一种广升麻总甾酮及广升麻总甾酮胶囊指纹图谱检测技术及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及到一种中药提取物广升麻总甾酮及广升麻总甾酮胶囊的指纹图谱检测技术及其指纹图谱的构建方法。包括用溶剂提取制备广升麻总甾酮及广升麻总甾酮胶囊样品的供试液，在一定的色谱条件下测试供试液液相色谱指纹图谱，利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(V2.0)，计算广升麻总甾酮及广升麻总甾酮胶囊供试液指纹图谱的相似度，依据指纹图谱相似度应大于0.90，从而达到控制广升麻总甾酮及广升麻总甾酮胶囊质量的目的。实验证明，本发明的指纹图谱检测技术对广升麻总甾酮及广升麻总甾酮胶囊能起到很好的质量控制作用，是一种评价中药提取物及中药制剂生产质量的关键技术。
【专利说明】一种广升麻总留酮及广升麻总留酮胶囊指纹图谱检测技术 及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种中药材提取物和胶囊的指纹图谱检测技术及其指纹图谱的构建 方法。
【背景技术】
[0002] 广升麻又称广东升麻，是广东省做升麻入药的地方习用品种，而且在广东历年有 出口外销。始载于《广东中药》，谓："发痘疹，解毒";以根条粗长，表面黑褐色，断面蓝紫色， 质坚实，不带芦头，无须根者为佳。《广东中药》记载：广升麻"断面近栓皮处之皮部绿色者 优，但不多见"。本品为菊科植物麻花头SerratulachinensisS.Moor的干燥块根。夏、秋 季采挖，去净浮芦头及须根，烘干或晒干。本品呈长纺锤形，稍扭曲，两端稍尖、中部稍粗，长 10-20cm，直径0. 5-lcm，表面灰黄色、棕褐色或黑褐色，有粗纵皱纹和少数须根痕。质坚硬 而脆，易折段。断面暗灰色或灰黄色，略呈角质状。气特殊；味淡，微苦涩。功能与主治是升 阳、散风、解毒、透疹。用于风热头痛，咽喉肿痛，斑疹不透，中气下陷，久泻脱肛，子宫下坠。 广升麻已收载于中华人民共和国卫生部药品标准中药材第一册第7页及广东省中药材标 准（2011年）37页。
[0003] 广升麻总留酮是从广升麻中提取的总留酮类有效部位，按干燥品计算，含蜕皮甾 酮（(： 27114407)应不低于50.0%。；含总甾酮按蜕皮甾酮（(： 27114407)计，应为65.0-95.0%。广 升麻总甾酮胶囊是广升麻总甾酮提取物制成的胶囊。规格有l〇mg和5mg两个规格。用途： 活血祛瘀，通脉活络，用于中风中经络症，用于脑卒中恢复期治疗。
[0004] 中药成分复杂，以某一成分作为控制指标已经不适合中药质量控制的要求。中药 指纹图谱鉴别是借用了法医学的指纹鉴定的概念，其应用解决了中药中成分复杂、有效成 分不明的检测和证明产品批间质量的稳定性的问题，为中药质量的控制提供了一种较好的 方法。为了加强中药注射剂的质量管理，确保中药注射剂的质量管理，确保中药注射剂的质 量稳定、可控、中药注射剂在固定中药材品种、产地和采收期的前提下，需制定中药材、有效 部位或中间体、注射剂的指纹图谱。2000年8月国家药品监督管理局颁布《中药注射剂指 纹图谱研究的技术要求》（暂行）。国家药典委员会也于2002年4月制定了《中药注射剂 色谱指纹图谱实验研究技术指南（试行）》。
[0005] 目前对于广升麻的化学成分文献报道主要成分为蜕皮留酮类化合物，主要有 20-羟基蜕皮松（1)，podecdysoneC(2)，3-氧-乙酰基-20-羟基蜕皮松（3)，20-羟基蜕皮 松-20,22_缩丁醒（4)，8111(1&8七61'〇116(5)，&1：1'〇1：〇8七61'〇116〇(6)和〇&1'1：11&1]1〇8七61'〇116(7)。 关于广升麻质量标准的研究的报道主要是对于其蜕皮留酮成分的含量的测定及限度的规 定。目前尚无广升麻、广升麻总留酮及广升麻总留酮胶囊的指纹图谱研究的报道。
[0006] 广升麻总留酮胶囊活血祛瘀，通脉活络，用于中风中经络症，用于脑卒中恢复期治 疗。动物药理和临床试验证实，本产品能有效促进脑部急慢性缺血后的神经恢复，抗血小板 聚集，降低梗塞率。因此为便于广升麻总留酮胶囊的质量管理，确保其质量稳定、可控，应该 利用现代的分析技术更进一步的规范其质量。
[0007] 因此，基于对广升麻总留酮及其它制剂的质量的稳定、可控，结合高效液相色谱指 纹图谱技术及有关对指纹图谱研究的技术要求和指南，探索了包括广升麻总留酮、广升麻 总甾酮胶囊的指纹图谱检测技术，包括将样品用溶剂提取制备样品的供试液，在一定的色 谱条件下测试供试液的高效液相色谱指纹图谱，利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》 (V2. 0)(国家药典委员会），计算广升麻总留酮及广升麻总留酮胶囊指纹图谱的相似度。进 而获得指纹图谱相似度数值，从而达到控制广升麻总留酮及广升麻总留酮胶囊质量的目 的。实验证明，本发明的指纹图谱检测技术对广升麻、广升麻总留酮及广升麻总留酮胶囊能 起到很好的质量控制作用，是一种评价中药制剂生产质量的关键技术。
【发明内容】
[0008] 广升麻总留酮及广升麻总留酮胶囊是广升麻药材中提取的总留酮类有效部位，按 干燥品计算，含蜕皮甾酮（C27H4407)应不低于50.0%。；含总甾酮按蜕皮甾酮（C27H4407)计， 应为65. 0-95. 0%。通过对蜕皮甾酮的全波长扫描研究在243nm处有最大吸收。
[0009] 本发明的指纹图谱检测技术，包括将样品用溶剂提取制备样品的供试品溶液，在 一定的色谱条件下测试供试品试液的指纹图谱，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经计算机 辅助相似度评价软件《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（V2. 0)，（国家药典委员会），计 算指纹图谱相似度，获得指纹图谱相似度数值。依据相似度数值，将指纹图谱检测技术用于 广升麻总留酮及广升麻总留酮胶囊的质量控制。
[0010] 供试液的制备方法：取广升麻总留酮样品适量，精密称定用45%甲醇适量，超声 处理（功率300W，频率50kHz)至全部溶解，放冷摇匀后并稀释成每lmL含600yg的溶液滤 过，用微孔滤膜（0.45ym)过滤，取续滤液，即得广升麻总留酮供试液。取广升麻总留酮胶 囊20粒，精密称定，研细。精密称取约120mg置25ml量瓶中，加45%甲醇适量，超声处理 (功率300W，频率50kHz) 10分钟，用微孔滤膜（0. 45ym)过滤，取续滤液，即得广升麻总甾 酮胶囊供试液。
[0011] 所使用的一定的色谱条件包括如下因素：色谱柱；流动相；线性梯度洗脱程序；柱 温：35°C;流速：1.Oml/min，紫外检测器；检测波长为243nm;进样量：20iil;运行60min。
[0012] 对照指纹图谱的获取方法为13批广升麻总甾酮、10批广升麻总甾酮胶囊、按上述 供试液的制备方法制备供试品溶液，按上述色谱条件获得高效液相色谱指纹图谱，用指纹 图谱相似度软件分别对13批广升麻总留酮、10批广升麻总留酮胶囊指纹图谱进行分析得 广升麻对照图谱、广升麻总甾酮对照图谱、广升麻总甾酮胶囊对照图谱。
[0013] 色谱柱选用的是十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱，选用的是AgilentZORBAX SB-AQ柱。流动相，乙腈（A)-0. 04mol/L磷酸二氢钠溶液（用磷酸调pH为3. 0) (5 :95)体 系。线性梯度洗脱程序。
[0014] 经过研究，采用了如下的供试品溶液的制备方法：广升麻总留酮供试液：取广升 麻总留酮提取物样品适量，精密称定用45 %甲醇适量，超声处理（功率300W，频率50kHz) 至全部溶解，放冷摇匀后并稀释成每lmL含600yg的溶液滤过，用微孔滤膜（0. 45ym)过 滤，取续滤液，即得。广升麻总留酮胶囊供试液：取本品胶囊20粒，精密称定，研细。精密称 取约120mg置25ml量瓶中，加45 %甲醇适量，超声处理（功率300W，频率50kHz) 10分钟， 用微孔滤膜（0.45ym)过滤，取续滤液，即得。
[0015] 经过研究，采用了如下的色谱条件：色谱柱：AgilentZORBAXSB-AQ柱 (4. 6mmX250mm，5iim);流动相：乙腈（A)-0. 04mol/L磷酸二氢钠溶液（用磷酸调pH为3. 0) (5 :95)体系，线性梯度洗脱程序：0?5minl0%?15%乙腈；5?20minl5%?19%乙腈； 20 ?30minl9 % 乙臆；30 ?40minl9 % ?35 % 乙臆；40 ?50min35 % ?80 % 乙臆；50 ? 60min80%乙腈。柱温35°C;流速1.Oml/min;紫外检测器检测；检测波长为243nm;进样量： 20iU;运行60min。13批广升麻总留酮、10批广升麻总留酮胶囊样品的指纹图谱，用相似 度软件进行分析，以该平均指纹图谱为对照指纹图谱。在此条件下获取广升麻总留酮、广升 麻总甾酮胶囊的对照指纹图谱见图1-2
[0016]通过研究表明，广升麻总留酮对照图谱具有9个特征峰，图谱总长度为60min，广 升麻总甾酮胶囊对照图谱具有9个特征峰，图谱总长度为60min;广升麻总甾酮峰3、广升麻 总甾酮胶囊峰3均为蜕皮留酮峰。
[0017] 应用本发明，我们按合格产品的指纹图谱相似度大于0. 90为检验质控标准，将广 升麻总留酮、广升麻总留酮胶囊的生产检验质量控制，所得产品质量稳定可靠，真正实现了 产品质量的稳定可控。
[0018] 广升麻总留酮、广升麻总留酮胶囊的指纹图谱分析方法的建立及质量稳定性评价 的具体情况如下：
[0019] 1.1仪器与试剂
[0020] 仪器：AgilentllOO高效液相色谱仪，AgilentllOO紫外检测器，工作站：Chem stationforLC，TU-1810紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）
[0021] 试剂：乙腈为色谱纯（productofTedia，USA)，其它试剂均为分析纯，水为睡哈哈 引用纯净水。
[0022] 广升麻总甾酮（江苏柯菲平医药有限公司，批号：090101、090201、090202、0901、 0902、111101、111102、111201、111202、S13-130101-M、S13-130102-M、S13-130201-M、 S13-130202-M)
[0023] 广升麻总甾酮胶囊（江苏柯菲平医药有限公司，批号：090301、090302、090303、 09001、10001、111201、S13-130301、S13-130302、S13-130303、S13-130304)
[0024] 1. 2色谱条件优化
[0025] 1. 2. 1流动相梯度的选择
[0026] 选用了AglientZORBAXSB-AQ柱；流速：1. 0ml/min;因蜕皮甾酮的最大吸收波长 在243nm，故本实验检测波长暂定在243nm;柱温暂定35°C;进样量：20yl;考查了多种梯度 洗脱条件，实验过程中共选择了 4种流动相系统：
[0027] (1)甲醇：水梯度洗脱
[0028] 表1广升麻指纹图谱流动相梯度
【权利要求】
1. 一种广升麻总留酮及广升麻总留酮胶囊指纹图谱的构建方法，包括如下步骤： A. 广升麻总留酮供试液：取广升麻总留酮提取物样品适量，用45 %的甲醇溶液，超声 处理至全部溶解，放冷摇匀后稀释成含蜕皮留酮的溶液滤过，用微孔滤膜过滤，取续滤液， 即得；广升麻总甾酮胶囊供试液：取广升麻总甾酮胶囊内容物适量，精密称取约120mg置 25ml量瓶中，加甲醇溶液适量，超声处理，用微孔滤膜过滤，取续滤液，即得； B. 液相色谱法测定供试液指纹图谱：将A步骤制备的供试液在一定色谱条件下进样即 得；一定的色谱条件为：C18色谱柱；流动相：乙腈（A)-0. 04mol/L磷酸二氢钠溶液（用磷酸 调pH为3. 0) (5 :95)体系；线性梯度洗脱程序；柱温35°C ;流速1. Oml/min ;紫外检测器检 测；检测波长为243nm ;进样量：20 ill ;运行60min。
2. 权利要求1所述的广升麻总留酮及广升麻总留酮胶囊指纹图谱的构建方法，所述的 C180DS 色谱柱，Agilent ZORBAX SB-AQ 柱尤其适用。
3. 权利要求1所述的一种广升麻总留酮及广升麻总留酮胶囊指纹图谱的构建方法， 所述的对照指纹图谱的获得方法为：取广升麻总留酮提取物样品适量，精密称定用45%甲 醇适量，超声处理至全部溶解，放冷摇匀后并稀释成每lmL含600 y g的溶液，过滤，取续滤 液即得；取广升麻总留酮胶囊，各取本品胶囊20粒，精密称定，研细。精密称取约120mg置 25ml量瓶中，加45 %甲醇适量，超声10分钟使溶解，用微孔滤膜过滤，取续滤液，即得；按如 下色谱条件分析：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-AQ柱（4.6mmX250mm，5iim)，流动相：乙腈 (A)-0. 04mol/L磷酸二氢钠溶液（用磷酸调pH为3. 0) (5 :95)体系；柱温35°C;流速1. 0ml/ min ;紫外检测器检测；检测波长为243nm ;进样量：20ia ;线性梯度，运行60min ;获取广升 麻总留酮、广升麻总留酮胶囊样品的指纹图谱，用相似度软件进行分析，以该平均指纹图谱 为对照指纹图谱。
4. 权利要求3所述的一种广升麻总留酮及广升麻总留酮胶囊指纹图谱的构建方法， 所述的一定的色谱条件下线性梯度洗脱程序，具体条件如下：乙腈（A)-0.04mol/L磷酸二 氢钠溶液（用磷酸调口!1为3.0)(5:95)体系；线性梯度洗脱程序：0?51^1110%?15%乙 臆；5 ?SOminIS1% ?19% 乙臆；20 ?乙臆；30 ?^zOminig1% ?35% 乙臆；40 ? 501^11351%?80% 乙臆；50 ?60min80% 乙臆。
5. 权利要求4所述的一种广升麻、广升麻总留酮及广升麻总留酮胶囊指纹图谱的构 建方法，所得的广升麻总留酮对照图谱具有9个特征峰，以蜕皮留酮对照品峰（即3号 峰），一其峰保留时间为1，计算共有指纹峰的相对保留时间，图谱总长度为60min，广升 麻总甾酮胶囊对照图谱具有9个特征峰，10mg规格胶囊的相对保留时间/min(特征峰序 号）0.70±10% (1)、0.71±10% (2)、1.00±10% (3[S])、1.13±10% (4)、1.31±10% (5)、1.44±10% (6)、1.76±10% (7)、1.90±10% (8)、2.06±10% (9) ;5mg 规格胶囊的 相对保留时间/min(特征峰序号）0.70±10% (1)、0.71±10% (2)、1.00±10% (3[S])、 1.13±10 % (4)、1.31±10 % (5)、1.44±10 % (6)、1.76±10 % (7)、1.90±10 % (8)、 2. 06±10% (9)。
【文档编号】G01N30/02GK104458928SQ201310436233
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年9月24日 优先权日:2013年9月24日
【发明者】秦引林, 夏振江 申请人:江苏柯菲平医药股份有限公司