专利名称：一种用于鼻咽癌检测的血清蛋白质指纹图谱方法
技术领域：
本发明涉及医学检测技术领域，为一种新的非侵入性的检测方法，在体外对鼻咽癌进行早期检测和愈后监控，其敏感性和特异性均达到80％以上。
背景技术：
鼻咽癌的发病率与死亡率在我国有上升的趋势，以珠江三角洲及西江流域一带最为高发。鼻咽癌的病因尚未了解，可能相关因素有EB病毒感染、化学致癌因素、遗传因素等。目前鼻咽的临床检测方法主要有镜检、CT/MRI检查、B超检查、EB病毒抗体检查和肿瘤活组织病理检查，其中活组织病理检查是唯一的定性手段，EB病毒抗体检查可作为筛查、早期检测的辅助手段。若能提高鼻咽的早期检测准确率，对鼻咽癌高发人群进行定期筛查，对愈后进行有效监控，即可明显提高鼻咽癌的总体治疗效果。
蛋白质组技术是继基因组技术之后在国际上迅速兴起的生物技术，其主要应用领域之一是疾病检测，蛋白质指纹图谱技术是目前国际上最先进的蛋白质组技术之一，是继DNA指纹图谱技术后最有实用价值的指纹图谱技术。癌症在发生显著的病理变化之前，组织细胞释放到血液中的蛋白质在组成和数量上都已经有特异的变化。蛋白质指纹图谱技术就是利用生物质谱技术检测癌症血清中蛋白质的成分和数量，通过分析发现鼻咽癌发生时的变化，形成特征性的指纹图谱，如果被检测血清的蛋白质指纹图谱具备相同的特征，即有极大的可能已经发生鼻咽癌。蛋白质指纹图谱技术中使用的蛋白质芯片和表面增强激光解析电离飞行时间质谱仪是生物质谱仪经过二十余年的发展完善的最新成果，它具备高灵敏度、高精度和高通量的特点，可以直接分析血清等天然的蛋白样本。传统的蛋白质组学经典技术——二维电泳，虽然可以分析血清蛋白质的成份，但每次只能分析一个血清样品，电泳胶价格高，血清需经过复杂的处理，分析耗时长，且难以分析分子量在20000道尔顿以下的蛋白质，由于电泳结果受样品处理和操作条件的影响大，重复性难以做到理想，难以建立有效的大型数据库，无法从实验室走入临床应用。另一个传统的蛋白质组学技术——基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱技术，无法直接分析天然蛋白质样品，需与蛋白质原位酶切技术、高效液相色谱或毛细管电泳等技术连用，限制了它的应用。
发明内容
本发明的目的是提出一种用于鼻咽癌检测的的血清蛋白质指纹图谱方法，该方法取少量血清制备蛋白质芯片，利用生物质谱技术检测制备的血清蛋白质芯片生成样本血清的蛋白质指纹图谱，将大量鼻咽癌血清样本的蛋白质指纹图谱构成的数据库，用生物统计学方法将临床患者的血清蛋白质指纹图谱与数据库数据进行比较分析，得出患者发生鼻咽癌的可能性概率，从而直观、准确地判别病例血清的情况。
本发明提出的用于鼻咽癌检测的血清蛋白质指纹图谱方法，包括以下步骤(1)取鼻咽癌患者血清样本，对照血清样本，制备蛋白质芯片，利用生物飞行时间质谱技术测定蛋白质芯片获得血清蛋白质指纹图谱，建立鼻咽癌血清蛋白质指纹图谱数据库。
(2)取待检患者少量血清，制备蛋白质芯片，利用生物飞行时间质谱技术测定蛋白质芯片获得血清蛋白质指纹图谱。
(3)将待测患者血清蛋白质指纹图谱与鼻咽癌血清蛋白质指纹图谱数据库中的数据进行比较和统计分析，得出患者发生鼻咽癌的可能性概率。上述方法中，鼻咽癌血清样本包括已确诊的治疗前未转移的鼻咽癌患者血清样本、治疗前已发生转移的鼻咽癌患者血清样本、在治疗中(化疗、放射治疗)的鼻咽癌患者血清样本、治疗后复发未发生转移的鼻咽癌患者血清样本、治疗后复发并发生转移的鼻咽癌患者血清样本，对照血清样本包括头颈部非癌症类疾病患者血清样本、头颈部非鼻咽癌癌症患者血清样本和健康人血清样本。鼻咽癌血清蛋白质指纹图谱数据库的规模，即数据库中的血清蛋白质指纹图谱的种类和数量，是可以增加和扩充的。
上述方法中制备蛋白质芯片的过程包括以下步骤(1)取血清3ul-10ul，用含9mol/l尿素、2％ CHAPS、1％ DTT缓冲液稀释3倍，混匀，冰浴30分钟，然后将稀释后的血清用50mmol/l醋酸钠缓冲液稀释13倍。
(2)用50mmol/l醋酸钠缓冲液，加至蛋白质芯片表面，芯片上每点加200ul，将蛋白质芯片置于振荡器上130转每分钟振荡5分钟，抛弃缓冲液，再次加50mmol/l醋酸钠缓冲液，芯片上每点加200ul，将蛋白质芯片置于振荡器上130转每分钟振荡5分钟，抛弃缓冲液。
(3)取稀释后的血清溶液加至蛋白质芯片表面，芯片上每点加100ul，将蛋白质芯片置于振荡器上130转每分钟振荡60分钟，抛弃血清溶液，用50mmol/l醋酸钠缓冲液洗涤2次，洗涤方法同上述制备蛋白质芯片过程(2)，芯片每点用200ul水洗涤一次，风干。
(4)蛋白质芯片表面每点滴加1ul饱和芥子酸溶液，风干。
本发明与其它非侵入性的鼻咽癌的检测方法比较，具有以下优点(1)本发明提供的用于鼻咽癌检测的血清蛋白质指纹图谱方法为早期用于鼻咽癌检测的提供了新的途径和方法，通过鼻咽癌血清蛋白质指纹图谱数据的建立、扩充与完善，准确性可以不断得到提高，适应临床病例的复杂情况。(2)与以往的非侵入性方法比较具有极高的敏感性与特异性，其敏感性与特异性均达到80％以上，是一种在蛋白质组学水平上的检测，为鼻咽癌的早期检测和愈后监测提供了新的方法和标准。(3)本发明的方法设计合理可行，方便快速，是为降低我国鼻咽癌的病死率、提高鼻咽癌的治愈率、对高危人群筛查鼻咽癌提供了一种新的方法。
本发明提供的用于鼻咽癌检测的血清蛋白质指纹图谱方法填补了鼻咽癌血清蛋白质标志物检查的空白领域，具备传统的单一血清蛋白质标志物检查所不具备的高特异性、高灵敏度、全面性和可扩充性。
图1是鼻咽癌血清蛋白质指纹图谱数据库中的部分血清蛋白质指纹图谱。
图2和图3是鼻咽癌血清蛋白质指纹图谱数据库中的部分图谱的局部放大，上面五个图谱是对照血清的蛋白质指纹图谱，下面五个图谱是鼻咽癌患者血清蛋白质指纹图谱，方框框出了可目视看到的鼻咽癌患者血清蛋白质指纹图谱与对照血清蛋白质指纹图谱的差异。
图4是利用Biomarker Patterns Software软件生成的鼻咽癌患者血清与对照血清的分类树示意图。
图5是实例1中使用的Biomarker Patterns Software软件生成的鼻咽癌患者血清与对照血清的分类树。
图6是实例2中使用的Biomarker Patterns Software软件生成的鼻咽癌患者血清与对照血清的分类树。
具体实施例方式
本发明提出一种用于鼻咽癌检测的血清蛋白质指纹图谱方法，首先取已经确诊的鼻咽癌血清样本包括治疗前未转移和已发生转移的血清样本60例、在治疗中(化疗、放射治疗)的血清样本20例、治疗后复发未发生转移的血清样本16例、治疗后复发并发生转移的血清样本20例，对照血清样本包括头颈部非癌症疾病患者血清样本20例、头颈部非鼻咽癌癌症患者血清样本20例和正常人血清样本60例。患者年龄20到75岁之间，男性占75％左右，符合鼻咽癌发生的男女比例，对照组人群来源地区、年龄范围和性别比例与鼻咽癌组基本匹配，所有疾病样本均具有病历资料。
将鼻咽癌和对照两组血清从负80冰箱中取出，溶解后置冰浴，取血清3ul-5ul，用含9mol/l尿素、2％CHAPS、1％DTT缓冲液稀释3倍，混匀后冰浴30分钟，再用50mmol/l醋酸钠缓冲液稀释13倍。取WCX2蛋白质芯片，用50mmol/l醋酸钠缓冲液，加至蛋白质芯片表面，芯片上每点加200ul，将蛋白质芯片置于振荡器上130转每分钟振荡5分钟，抛弃缓冲液，再次加50mmol/l醋酸钠缓冲液，芯片上每点加200ul，将蛋白质芯片置于振荡器上130转每分钟振荡5分钟，抛弃缓冲液。取稀释后的血清溶液加至蛋白质芯片表面，芯片上每点加100ul，将蛋白质芯片置于振荡器上130转每分钟振荡60分钟，抛弃血清溶液，用50mmol/l醋酸钠缓冲液洗涤2次，芯片每点用200ul水洗涤一次，风干。蛋白质芯片表面每点滴加1ul饱和芥子酸溶液，风干。检测中所使用的水和试剂均来源于SIGMA公司。
将制备完成的蛋白质芯片装入表面增强激光解吸电离飞行时间质谱仪芯片仓，设定测试条件，进行测试，测得蛋白质芯片捕捉到的各种血清蛋白质的分子量和相对强度，即可描绘出血清蛋白质指纹图谱，将此数据存入鼻咽癌血清蛋白质指纹图谱数据库，数据库中的部分血清蛋白质指纹图谱如图1、图2和图3所展示。
用Proteinchip Software将鼻咽癌血清蛋白质指纹图谱数据库中储存的蛋白质指纹图谱数据打开，对分子量和相对强度进行校正，使所有数据的标准保持一致，使用Biomarker Wizard软件筛选信噪比大于3的蛋白质信号，导出这些信号的分子量和强度信息，形成“CSV”格式电子表格文件。
用Biomarker Patterns Software软件导入“CSV”格式电子表格文件，对蛋白质信号的信息进行分类运算，生成鼻咽癌组血清与对照组血清的分类树，此树中的分类依据是若干个蛋白质信号的强度在两组血清中的差异，即不同组血清蛋白质指纹图谱的特征，图4是分类树的示意图。
取临床待检患者静脉血3ml，不加任何抗凝剂和促凝剂，室温下凝血后立即离心收集血清，取血清3ul-5ul，用含9mol/l尿素、2％CHAPS、1％DTT缓冲液稀释3倍，混匀后冰浴30分钟，再用50mmol/l醋酸钠缓冲液稀释13倍。取WCX2蛋白质芯片，用50mmol/l醋酸钠缓冲液，加至蛋白质芯片表面，芯片上每点加200ul，将蛋白质芯片置于振荡器上130转每分钟振荡5分钟，抛弃缓冲液，再次加50mmol/l醋酸钠缓冲液，芯片上每点加200ul，将蛋白质芯片置于振荡器上130转每分钟振荡5分钟，抛弃缓冲液。取稀释后的血清溶液加至蛋白质芯片表面，芯片上每点加100ul，将蛋白质芯片置于振荡器上130转每分钟振荡60分钟，抛弃血清溶液，用50mmol/l醋酸钠缓冲液洗涤2次，芯片每点用200ul水洗涤一次，风干。蛋白质芯片表面每点滴加1ul饱和芥子酸溶液，风干。检测中所使用的水和试剂均来源于SIGMA公司。剩余血清使用液氮或者负80摄氏度冰箱速冻后，储存于负20摄氏度至负80摄氏度冰箱内。使用表面增强激光解吸电离分析时间质谱仪测定蛋白质芯片获得血清蛋白质指纹图谱，用Proteinchip Software对分子量和相对强度进行校正，使数据标准与数据库的标准一致，使用Biomarker Wizard软件筛选信噪比大于3的蛋白质信号，导出这些信号的分子量和强度信息形成“CSV”格式电子表格文件，用Biomarker Patterns Software软件导入此电子表格文件，再导入由数据库生成的“CSV”电子表格文件，进行统计分析，给出被检测血清蛋白质指纹图谱特征符合分类树中的结点位置，判断其蛋白质指纹图谱特征所符合的血清组类型并计算出概率。
实施方式一样品收集待检测的患者慢性鼻咽炎，EB病毒抗体检查呈阳性，CT见右鼻咽侧壁改变。取静脉血3毫升，不加抗凝剂和促凝剂，室温存放1小时待血液完全凝固，每分钟3000转离心15分钟，取血清，血清每分钟5000转离心30秒沉淀少量悬浮的红细胞，取得血清约1ml，取出20ul待测，其余置负80摄氏度冰箱保存。
蛋白质芯片制备取患者血清3ul，加入6ul含9mol/l尿素、2％CHAPS、1％DTT缓冲液稀释，混匀，冰浴30分钟，然后加入108ul 50mmol/l醋酸钠缓冲液稀释。取弱阳离子交换芯片(WCX2)，在芯片A点上加入200ul 50mmol/l醋酸钠缓冲液，室温下将蛋白质芯片置于振荡器上130转每分钟振荡5分钟，弃掉醋酸钠缓冲液，重复此项操作一次。在A点滴加100ul血清稀释液，室温下将蛋白质芯片置于振荡器上130转每分钟振荡1小时，弃掉稀释液。用200ul50mmol/l醋酸纳洗涤芯片A点2次，每次将蛋白质芯片置于振荡器上130转每分钟振荡5分钟，然后用200ul HPLC级水洗涤芯片A点1次，芯片风干，A点表面加1ul饱和芥子酸溶液，风干。
蛋白质指纹图谱测定制备完成的蛋白质芯片装入PBSIIc型表面增强激光解吸电离飞行时间质谱仪芯片仓，质谱仪数据采集条件设置如下激光强度185，预热激光强度190，检测器灵敏度8，过滤器设1000道尔顿，优化分子质量范围2500道尔顿至30000道尔顿，聚焦7000道尔顿，最高分子量80000道尔顿，A点激光扫描范围20-80(全范围0-100)，每步进4，每步收集数据7次。采集数据后保存至检测血清蛋白质指纹图谱数据库。
蛋白质指纹图谱分析用Proteinchip Software软件打开已测的蛋白质指纹图谱，进行MassNormalize和Total Ion Current Normalize校正分子量和相对强度，使其数据标准与鼻咽癌血清蛋白质指纹图谱数据库一致。使用Biomarker Wizard软件筛选信号，信噪比设为3，分子量误差允许范围3％，筛选得到342个有效信号，导出为“CSV”格式电子表格文件。用BiomarkerPatterns Software导入此电子表格文件，与鼻咽癌血清蛋白质指纹图谱数据库生成的电子表格文件进行统计分析，发现此例血清蛋白质指纹图谱位于分类树(图5)终端结点1(TerminalNodel)，属于分类1(对照组)，血清蛋白质指纹图谱特征符合对照组特征，属非鼻咽癌概率大于93％，属鼻咽癌概率小于8％。
实施方式二样品收集待检测的患者鼻咽癌放疗后1年，发现左颈肿物2月，CT见右鼻咽侧壁改变，取静脉血3毫升，不加抗凝剂和促凝剂。室温存放1小时待血液完全凝固，每分钟3000转离心15分钟，取血清，每分钟4500转离心30秒沉淀少量悬浮的红细胞，取得血清约900ul，取出20ul待测，其余液氮速冻后置负20摄氏度冰箱保存。
蛋白质芯片制备取患者血清3ul，加入6ul含9mol/l尿素、2％ CHAPS、1％ DTT缓冲液稀释，混匀，冰浴30分钟，然后加入108ul 50mmol/l醋酸钠缓冲液稀释。取弱阳离子交换芯片(WCX2)，在芯片D点上加入200ul 50mmol/l醋酸钠缓冲液，室温下将蛋白质芯片置于振荡器上130转每分钟振荡5分钟，弃掉醋酸钠缓冲液，重复此项操作一次。在D点滴加100ul血清稀释液，室温下将蛋白质芯片置于振荡器上130转每分钟振荡1小时，弃掉稀释液。用200ul50mmol/l醋酸纳洗涤芯片D点2次，每次将蛋白质芯片置于振荡器上130转每分钟振荡5分钟，然后用200ul HPLC级水洗涤芯片D点1次，芯片风干，D点表面加1ul饱和芥子酸溶液，风干。
蛋白质指纹图谱测定制备完成的蛋白质芯片装入PBS IIc型表面增强激光解吸电离飞行时间质谱仪芯片仓，质谱仪数据采集条件设置如下激光强度185，预热激光强度190，检测器灵敏度8，过滤器设1000道尔顿，优化分子质量范围2500道尔顿至30000道尔顿，聚焦7000道尔顿，最高分子量80000道尔顿，A点激光扫描范围20-80(全范围0-100)，每步进4，每步收集数据7次。采集数据后保存至检测血清蛋白质指纹图谱数据库。
蛋白质指纹图谱分析用Proteinchip Software软件打开已测的的蛋白质指纹图谱，进行Mass Normalize和Total Ion Current Normalize校正分子量和相对强度，使其数据标准与鼻咽癌血清蛋白质指纹图谱数据库一致。使用Biomarker Wizard软件筛选信号，信噪比设为3，分子量误差允许范围3％，筛选得到355个有效信号，导出为“CSV”格式电子表格文件。用Biomarker Patterns Software导入电子表格文件，与鼻咽癌血清蛋白质指纹图谱数据库生成的电子表格文件进行统计分析，发现此例血清蛋白质指纹图谱位于分类树(图6)终端结点4(Terminal Node4)，属于分类0(鼻咽癌组)，血清蛋白质指纹图谱特征符合鼻咽癌特征，属鼻咽癌概率大于82％，属非鼻咽癌概率小于18％。
权利要求
1.一种用于鼻咽癌检测的血清蛋白质指纹图谱方法，其特征是(1)取鼻咽癌患者血清样本，对照血清样本，制备蛋白质芯片，利用生物飞行时间质谱技术测定蛋白质芯片获得血清蛋白质指纹图谱，建立鼻咽癌血清蛋白质指纹图谱数据库；(2)取待检患者少量血清，制备蛋白质芯片，利用生物飞行时间质谱技术测定蛋白质芯片获得血清蛋白质指纹图谱；(3)将待检患者血清蛋白质指纹图谱与鼻咽癌血清蛋白质指纹图谱数据库中的数据进行比较和统计分析，得出患者发生鼻咽癌的可能性概率。
2.如权利1要求所述的用于鼻咽癌检测的血清蛋白质指纹图谱方法，其特征是鼻咽癌血清样本包括已确诊的治疗前未转移的鼻咽癌患者血清样本、治疗前已发生转移的鼻咽癌患者血清样本、在治疗中(化疗、放射治疗)的鼻咽癌患者血清样本、治疗后复发未发生转移的鼻咽癌患者血清样本、治疗后复发并发生转移的鼻咽癌患者血清样本，对照血清样本包括头颈部非癌症类疾病患者血清样本、头颈部非鼻咽癌癌症患者血清样本和健康人血清样本。
3.如权利1要求所述的用于鼻咽癌检测的血清蛋白质指纹图谱方法，其特征是鼻咽癌血清蛋白质指纹图谱数据库的规模，即数据库中的血清蛋白质指纹图谱的种类和数量，是可以增加和扩充的。
4.如权利1要求所述的用于鼻咽癌检测的血清蛋白质指纹图谱方法，其特征是血清采集方法如下取患者静脉血液3ml，不加任何抗凝剂和促凝剂，室温下凝血后立即离心收集血清，制备蛋白质芯片，剩余血清使用液氮或者负80摄氏度冰箱速冻后，储存于负20摄氏度至负80摄氏度冰箱内。
5.如权利1要求所述的用于鼻咽癌检测的血清蛋白质指纹图谱方法，其特征是蛋白质芯片是美国Ciphergen公司生产的基于离子交换表面基团的弱阳离子交换型芯片WCX2Proteinchip。
6.如权利1要求所述的用于鼻咽癌检测的血清蛋白质指纹图谱方法，其特征是蛋白质芯片制备方法如下(1)取血清3ul-10ul，用含9mol/l尿素、2％CHAPS、1％DTT缓冲液稀释3倍，混匀，冰浴30分钟，然后将稀释后的血清用50mmol/l醋酸钠缓冲液稀释13倍；(2)用50mmol/l醋酸钠缓冲液，加至蛋白质芯片表面，芯片上每点加200ul，将蛋白质芯片置于振荡器上130转每分钟振荡5分钟，抛弃缓冲液，再次加50mmol/l醋酸钠缓冲液，芯片上每点加200ul，将蛋白质芯片置于振荡器上130转每分钟振荡5分钟，抛弃缓冲液；(3)取稀释后的血清溶液加至蛋白质芯片表面，芯片上每点加100ul，将蛋白质芯片置于振荡器上130转每分钟振荡60分钟，抛弃血清溶液，用50mmol/l醋酸钠缓冲液洗涤2次，洗涤方法同上述制备蛋白质芯片方法(2)，芯片每点用200ul水洗涤一次，风干(4)蛋白质芯片表面每点滴加1ul饱和芥子酸溶液，风干。
7.如权利1要求所述的用于鼻咽癌检测的血清蛋白质指纹图谱方法，其特征是血清蛋白质芯片的测定使用美国Ciphergen公司生产的表面增强激光解吸电离飞行时间质谱仪。
8.如权利1要求所述的用于鼻咽癌检测的血清蛋白质指纹图谱方法，其特征是血清蛋白质指纹图谱与鼻咽癌血清蛋白质指纹图谱数据库的比较和统计分析采用生物统计学软件Biomarker Patterns Software，基于神经网络方法。
9.如权利1要求所述的用于鼻咽癌检测的血清蛋白质指纹图谱方法，其特征是该方法可用于鼻咽癌的早期检测、高危人群筛查和鼻咽癌的愈后监控。
全文摘要
本发明一种用于鼻咽癌检测的血清蛋白质指纹图谱方法。现有的鼻咽癌检测方法敏感性与特异性较低。为此本发明取少量血清制备蛋白质芯片，利用生物质谱技术检测制备的血清蛋白质芯片生成血清的蛋白质指纹图谱，用大量鼻咽癌血清样本和对照血清样本的蛋白质指纹图谱构成鼻咽癌血清蛋白质指纹图谱数据库，采用生物统计学方法将待检患者的血清蛋白质指纹图谱与数据库中的图谱进行比较分析，帮助医务人员判断患者发生鼻咽癌的可能性。本发明是一种在蛋白质组学水平上的检测方法。具有取血方便、取血量少、无侵害的优点，且数据库具备良好的可扩充性，其敏感性与特异性均达到80％以上。适用于鼻咽癌的早期检测、愈后监测和高危人群的筛查中。
文档编号G01N30/00GK1841069SQ20051003388
公开日2006年10月4日 申请日期2005年4月1日 优先权日2005年4月1日
发明者叶志海, 夏鲁全 申请人:珠海百源生物信息科技有限公司