 μ m)两 种色谱柱的样品成分分离情况进行了对比试验。结果见图1?图4。
[0090] 图1 :流动相为乙腈-0. 6 %冰醋酸水溶液（8:92);色谱柱为 Agilent-ODS (4. 6 X 150mm，5 μ m)，柱温 35?，波长 353nm。
[0091] 图2 :流动相为甲醇-0. 6 %冰醋酸水溶液（20:80);色谱柱为 Agilent-ODS (4. 6 X 150mm，5 μ m)，柱温 35?，波长 353nm。
[0092] 图3:流动相为乙腈-0.6%冰醋酸水溶液（8:92) ;色谱柱为岛津1〇11(1&(^1(^ 0DS-2 (4· 6 X 250mm，5 μ m)，柱温 35°C，波长 353nm。
[0093] 图4 :流动相为甲醇-0.6%冰醋酸水溶液（20:80);色谱柱为岛津WondaCract 0DS-2 (4. 6 X 250mm，5 μ m)，柱温 35°C，波长 353nm。
[0094] 结果表明，米用Agilent_0DS(4. 6X 150mm，5 μ m)短色谱柱进行试验时，由于 色谱柱长度限制，秦皮乙素与咖啡酸两种成分根本无法分开；而采用岛津WondaCract 0DS-2 (4. 6 X 250mm，5 μ m)长色谱柱进行试验，秦皮乙素与咖啡酸两种成分基本可分开，但 分离效果差，存在杂质干扰，尚需进行进一步的试验研究。
[0095] 同时，相比之下，甲醇-0. 6%冰醋酸水溶液（20 :80)作为流动相分离效果相对较 好，故最终选择甲醇-0.6%冰醋酸水溶液（20:80)作为流动相。
[0096] 2. 2测定波长的选择
[0097] 取秦皮乙素对照品，加甲醇制成每1ml约含0. 038mg的溶液，以甲醇作为空白，在 200?500nm波长扫描，在353nm处有最大吸收；另取咖啡酸对照品，加甲醇制成每lml约 含0· 015mg的溶液，以甲醇作为空白，在200?500nm波长扫描，在326nm处有最大吸收；同 时，对不同波长下（353nm和326nm)，样品的分离和峰面积进行了对比试验，结果见图4、图 5 〇
[0098] 图5 :流动相为甲醇-0.6%冰醋酸水溶液（20:80);色谱柱为岛津WondaCract 0DS-2 (4. 6 X 250mm，5 μ m)，柱温 35°C，波长 326nm。
[0099] 综合考虑，由于制剂中咖啡酸含量极低，样品浓度低，353nm波长条件下峰面积很 小，且秦皮乙素吸收峰后有严重拖尾。为了兼顾使两种成分的均具有较好的吸收峰，最终选 择测定波长为326nm。但秦皮乙素和咖啡酸的分离度依然较差，尚需对其他条件进一步研 究。
[0100] 2. 3柱温条件的选择
[0101] 采用甲醇-〇· 6 %冰醋酸水溶液（20 :80)为流动相，岛津WondaCract 0DS-2(4. 6X250mm，5ym)色谱柱，分别于柱温25°C、30°C下进行预试验，结果如图6、图7。
[0102] 结果表明，当柱温条件为25°C、30°C时两色谱峰可达到基线分离，且与其它杂质成 分分离较好，综合考虑，为保证分离效果和分析速度，最终选择柱温条件为25°C。
[0103] 2.4 小结：
[0104] 经研究确定色谱条件如下：色谱柱为岛津WondaCract 0DS-2 (4· 6X 250mm，5 μ m); 检测波长为326nm ;流动相为甲醇-0. 6%冰醋酸水溶液（20 :80);流速为1. Oml/min ;柱温 为 25°C。
[0105] 3对照品溶液的制备
[0106] 取秦皮乙素对照品、咖啡酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lml含秦皮乙素 80 μ g、咖啡酸16 μ g的混合溶液，即得。对照品图谱见图8。
[0107] 4供试品溶液制备方法研究
[0108] 根据待测成分秦皮乙素和咖啡酸易溶于甲醇的性质，选用甲醇作为溶剂进行提 取；本颗粒剂为药材提取浓缩后制粒，因此，可采用超声处理的方法进行研究。具体研究如 下。
[0109] 4. 1提取时间考察
[0110] 对超声处理时间进行了研究，具体方法如下：取本品适量，研细后，取粉末三份，每 份约3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇25ml，密塞，称定重量，分别超声处理（功 率200W，频率32kHz) 10分钟、20分钟、30分钟、40分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失 的重量，摇匀，滤过，取续滤液，分别作为供试品溶液。以上述色谱条件，分别精密吸取对照 品溶液及供试品溶液10 μ 1，注入液相色谱仪，记录峰面积值，以每lg成品计算秦皮乙素和 咖啡酸含量。结果表明，两种成分含量随超声提取时间增加而增加，当超声处理20分钟时 已接近提取完全，故选择样品粉末的超声提取时间为20分钟。
[0111] 4.2 小结：
[0112] 根据以上研究，确定供试品溶液的制备方法为：取本品研细后的粉末约3g，精 密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理（功率200W，频率 32kHz) 20分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0113] 5阴性干扰试验
[0114] 分别取按样品制备工艺制备的缺蒲公英阴性样品，缺紫花地丁阴性样品，缺蒲公 英和紫花地丁双阴性样品，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，以上述色谱条件，分别 进样。结果表明，在秦皮乙素和咖啡酸色谱图相应位置，各阴性样品均无干扰峰出现，证明 本样品含量测定方法专属性较强。
[0115] 6线性范围的考察
[0116] 精密称取咖啡酸对照品20mg，置250ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，充分 溶解；另取秦皮乙素对照品20mg，置50ml容量瓶中，加上述咖啡酸对照品溶解并稀释至刻 度；分别取该混合对照品溶液1. 25ml、2. 5ml、5ml、10ml、20. 0ml于25ml容量瓶中，甲醇定容 至刻度。得含秦皮乙素浓度分别为 〇· 〇2mg/ml、0. 04mg/ml、0. 08mg/ml、0. 16mg/ml、0. 32mg/ ml，含咖啡酸浓度分别为 0· 004mg/ml、0. 008mg/ml、0. 016mg/ml、0. 032mg/ml、0. 064mg/ml 的混合对照品溶液。分别吸取各浓度混合对照品溶液1〇μ 1，进样，记录峰面积值。
[0117] 以秦皮乙素峰面积值（Α)对对照品浓度（C)进行回归，得秦皮乙素标准曲线方 程为：y = 29829. 884χ-10. 140, R2 = 0.9999。由方程可知，秦皮乙素进样浓度在0.02mg/ ml-0. 32mg/ml之间，秦皮乙素进样浓度和峰面积线性关系良好。
[0118] 以咖啡酸峰面积值㈧对对照品浓度（C)进行回归，得咖啡酸标准曲线方程 为：y = 53817. 627X-10. 482, R2 = 0. 9999。由方程可知，咖啡酸进样浓度在0. 004mg/ ml-〇. 064mg/ml之间，进样浓度和峰面积线性关系良好。
[0119] 7精密度试验
[0120] 精密吸取混合对照品溶液（秦皮乙素浓度：0· 080mg/ml、咖啡酸浓度：0· 016mg/ ml) 10 μ 1，按上述色谱条件，重复进样6次，记录色谱图和峰面积值。结果表明，两种成分峰 面积RSD〈1. 5%，说明仪器精密度良好。
[0121] 8稳定性试验
[0122] 取本品研细后的粉末约3g，照供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，另按照 对照品溶液制备方法制备混合对照品溶液。分别取混合对照品溶液（秦皮乙素浓度： 0· 081mg/ml、咖啡酸浓度：0· 016mg/ml)与供试品溶液，于制备后0h、2h、4h、6h、8h、10h分别 进样，按上述色谱条件进行测定，每次进样量10 μ 1，记录色谱图和峰面积值。
[0123] 结果表明，所测两种成分对照品溶液及供试品溶液在10小时内稳定性良好。
[0124] 9重现性试验
[0125] 取本品研细后的粉末6份，每份约3g，分别按供试品溶液的制备方法制备供试品 溶液，另按照对照品溶液制备方法制备混合对照品溶液。取混合对照品溶液和供试品溶液， 按上述色谱条件进行测定，每次进样量1〇μ 1，记录色谱图和峰面积值，计算样品中两种成 分含量。
[0126] 结果表明，青蒲颗粒中秦皮乙素的平均含量为0. 615mg/g，RSD〈l. 5%，咖啡酸的平 均含量为〇. 134mg/g，RSD〈1. 5%，所考察方法的重现性良好。
[0127] 10加样回收试验
[0128] 取已知含量研细后的样品粉末约1.5g，共6份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别 加入秦皮乙素对照品溶液（0. 178mg/ml)和咖啡酸对照品溶液（0.0344mg/ml)各5ml，精密 加甲醇15ml，密塞，称定重量，超声处理（功率200W，频率32kHz) 20分钟，放冷，再称定重 量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；另按照对照品溶液制 备方法制备混合对照品溶液；取混合对照品溶液和供试品溶液，按上述色谱条件进行测定， 分别进样10 μ 1，记录峰面积值和色谱图，计算加样回收率。
[0129] 表1加样回收率试验
[0130]
【权利要求】
1. 对青蒲颗粒中咖啡酸和秦皮乙素同时进行检测的方法，其特征在于：它包括如下操 作步骤： (1) 供试品溶液的制备：取青蒲颗粒研细后的粉末，精密称定，以甲醇提取制备供试品 溶液； (2) 对照品溶液的制备：取秦皮乙素对照品、咖啡酸对照品，以甲醇为溶剂制备对照品 溶液； (3) 分别取供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪中，以外标法计算青蒲颗粒 中咖啡酸和秦皮乙素含量即可，其中，色谱条件如下： 色谱柱为迪马 Diamonsil II (4. 6 X 250mm，5 μ m)或岛津 WondaCract (?5-2(4.6Χ250πιπι，5μπι);以甲醇-0.6%冰醋酸水溶液=20 :80为流动相；检测波长为 326nm ;柱温为 25-30°C ; 其中，青蒲颗粒由如下方法制备得到：取大青叶6?10重量份、蒲公英6?10重量份、 紫花地丁 2?4重量份、甘草1?2重量份；以上四味药材，加水煎煮，合并水煎液，浓缩，力口 蔗糖粉和淀粉适量，混匀，制成颗粒。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1)中，提取方式为超声。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：超声功率200W，频率32kHz，30分钟。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤⑴中，粉末与甲醇的质量体积比为 3:25g/ml。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：青蒲颗粒的制备方法中，水煎的具体工艺 为：加水煎煮二次，第一次加18倍量水，第二次加15倍量水，每次煎煮1小时。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：青蒲颗粒的制备方法中，水煎液浓缩至 80°C测得相对密度为1. 30?1. 35。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：四味药材的用量配比如下：大青叶8重量 份、蒲公英8重量份、紫花地丁 3重量份、甘草1重量份。
8. 对青蒲颗粒中间体提取物中咖啡酸和秦皮乙素同时进行检测的方法，其特征在于： 它包括如下操作步骤： (1) 供试品溶液的制备：取青蒲颗粒中间体提取物，除去水份，精密称定，以甲醇提取 制备供试品溶液； (2) 对照品溶液的制备：取秦皮乙素对照品、咖啡酸对照品，以甲醇为溶剂制备对照品 溶液； (3) 分别取供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪中，以外标法计算青蒲颗粒 中咖啡酸和秦皮乙素含量即可，其中，色谱条件如下： 色谱柱为迪马 Diamonsil II (4. 6 X 250mm，5 μ m)或岛津 WondaCract (?5-2(4.6Χ250πιπι，5μπι);以甲醇-0.6%冰醋酸水溶液=20 :80为流动相；检测波长为 326nm ;柱温为 25°C ; 其中，青蒲颗粒中间体提取物由如下方法制备得到： 取大青叶6?10重量份、蒲公英6?10重量份、紫花地丁 2?4重量份、甘草1?2 重量份；以上四味药材，加水煎煮，合并水煎液，即得青蒲颗粒中间体提取物。
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于：青蒲颗粒中间体提取物制备过程中，水煎 的具体工艺为：加水煎煮二次，第一次加18倍量水，第二次加15倍量水，每次煎煮1小时。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：四味药材的用量配比如下：大青叶8重 量份、蒲公英8重量份、紫花地丁 3重量份、甘草1重量份。
【文档编号】G01N30/02GK104155383SQ201410427483
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月27日 优先权日:2014年8月27日
【发明者】吴学渊, 房春林 申请人:成都乾坤动物药业有限公司