独一味的hplc检测方法及指纹图谱检测技术的制作方法
【专利摘要】本发明提供了独一味的HPLC检测方法。本发明还提供了独一味的HPLC指纹图谱检测技术。本发明检测方法中，出峰数量较多，分离度良好，基线平稳，指认了8种成分，专属性好，能够对独一味进行有效检测，为保障药材质量提供给了新的选择。
【专利说明】独一味的HPLC检测方法及指纹图谱检测技术
【技术领域】
[0001] 本发明涉及独一味的HPLC检测方法及指纹图谱检测技术。
【背景技术】
[0002] 独一味Lamiophlomis rotata化en化?）Kudo系大宗常用藏药，功能活血止血，法风 止痛，临床广泛用治外科手术后的刀口疼痛、出血、风湿癖痛等症，疗效确切，镇痛作用尤其 显著W，具有广阔的应用前景。
[0003] 独一味药材来源全部依靠野生资源，由于其需求量剧增，资源紧缺，被列为一级瀬 危藏药。为了保护日益减少的独一味野生资源，2010年版中国药典将其入药部位由全草修 订为地上部分?。然而，现有关于独一味药材质量控制的报道主要集中在根及根茎W或全 草W，较少涉及地上部分W。现代研究表明，独一味的活性成分主要有3大类;环帰離 聰巧类化合物，具有很好的止血、促凝血作用，是止血活性成分；苯己醇巧类化合物，具有抗 炎、抗氧化活性；黄丽类化合物，具有镇痛止血、抗炎、抗肿瘤活性。现有报道多为采用HPLC 法测定其中1?2类成分尚无同时检测3类W上成分的相关报道。
【发明内容】
[0004] 为了进一步完善独一味的质量控制标准，本发明拟采用HPLC法对独一味地上部 分样品进行分析评价，并希望指认涵盖环帰離聰巧、苯己醇巧、黄丽、咖啡醜4类成分的化 合物，能更加全面反映该独一味药材的成分特征，可为该药材的质量控制提供科学依据。
[0005] 本发明提供了独一味的HPLC检测方法，它包括如下操作步骤：
[000引 （1)取待检药材，W甲醇或含水甲醇提取，制备供试品溶液；
[0007] 似将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，检测即可，色谱条件如下：
[0008] 色谱柱：十八焼基键合娃胶为填料
[0009] 检测波长；235nm + 5nm
[0010] 流动相；A ;己膳，B ;0. 1?0. 5%磯酸水溶液，梯度洗脱程序为；0?10min，5%? 8% A ;10 ?27min，8%?12% A ;27 ?35min，12%?12% A ;35 ?70min，12%?17% A ; 70?80min，17%?19%A;80?110min，19%?36%A;110?120min，36%?50%A。
[0011] 进一步地，步骤（1)中，所述含水甲醇中甲醇浓度为50?90%，优选为65?75%， 更优选为70%。
[0012] 更进一步地，步骤（1)中，提取的方法选自回流、超声、浸溃或渗漉。
[0013] 进一步地，步骤（2)中，磯酸水溶液浓度为0. 1%?0.3%，优选为0. 1%。
[0014] 进一步地，所述色谱柱的尺寸为4. 6mmX 250mm，5 y m。
[0015] 更进一步地，色谱柱柱温为30 +2°C。
[0016] 进一步地，所述检测方法中，选用胡麻属巧、山檐巧甲醋、绿原酸、马钱巧、8-0-己 醜山檐巧甲醋、连翅醋巧B、木犀草巧、麦角留巧中的一种或两种W上的组合物为对照品。
[0017] 本发明还提供了独一味的HPLC指纹图谱检测方法，它包括如下操作步骤：
[001引（I)取待检药材，W甲醇或含水甲醇提取，制备供试品溶液；
[001引 似将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，检测即得供试品指纹图谱，色谱条件如 下：
[0020] 色谱柱：十八焼基键合娃胶为填料
[00引]检测波长；235nm±5nm
[002引流动相；A ;己膳，B ;0. 1?0. 5%磯酸水溶液，梯度洗脱程序为；0?10min，5%? 8% A ;10 ?27min，8%?12% A ;27 ?35min，12%?12% A ;35 ?70min，12%?17% A ; 70?80min，17%?19%A;80?110min，19%?36%A;110?120min，36%?50%A;
[0023] (3)将供试品指纹图谱与对照指纹图谱比较，各共有峰保留时间相似度在0. 9 W 上的药材即为独一味；其中，对照指纹图谱中，共有峰14个，W山檐巧甲醋为参照峰，各 共有峰相对保留时间如下；〇. 65、0. 68、0. 77、1、1. 20、1. 26、1. 50、1. 58、2. 44、3. 16、3. 28、 3. 39、3. 72、4. 13。
[0024] 本发明中需要指出，由于独一味中所含的黄丽类成分和苯己醇巧类具有相似的色 谱保留行为，将该两大类成分完全分离具有较大难度，梯度条件变化时，该两类成分的多个 色谱峰相对保留时间变化较大，甚至出现色谱峰位置的互换，因此在同一色谱条件下实现 独一味中的黄丽类成分和苯己醇巧类成分全部达到基线分离是难点。目前公开的独一味色 谱条件，尚无法实现同时对该两类成分的完全分离，更没有同时将环帰離聰巧、苯己醇巧、 黄丽及咖啡醜4类成分有效分离检测的方法。
[0025] 本发明检测方法中，出峰数量较多，分离度良好，基线平稳，能够对独一味进行有 效检测，为保障药材质量提供给了新的选择。本发明首次在同一色谱条件下检测出了上述 环帰離聰巧、苯己醇巧、黄丽及咖啡醜4类成分，共指认了 8个具体化合物，可更全面更准确 地用于独一味药材的质量控制。
[0026] W下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于W下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【专利附图】
【附图说明】
[0027] 图1样品及对照品色谱图（A、B独一味样品HPLC指纹图谱，C.对照品色谱图），其 中，3.胡麻属巧、4.山檐巧甲醋、5.绿原酸、8.马钱巧9. 8-0-己醜山檐巧甲醋、10.连翅醋 巧B、ll.木犀草巧、12.麦角留巧
[0028] 图2主成分投影图
[0029] 图3不同部位指纹图谱比较（A.果序B.地下部分C.地上部分与13号样品来源 相同）
[0030] 图4不同生长期独一味指纹图谱比较（A.成株B.幼苗与11号样品来源相同）
[003。 图5不同胆存时间样品指纹图谱比较（A.胆存1年样-23号样品B.新采样-5号 样品）
[0032] 图6对比条件1的色谱图
[003引图7对比条件2的色谱图，其中，1.山檐巧甲醋；2.绿原酸；3. 8-0-己醜山檐巧甲 醋；4.连翅醋巧B点芦下；6.麦角留巧；7.木犀草巧
[0034] 图8迪马钻石Cis柱色谱图 [00；3引 图 9Hypersil 0DS2Ci8 柱色谱图
【具体实施方式】
[0036] 实施例1本发明检测方法
[0037] (1)供试品溶液的制备
[0038] 取独一味（中粉）约0. 6g，精密称定，精密加入70%甲醇30血，称定重量，回流提 取90min，放冷，再称定重量，用溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0039] (2)对照品溶液的制备
[0040] 取胡麻属巧、山檐巧甲醋、绿原酸、马钱巧、8-0-己醜山檐巧甲醋、连翅醋巧B、木 犀草巧、麦角留巧对照品适量，精密称定，加75%甲醇配制成含胡麻属巧0.0576111肖/111^山 檐巧甲醋0. 〇695mg/mL、绿原酸0. 0502mg/mL、马钱巧0. 0408mg/mL、8-0-己醜山檐巧甲醋 0. 0524mg/mL、连翅醋巧 BO. 0790mg/mL、木犀草巧 0. 0486mg/mL、麦角留巧 0. 0861mg/mL 的混 合对照品溶液。
[0041] (3)将对照品和供试品溶液分别注入液相色谱仪中，采用外标法计算出独一味药 材中各对照品成分的含量即可，色谱条件如下：
[0042] 色谱柱：色谱柱为Welc虹om Cis柱（4. 6mmX 250mm，5 U m);流动相为A ;己膳-B : 0. 1%磯酸水溶液，梯度洗脱（0?l〇min，5%?8% A ;10?27min，8%?12% A ;27? 35min, 12% ?12%A;35 ?70min, 12% ?17%A ;70 ?SOmin, 17% ?19%A;80 ?IlOmin, 19%?36%A;110?120min，36%?50%A);检测波长；235nm;柱温；3(rC;进样量： 10 y L。
[0043] 实施例2本发明检测方法考察
[0044] 1仪器与材料
[0045] 1. 1仪器化imate3000高效液相色谱仪（包括四元梯度粟，在线脱气机，自动进样 器，柱温箱，VWD3400紫外检测器，Oiromeleon色谱工作站，德国戴安），Sartorius BS224S 电子分析天平（德国赛多利斯），M比LIQ超纯水机（美国Millipore)
[0046] 1. 2材料独一味自采或购买（见表1)
[0047] 表1独一味样品来源
[0048]
【权利要求】
1. 独一味的HPLC检测方法，其特征在于：它包括如下操作步骤： (1) 取待检药材，以甲醇或含水甲醇提取，制备供试品溶液； (2) 将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，检测即可，色谱条件如下： 色谱柱：十八烷基键合硅胶为填料 检测波长：235nm±5nm 流动相4:乙腈，8:0.1?0.5%磷酸水溶液，梯度洗脱程序为：0?1011^11，5%?8% A ;10 ?27min，8%?12% A ;27 ?35min，12%?12% A ;35 ?70min，12%?17% A ;70 ? 80min, 17%?19% A ;80 ?llOmin, 19%?36% A ;110 ?120min,36%?50% A。
2. 根据权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于：步骤（1)中，所述含水甲醇中 甲醇浓度为65?75% v/v，优选为70% v/v。
3. 根据权利要求1或2所述的HPLC检测方法，其特征在于：步骤（1)中，提取的方法 选自回流、超声、浸渍或渗漉。
4. 根据权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于：步骤（2)中，磷酸水溶液浓度 为0. 1%?0. 3%，优选为0. 1%。
5. 根据权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于：所述色谱柱的尺寸为 4.6mmX 250mm,5 μ m〇
6. 根据权利要求1或5所述的HPLC检测方法，其特征在于：色谱柱柱温为30 ±2°C。
7. 根据权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于：所述检测方法中，选用胡麻属 苷、山桅苷甲酯、绿原酸、马钱苷、8-0-乙酰山桅苷甲酯、连翘酯苷B、木犀草苷、麦角留苷中 的一种或两种以上的组合物为对照品。
8. 独一味的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于：它包括如下操作步骤： (1) 取待检药材，以甲醇或含水甲醇提取，制备供试品溶液； (2) 将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，检测即得供试品指纹图谱，色谱条件如下： 色谱柱：十八烷基键合硅胶为填料 检测波长：235nm±5nm 流动相4:乙腈，8:0.1?0.5%磷酸水溶液，梯度洗脱程序为：0?101^11，5%?8% A ;10 ?27min，8%?12% A ;27 ?35min，12%?12% A ;35 ?70min，12%?17% A ;70 ? 80min, 17%?19% A ;80 ?llOmin, 19%?36% A ;110 ?120min,36%?50% A ; (3) 将供试品指纹图谱与对照指纹图谱比较，各共有峰保留时间相似度在0.9以上 的药材即为独一味；其中，对照指纹图谱中，共有峰14个，以山桅苷甲酯为参照峰，各共有 峰相对保留时间如下：〇· 65、0· 68、0· 77、1、1· 20、1· 26、1· 50、1· 58、2· 44、3· 16、3· 28、3· 39、 3. 72、4. 13。
【文档编号】G01N30/88GK104237440SQ201410528050
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年10月9日 优先权日:2014年10月9日
【发明者】古锐, 钟世红 申请人:成都中医药大学