专利名称：一种中药定量指纹图谱的建立方法
技术领域：
G06K数据识别；数据表示；记录载体；记录载体的处理背景技术 中药成分复杂，许多成分不够明确，而不同中药又有含有相同成分的现象。因此，运用现代分析技术对中药化学信息以图形(图象)的方式进行表征并加以描述，即运用中药指纹图谱技术对中药进行质量控制是目前较公认的方法。高效液相仪色谱仪以其分离度好、灵敏度高、重现性强的特点成为研究中药指纹图谱的最主要的手段。美国Food and Drag Administration(FDA)允许草药保健品申报资料可以提供色谱指纹图，World Health Organization(WHO)在1996年草药评价指导原则中规定，在植物药的制剂及成品的章节中均提到，如果草药的活性成分不明，可以提供色谱图谱以证明产品的质量一致。2000年8月15日，我国药品监督管理局发布《中药注射剂指纹图谱研究技术要求》(暂行)。
目前，高效液相仪在中药质量控制方面的应用，仅限于有效成分的含量测定和指纹图谱的定性鉴别，尚未有一套完备的方法能在样品选择、提取检测方法恰当而做出峰形较好、分离度较高的高效液相仪图谱后，对能代表总体的多个样品图谱数据处理，统计总体的共有指纹特征，对每个共有指纹特征峰参数如保留时间、峰面积、峰高、峰宽(实际导出的为半峰宽)、起始时间、终止时间、分离度、相对保留时间等进行统计，计算其均值、标准差、相对标准差，统计出总体的数字共同指纹特征，作为可定性定量的指纹图谱标准数据库，以之为参照，以相对保留时间作为定性指标，以峰面积或峰高作为定量指标进行其他样品的识别和质量评定。同时能依据高效液相仪导出的数据模拟样品图谱，包括偏态峰形和分离度过小的峰形，对成分明确的物质进行含量测定的数据处理。
发明内容
1建立中药定量指纹图谱的方法步骤包括(1)数据导出，(2)数据的导入，(3)数据类型的改变，(4)参照峰的选取、识别与其保留时间的读出，(5)分离度和相对保留时间的添加，(6)样本表指纹特征峰的读出，(7)单个物质峰表的汇成，(8)共有指纹特征峰标准数据库表的汇成，(9)指纹图谱曲线图的模拟，(10)指纹图谱中明确成分的含量测定，(11)识别和评价其他被检测样品。
2消除相对保留时间波动的参照峰处理方法选取两个标志性强的峰，作为参照峰，保留时间为s1、s2(s1＜s2)，其它峰的保留时间为tn，相对保留时间为rt，由于高效液相仪存在死体积，则存在死时间α，即tn＝tn+αs1＝s1+αs2＝s2+α故rt=(tn+α)-(s1+α)(s1+α)-(s2+α)]]>=tn-s1s2-s1]]>可以消除不同仪器的死体积不同而引起的误差。
3利用高效液相仪导出的数据模拟分离度小的峰和偏态峰的方法高效液相仪物质峰曲线可抽象为正态分布曲线其公式如下y＝f(t)f(t)=h·e-(t-tr)22·u2]]>
h=au·2×3.1415925]]>其中y为曲线纵坐标值，代表吸光度，h为峰高，a为峰面积，u为曲线标准差，t为横坐标值，代表时间，tr为保留时间，3.1415925为圆周率。
半峰宽w＝2.355·u峰宽w＝4·uw＝1.699·w当t＝tr时，e的指数为零，此时y最大，用ymax表示ymax=h=au·2×3.1415925]]>a＝1.065·h·w定理1对等高的两正态分布曲线，如果两曲线的标准差u和起始积分时间与终止积分时间差1(或半峰宽或峰宽)之比相等，那么积分面积b与全积分面积a之比相等。
如果u1l1=u2l2]]>那么b1a1=b2a2]]>推论1对等高的两正态分布曲线，如果积分面积b与全积分面积a之比相等，那么两曲线标准差(或半峰宽或峰宽)的比值、两曲线的起始积分时间与终止积分时间差的比值、两曲线积分面积的比值及两曲线全积分面积的比值相等。
当h1＝h2如果u1l1=u2l2,b1a1=b2a2]]>又因为a＝1.065·h·w即a1a2=w11/2w21/2=u1u2]]>那么u1u2=l1l2=b1b2=a1a2]]>(1)对偏态峰的模拟可将偏态峰分割为两个等高的，不等标准差的正态分布曲线，模拟曲线时分别取两曲线的前半部分和后半部分即可。
高效液相仪导出数据包含每个峰的保留时间tr、峰高h、峰面积a、半峰宽w1/2、起始时间s、终止时间e等。
由推论1知tr-se-tr=w11/2w21/2]]>因w1+w2＝w
u=w1/22.335]]>则u1=tr-se-su]]>u2=e-tre-su]]>则y1=h·e(t-tr)22u12(s<t<tr)]]>y2=h·e(t-tr)22u22(tr<t<e)]]>以上模拟曲线图形的峰高、峰宽与原图等同，而峰面积近似。
由推论1知tr-se-tr=a1a2]]>因a1+a2＝au=ah·2×3.1415925]]>则u1=tr-se-su]]>u2=e-tre-su]]>则y1=h·e(t-tr)22u12(s<t<tr)]]>y2=h·e(t-tr)22u22(tr<t<e)]]>以上模拟曲线图形的峰高、峰面积与原图等同，而峰宽近似。
(2)对分离度小的两峰曲线模拟如果两物质峰不能分开，则相互掩避，且吸光度相加而反映在光谱曲线上。因此，高效液相仪没有给定准确的前峰终止时间和后峰起始时间，当另行处理，以给定峰面积代替真实峰面积，模拟为正态峰。
w1/2=a1.065h]]>u=w1/22.335]]>则y=h·e-(t-tr)22u2(s<t<e)]]>由于不能模拟重叠部分的吸光度的相加，该模拟曲线重叠区的吸光度均低于原图。
具体实施例方式
(1)数据导出Agilent高效液相仪工作站，在offline窗口打开数据包，经点击Integration图标，点击Integration Events设定积分基线(slope sensitivity)和峰高Height Reject、峰面积Area Reject、峰宽Peak Width的选择后再击File，左点Export选择CSV File，出现一个窗口，在该窗口下记下导出数据储存位置，点击OK，再次出现窗口，再次点击OK。从My cumputer(我的电脑)中找到导出数据包，用copy(复制)到一个新建文件夹，重命名，重复以上步骤，导出其它样本数据。
(2)数据的导入先建成立同名表，字段为峰号、保留时间、类型、峰面积、峰高、峰宽、起始时间、终止时间。由导出的CVS类型的同名文件导入该表(3)数据类型的改变，即将表文件记录除类型之外由字符型改变为数字型(4)参照峰的选择、识别与其保留时间的读出选择两个标志性强的峰为参照峰，用峰高(或峰面积)或保留时间，或两者结合作为识别特征。
(5)分离度和相对保留时间的添加分离度r=2(tn-tn-1)wn-wn-1,]]>tn、tn-1为两峰的保留时间，wn、wn-1为两峰的峰宽。
相对保留时间rt=tn-sls2-s1(-∞<rt<+∞)]]>s1、s2(s1＜s2)为参照峰的保留时间，tn为其它峰的保留时间，rt为相对保留时间，以上(2)、(3)、(4)、(5)可用一个主程序，四个子程序用循环结构一次完成，也可分次完成，使每一个样本数据形成一个样本表，打印，人工校正，如果不正确，应修改人工设定的识别窗口，正确后进行下一步。
(6)样本表指纹特征峰的读出根据样本表指纹特征峰的识别特征，人工设定识别窗口(物质峰的相对保留时间的波动范围)，在每个样本表抽取指纹特征峰的信息(峰号、保留时间、峰面积、峰高、峰宽、起始时间、终止时间、分离度、相对保留时间)，汇成一个指纹特征峰表，打印，人工校正，如果不正确，应修改人工设定的识别窗口，正确后进行下一步。
(7)单个物质峰表的汇成将每样本指纹特征峰表的信息读出，贮存在数组中，将每个样本指纹特征峰表中每个物质的数据汇成单个物质峰表，并在表尾添加峰号、保留时间、峰面积、峰高、峰宽(实际导出的为半峰宽)、起始时间、终止时间、分离度、相对保留时间的均值、标准差、相对标准差。打印，人工校正，如果不正确，应修改人工设定识别窗口，正确后进行下一步。
(8)指纹特征峰标准数据库表的汇成将每张单个物质峰表尾的峰号、保留时间、峰面积、峰高、峰宽、起始时间、终止时间、分离度、相对保留时间的均值、标准差、相对标准差，读出汇成一个指纹特征峰标准数据库表。
以上(6)、(7)、(8)均可用循环结构编程。
(9)指纹图谱曲线图的模拟在表单上建立坐标，打开要模拟的表文件，循环读取每个物质峰的保留时间tr、峰高h、峰面积a、半峰宽w1/2、起始时间s、终止时间e，分离度r，以分离度r，判断两峰是否分开(r＞1.5为分开，否则为分不开)，如果分开，则对函数y1=h·e(t-tr)22u12(s<t<tr),y2=h·e(t-tr)22u22(tr<t<e)]]>描点绘图，完成对偏态峰的模拟；如果分不开，则以给定峰面积代替真实峰面积，对函数y=h·e-(t-tr)22u2(s<t<e)]]>描点绘图，完成对分离度小的两峰曲线的模拟。
(10)指纹图谱中明确成分的含量测定建立“样品中明确成分的含量表”表中的字段分别为表名c(2)，样品号n(2)，产地c(10)，加工方法c(8)，明确成分峰面积n(10，5)，明确成分含量n(6，4)，相当标准含量分数n(6，4)。
其中表名为高效液相仪数据导出后的文件名，亦为程序导入后建成立的同名表名，需要人工输入。
样品号、产地、加工方法为样本(样品)的采集信息，需要人工输入。
明确成分含量根据明确成分标准曲线方程和明确成分峰面积由计算机计算并追加。
相当标准含量分数是由(6)、(7)、(8)程序处理后的标准表中读出明确成分标准峰面积，经标准曲线方程计算出明确成分标准含量，相当标准含量分数为样品明确成分含量与明确成分标准含量的比值。
(11)识别和评价其他被检测样品被检测样品经高效液相仪处理和数据导出，经(2)、(3)、(4)、(5)程序处理成样本表，读取该样本表数据，并模拟出该样品的高效液相仪图谱。根据(6)中人工设定的识别窗口，从该样本表中识别出指纹特征峰个数，并将它们分别汇成一个指纹特征峰表。添加标准表的峰面积，计算每个指纹特征峰面积与标准峰面积比值，并添加相对标准峰分数，计算所有指纹特征峰面积和与指纹特征标准峰总面积比值，并添加在表中，作为报告，打印。
程序模块化整体设计如说明书附图4例1广西熏硫红腺忍冬指纹图谱标准库的建立与被检测样品的识别。
广西熏硫红腺忍冬样品15个，每样品高效液相仪进样2次得30个文件包，导出CVS类型文件30个，分别命名为WLP050801-30。导入VFP的内部同名表文件WLP050801-30，并将表文件记录除类型之外由字符型改变为数字型。以保留时间＜29.and.保留时间＞27，保留时间＞59.and.保留时间＜61.的两个峰为参照峰，添加字段分离度、相对保留时间分离度r=2(tn-tn-1)wn-wn-1,]]>tn、tn-1为两峰的保留时间，wn、wn-1为两峰的峰宽。相对保留时间rt=tn-s1s2-s1(-∞<rt<+∞)s1,s2(s1<s2)]]>为参照峰的保留时间，tn为其它峰的保留时间，rt为相对保留时间，追加分离度和相对保留时间的记录。模拟WLP050805的图谱，参见说明书附图1。在每个表(如WLP050805)中寻找(相对保留时间＞-0.35.and.相对保留时间＜-0.34).or.；(相对保留时间＝0.0).or.；(相对保留时间＞0.1.and.相对保留时间＜0.11).or.；(相对保留时间＞0.11.and.相对保留时间＜0.12).or.；(相对保留时间＞0.27.and.相对保留时间＜0.29).or.；(相对保留时间＞0.57.and.相对保留时间＜0.59).or.；(相对保留时间＝1.0).or.；(相对保留时间＞1.03.and.相对保留时间＜1.08).or.；(相对保留时间＞1.18.and.相对保留时间＜1.20)的峰记录，并将记录追加到指纹特征峰表(如CWLP050805)中，以上将得到30个样品的指纹特征峰表C WLP050801-30。循环打开指纹特征峰表，读取相同相对保留时间(如相对保留时间＞0.1.and.相对保留时间＜0.11)的记录30条，追加到物质表(如WLPg3)中，对表中所有字段记录求均值、标准差、相对标准差，并添加到表尾，将得到9个物质峰表WLPg1-9。循环打开9个物质峰表WLPg1-9，读取最后三行记录，添加到指纹特征峰标准表，取名为WLP。该表抽象了15个样品30个表的信息。模拟WLP的图谱如说明书附图2，直观明了。
建立“熏硫红腺忍冬中绿原酸的含量表”字段分别为表名c(2)，样品号n(2)，产地c(10)，加工方法c(8)，绿原酸峰面积n(10,5)，绿原酸含量n(6,4)，相当标准含量分数n(6,4)。其中表名为高效液相仪数据导出后的文件名WLP050801-30，亦为程序导入后建成立的同名表名WLP050801-30，需要人工输入。样品号、产地、加工方法为样本(样品)的采集信息，人工输入。绿原酸含量根据绿原酸标准曲线方程和绿原酸峰面积由计算机计算并追加。相当标准含量分数是由指纹特征峰标准表WLP中读出绿原酸标准峰面积，经标准曲线方程计算出绿原酸标准含量，相当标准含量分数为样品绿原酸含量与绿原酸标准含量比值。
被检测样品经高效液相仪处理和数据导出，经(2)、(3)、(4)、(5)程序处理成样本表p123，读取该样本表数据，并模拟出该样品的高效液相仪图谱，如说明书附图1。根据(6)中人工设定的识别窗口，从该样本表中识别出指纹特征峰个数，并将它们分别汇成一个指纹特征峰表。添加与标准表对应峰的峰面积，计算每个指纹特征峰面积与标准峰面积比值，并添加相对标准峰分数，计算所有指纹特征峰面积和与指纹特征标准峰总面积比值，并添加在表中，打印该表，被检测样品的检测报告，如说明书附图3。
图1模拟高效液相仪图谱的效果图可以增加坐标，并使模拟图谱具有缩放功能。与原图相比保留时间、峰面积、峰高、峰宽、起始时间、终止时间、分离度等峰形特征都得以模拟。
图2广西熏硫红腺忍冬定量指纹图谱标准表为基础的模拟图谱该图直观地反映了指纹特征标准峰的保留时间、峰面积、峰高、峰宽、起始时间、终止时间、分离度等峰形特征。
图3被检测样品的检测报告列出了从被检测样品中找到的指纹特征峰的数字特征，如峰号、保留时间、峰面积、峰高、峰宽、起始时间、终止时间、分离度、相对保留时间。并列出对应标准峰的峰面积、比值、总面积及比值(最后一行)。由图可知样品指纹特征峰总面积为42954.3426，标准峰总面积为46408.3240，两者比值为0.92579。由此可得出该样品质量优劣度相当于标准的0.92579。
图4程序模块化整体设计图发明的优点及积极效果 本方法提供了参照峰的选取、窗口的设定及处理数据程序方法思路，可轻松地处理大量数据，建立定量指纹图谱数据库标准，使指纹图谱不仅具有定性鉴别能力，还具有定量判断被检测样品质量优劣的功用。同时可模拟图谱，给予信息提示和表报告。提出了建立定量指纹图谱的方法，解决了目前指纹图谱仅用于定性鉴别，不能用于定量评价其他样品质量的问题。应用计算机程序处理大量数据，处理结果以数字和图形两种形式表现，更直观且准确。
该定量指纹图谱建立方法可推广应用于各种中药材、中药饮片及中成药的质量控制，适用于拥有普通中药科研人员、一台高效液相仪、一台含有VFP程序的电脑的生产及科研单位。可方便地建立自己产品的定量指纹图谱标准数据库。并对该产品的其他样本进行真伪识别和优劣评价，增强质量控制环节，提高产品科学含量。
权利要求
1 建立中药定量指纹图谱的方法步骤包括(1)数据导出，(2)数据的导入，(3)数据类型的改变，(4)参照峰的选取、识别与其保留时间的读出，(5)分离度和相对保留时间的添加，(6)样本表指纹特征峰的读出，(7)单个物质峰表的汇成，(8)指纹特征峰标准数据库表的汇成，(9)指纹图谱曲线图的模拟，(10)指纹图谱中明确成分的含量测定，(11)识别和评价其他被检测样品。
2 消除相对保留时间波动的参照峰处理方法选取两个标志性强的峰为参照峰，保留时间为s1、s2(s1＜s2)，其它峰的保留时间为tn，相对保留时间为rt，相对保留时间rt=tn-s1s2-s1(-∞<rt<+∞),]]>消除仪器不同死体积不同而引起的误差。
3 利用高效液相仪导出的数据模拟分离度小的峰和偏态峰的方法。
全文摘要
提供方法和程序总体设计框架，对能代表总体的多个样品图谱数据处理，统计出总体的共同指纹特征，对每个共有指纹特征峰保留时间、峰面积等10项参数进行统计，计算其均值、标准差、相对标准差，统计出总体的数字共同指纹特征，作为可定性定量的指纹图谱标准数据库。以之为参照，相对保留时间作为定性指标，峰面积或峰高作为定量指标进行其他样品的识别和质量评定。能依据高效液相导出的数据模拟图谱，包括偏态峰形和分离度过小的峰形，对成分明确的物质进行含量测定的数据处理。该方法可推广应用于各种中药材、中药饮片及中成药的质量控制。
文档编号G06F19/00GK101051041SQ20061007682
公开日2007年10月10日 申请日期2006年4月6日 优先权日2006年4月6日
发明者辛宁, 张守平, 王柳萍 申请人:辛宁, 张守平, 王柳萍