专利名称：基于盐溶蛋白图谱技术的豇豆品种分析鉴定方法
技术领域：
本发明涉及一种植物品种的鉴定方法，具体地说涉及一种基于盐溶蛋白图谱技术的豇豆品种分析鉴定方法。
背景技术：
豇豆[Vigna unguiculata(L.)Walp.]属一年生草本植物，起源于非洲热带地区，广泛分布于热带和亚热带。豇豆有普通豇豆(Vignaunguiculata ssp.unguiculata)、长荚豇豆(Vigna unguiculatassp.sesquipedalis)、短荚豇豆(Vigna unguiculata ssp.cylindrica)三个栽培亚种。正确地划分品种群，可以清楚地反应豇豆品种间的亲缘关系的远近，对植物遗传育种中亲本选择选配、资源保存与利用等极具意义。
关于豇豆品种的分类和鉴定以前主要依据质量性状划分法，也有用数量性状进行聚类分析，它们都属于形态标记，是以田间鉴定表现型为特征的，具有直观、技术简便等优点，但植物表现型受遗传和环境共同影响，导致鉴定准确性差，可资鉴定的性状多态性也不够，难以准确判断品种间的亲缘关系，而且耗时长，在育种中一方面可能盲目进行亲本选择选配，导致杂交后代优势不明显，分离后代中难以找到超亲的植株，很难育成符合目标性状的具优势的新品种，另一方面杂交后代选择的单株是否真正与亲本具有遗传差异，是否实现了基因重组等通过表观株选也难以判断，影响育种进程和效率；细胞学标记是以检查品种染色体数目和结构变异为特征的，其对种类和倍性检查有重要作用，但对品种划分和鉴定则显得信息量小，同样对某些关系较近的材料很难被准确区分，且操作很复杂。采用同工酶特征进行品种系统分类鉴定，需要分析多种酶的同工酶，耗时、费事、耗钱。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对目前豇豆品种分析鉴定方法的缺陷，提供一种基于盐溶蛋白图谱技术的豇豆品种新的分析鉴定方法，以弥补现有方法的不足。
盐溶蛋白可作为豇豆品种分类的有效遗传物质，它具有遗传稳定性和种质特异性，有遗传稳定性就能够反映品种的本质差异，就具有重演性，有种质特异性就能够区分种质，鉴定其本质差异，因此豇豆种子贮藏的盐溶蛋白质是种质资源亲缘关系分析和品种分类的有效遗传物质。本发明通过对豇豆萌发期过氧化氢酶、过氧化物酶、酯酶等同工酶分析以及种子贮藏的水溶蛋白、醇溶蛋白、碱溶蛋白、盐溶蛋白等贮藏蛋白进行凝胶电泳图谱分析。经过对多种技术和指标进行分析比较，在种子期豇豆种子贮藏的盐溶蛋白具有遗传稳定性和种质特异性，能够提供较多的品种的遗传信息，确立豇豆种子盐溶蛋白为豇豆品种分类的有效遗传物质。
本发明的技术方案是这样实现的它包括以下步骤(1)提取现有豇豆品种中的盐溶蛋白，分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，得到各豇豆品种的盐溶蛋白标样图谱；
(2)根据各豇豆品种盐溶蛋白质谱带亚基分布信息建立数据库，经聚类分析得到系统聚类树，根据系统聚类树特征可以将各豇豆品种划分成品种群及品种亚群；(3)将所需要鉴定的豇豆品种按上述步骤进行凝胶电泳分析，得到所需要鉴定豇豆品种的盐溶蛋白图谱，将此盐溶蛋白图谱与标样图谱进行比较判定，得到分析鉴定结果；其中所述蛋白质谱带信息数据库的建立采用“0-1”系统记录谱带，所述聚类分析采用不加权成对算术平均值方法，所述聚类树采用PHYLIP3.6软件包的Neighbor程序进行聚类分析，得到系统聚类树。
本发明提取盐溶蛋白时，提取液NaCl的浓度为10％，浓度过高会出现盐析现象，浓度过低会使其它蛋白质混溶其中，影响分析鉴定结果的准确性。豇豆种子与样品提取液NaCl的比例为1∶3(重量/体积)，该比例过高或过低都会造成图谱的显带不清楚；进行凝胶电泳分析时，聚丙烯酰胺分离胶的浓度为12.5％，浓度过大，则分子筛孔小，电泳时间长，且大分子亚基迁移不动，多态性减少，浓度过小，则分子筛孔大，小分子亚基则迁移过快，电泳时间太短，亚基谱带显示得也不够，且容易导致破胶；所述电泳方法采用25mA恒流。
所述系统聚类树特征为豇豆品种盐溶蛋白质谱带亚基分布信息，其反映了品种来源地域、生长习性、荚形、荚色、熟性等差异。
种子贮藏蛋白是植物基因的遗传表达物，具有遗传稳定性和种质特异性，因而既能够准确反映品种或单株的遗传背景，又可以区分识别不同的基因型，本发明以半粒或1粒种子为材料分析鉴定其贮藏蛋白图谱，确立豇豆品种和单株亲缘关系，进行品种分析。这种基于蛋白质分子的遗传标记技术与基于DNA分子标记的技术相比，尽管鉴定区分品种上信息量稍少，因为其鉴定的是基因组表达的功能蛋白而核酸标记鉴定的是整个基因组DNA序列差异，但其与性状表现更加密切，且具有鉴定成本偏低、速度更快和可以同时实现大量品种或单株鉴定等优点。
本发明提供一套豇豆品种种子盐溶蛋白分析技术优化策略，使多态性带占总带数的97.50％。多态性带中，品种平均显带17.94条，变异系数24.03％；位点平均显带32.67条，变异系数72.88％。
本发明利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术(SDS-PAGE)得到豇豆品种盐溶蛋白图谱，根据谱带亚基分布的相似程度，对豇豆品种进行比较鉴定和聚类分析。其采用的分析鉴定方法结果可靠，能广泛用于单株选择、突变体筛选和品种分类等领域。
本发明可以帮助确定豇豆核心种质资源，遗传背景一致的种质可只保留一份核心种质，减少田间种植量和种质资源库保存、繁种费用等。本发明方法准确可靠，大量品种可同时展开，速度快，成本低，分类鉴定结果与性状关联度大，明晰品种遗传关系，可以指导育种实践。
图1为本发明的长豇豆品种盐溶蛋白电泳图谱(示编号为01～12的品种)图2为本发明根据盐溶蛋白的多态性，采用UPGMA法绘制的长豇豆品种聚类树3为鄂豇豆二号及其亲本干种子盐溶蛋白亚基光密度分布曲线4为矮虎及其亲本干种子盐溶蛋白亚基光密度分布曲线5为菲律宾-7，黑仁白豆角和长青豇豆干种子盐溶蛋白亚基光密度分布扫描6为眉豆，泰国豇豆和902豆角干种子盐溶蛋白亚基光密度分布扫描7为压草豆，沟沟红和水红豇豆干种子盐溶蛋白亚基光密度分布扫描图具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步描述本发明包括以下步骤(1)提取现有豇豆品种中的盐溶蛋白，分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，得到各豇豆品种的盐溶蛋白标样图谱，如图1所示；(2)根据各豇豆品种盐溶蛋白质谱带亚基分布信息建立数据库，经聚类分析得到系统聚类树，根据系统聚类树特征可以将各豇豆品种划分成品种群及品种亚群，如图2所示；(3)将所需要鉴定的豇豆品种按上述步骤进行凝胶电泳分析，得到所需要鉴定豇豆品种的盐溶蛋白图谱，将此盐溶蛋白图谱与标样图谱进行比较判定，得到分析鉴定结果；其中所述蛋白质谱带信息数据库的建立采用“0-1”系统记录谱带，所述聚类分析采用不加权成对算术平均值方法，所述聚类树采用PHYLIP3.6软件包的Neighbor程序进行聚类分析，得到系统聚类树。本发明提取盐溶蛋白时，提取液NaCl的浓度为10％，豇豆种子与样品提取液NaCl的比例为1∶3(重量/体积)；进行凝胶电泳分析时，聚丙烯酰胺分离胶的浓度为12.5％，所述电泳方法采用25mA恒流。盐溶蛋白谱带是品种的重要遗传特征，它既能区分具有遗传差异的品种(品系、植株)，又能反映出各个品种(品系、植株)间亲缘关系的远近。本发明利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术(SDS-PAGE)得到豇豆品种盐溶蛋白图谱，根据谱带的相似程度，对71个豇豆品种进行比较鉴定和聚类分析。结果表明在供试品种的蛋白质谱带中，一共检出40条蛋白质谱带，其中有39条在不同品种间表现出多态性。多态性带占总带数的97.50％。多态性带中，品种平均显带17.94条，变异系数24.03％；位点平均显带32.67条，变异系数72.88％。根据其多态性差异和系统聚类树特征，我们可以将71个供试豇豆品种分为4个品种群，其中品种群A分为9个品种亚群，品种群B和C各分为3个品种亚群。
由图3鄂豇豆二号及其亲本干种子盐溶蛋白质各组分光密度分布曲线图可知，蛋白质亚基主要分布在15.5KD-134KD之间，其中鄂豇豆二号和其母本5号豇豆在46KD有最大光密度分布，而父本之豇19的光密度很小；58.4KD和35.4KD处鄂豇豆二号和5号豇豆都没有，之豇19光密度值分别为120和36；18.8KD处鄂豇豆二号没有，5号豇豆为10，之豇19为42；67.1KD处5号豇豆没有，鄂豇豆二号为18，之豇19为41；15.5KD处之豇19没有，鄂豇豆二号为31，5号豇豆为21；46KD之豇19的光密度值为15，鄂豇豆二号为232，5号豇豆为288。鄂豇豆二号和其父母本在52.1KD蛋白质多肽点都有很大的光密度分布；在其余各个蛋白质条带上鄂豇豆二号及其父母本光密度值分布大致在50以下区域，呈现出差异。鄂豇豆二号和5号豇豆同属浅色荚且较长，为主要的早熟高产主栽品种聚积区的A-9品种亚群，之豇19属A-6品种亚群。由图4矮虎及其亲本干种子盐溶蛋白质各组分光密度分布曲线图可知，蛋白质亚基主要分布在14.1KD-133.8KD之间，其中矮虎和其母本之豇14父本美国地豆在46KD有最大光密度分布，光密度值分别为134、227和262；在133.8KD处矮虎和美国地豆都没有，之豇14的光密度值为11；67.1KD处矮虎没有，美国地豆和之豇14的光密度值分别为12和10；58.4KD处矮虎和之豇14都没有，美国地豆的光密度值为23；35.4KD、18.8KD和14.1KD处矮虎的光密度值分别为16、9和16，其父母本都没有；26.7KD处美国地豆光密度值为17，矮虎和之豇14都没有。矮虎和美国地豆同属矮生且荚粗短的A-6品种亚群，之豇14属浅色荚且较长，为主要的早熟高产主栽品种聚积区的A-9品种亚群。
菲律宾-7，黑仁白豆角和长青豇豆同属性状差异较大的深绿荚品种群D，根据其蛋白质图谱和亚基光密度分布扫描图，由图5可知，蛋白质亚基主要分布在14.1KD-133.8KD之间，菲律宾-7在60.7KD、52.1KD、31.4KD等处有不同于其他品种的较高光密度值，黑仁白豆角在46KD、20.7KD处有不同于其他品种的较高光密度值，一个未知品种，如果与长青豇豆有相同的盐溶蛋白图谱就可以确定其为长青豇豆，再进行扫描，则会更进一步确认，如果未知品种的蛋白质图谱与长青豇豆的图谱差异大，则否定其为长青豇豆，如果与71个品种中的某一品种的相同，则可判别其为那一个具体品种，以此类推。实验室通过蛋白质图谱判断品种的准确率可达90％以上(与实际品种或品种田间表现相比较)，对蛋白质图谱差异大的品种的区分识别准确率可以达到100％。眉豆，泰国豇豆和902豆角同属牛角弯形荚且花浅色的B-3品种亚群，如图6所示，三个品种的蛋白质亚基构成基本一致，主要分布在14.1KD-133.8KD之间，来自英国的902豆角蛋白质亚基的光密度值高于其他两个相似品种，泰国豇豆和眉豆的蛋白质各亚基光密度差异相对较小。压草豆，沟沟红和水红豇豆同属荚形特异的品种群B，其中压草豆和水红豇豆同属牛角弯形荚且花浅色的B-3品种亚群，沟沟红属尾弯荚且具红腹缝线的B-2品种亚群。在60.7KD-46KD处有很高的光密度分布，如图7所示。
权利要求
1.一种基于盐溶蛋白图谱技术的豇豆品种分析鉴定方法，它包括以下步骤(1)提取现有豇豆品种中的盐溶蛋白，分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，得到各豇豆品种的盐溶蛋白标样图谱；(2)根据各豇豆品种盐溶蛋白质谱带亚基分布信息建立数据库，经聚类分析得到系统聚类树，根据系统聚类树特征可以将各豇豆品种划分成品种群及品种亚群；(3)将所需要鉴定的豇豆品种按上述步骤进行凝胶电泳分析，得到所需要鉴定豇豆品种的盐溶蛋白图谱，将此盐溶蛋白图谱与标样图谱进行比较判定，得到分析鉴定结果；其中所述蛋白质谱带信息数据库的建立采用“0-1”系统记录谱带，所述聚类分析采用不加权成对算术平均值方法。
2.根据权利要求1的一种基于盐溶蛋白图谱技术的豇豆品种分析鉴定方法，其中提取盐溶蛋白时，提取液NaCl的浓度为10％。
3.根据权利要求1的一种基于盐溶蛋白图谱技术的豇豆品种分析鉴定方法，其中提取盐溶蛋白时，豇豆种子与样品提取液的比例为13(重量/体积)。
4.根据权利要求1的一种基于盐溶蛋白图谱技术的豇豆品种分析鉴定方法，其中进行凝胶电泳分析时，聚丙烯酰胺分离胶的浓度为12.5％，所述电泳方法采用25mA恒流。
全文摘要
本发明涉及一种植物品种的鉴定方法，具体地说涉及一种基于盐溶蛋白图谱技术的豇豆品种分析鉴定方法。它包括提取现有豇豆品种中的盐溶蛋白，分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，得到各豇豆品种的盐溶蛋白标样图谱；将所需要鉴定的豇豆品种按上述步骤进行凝胶电泳分析，得到所需要鉴定豇豆品种的盐溶蛋白图谱，将此盐溶蛋白图谱与标样图谱进行比较判定，得到分析鉴定结果。本发明分析鉴定方法结果可靠，能够减少田间种植量和种质资源库保存、繁种等费用，能广泛用于单株选择、突变体筛选和品种分类等领域。本发明分类鉴定结果与性状关联度大，明晰品种遗传关系，可以指导育种实践。
文档编号G01N30/00GK1670527SQ20051001859
公开日2005年9月21日 申请日期2005年4月22日 优先权日2005年4月22日
发明者陈禅友, 胡志辉, 赵新春 申请人:江汉大学