专利名称：桂枝茯苓药物组合物色谱指纹图谱及其检测方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种中药组合物的高效液相色谱指纹图谱及其检测方法，具体涉及桂 枝茯苓药物组合物的高效液相色谱指纹图谱及其检测方法及应用。
背景技术：
桂枝茯苓药物组合物由桂枝、茯苓、白芍、牡丹皮、桃仁五味药材制成，具有活血化 瘀、缓消癥块的功效，临床主要用于治疗慢性盆腔炎、痛经、子宫肌瘤等疾病。本发明的申请人对桂枝茯苓药物组合物的制备工艺进行了研究，并申请中国发明 专利，申请号为200310116836. X，公开号为CN1546129。之后申请人对该桂枝茯苓药物组合 物的质量检测方法进行了研究，并也申请了中国发明专利，申请号为200410000136. 9，公开 号为 CN1556404。为了提高桂枝茯苓药物组合物的疗效并减少服用剂量，申请人在上述研究的基础 上改进了原有制备工艺，形成了本发明的桂枝茯苓药物组合物，该项研究申请了中国发明 专利，申请号为200410041212. 0、公开号为CN1583102A，该件专利对本发明的桂枝茯苓药 物组合物的制备方法有详细的描述。为了有效地控制本发明的桂枝茯苓药物组合物的质 量，申请人对其进行了质量检测方法的研究，建立了高效液相色谱标准指纹图谱与检测方 法，用来对本发明的桂枝茯苓药物组合物进行质量控制，形成了本发明的技术方案。
发明内容
本发明的目的是提供作为质量检测标准的一种中药桂枝茯苓药物组合物的标准 指纹图谱。本发明的另一个目的是提供该桂枝茯苓药物组合物标准指纹图谱的测定方法。本发明还有一个目的是提供该桂枝茯苓药物组合物标准指纹图谱在质量控制中 的应用。本发明的目的是通过以下方法实现的一种由桂枝、茯苓、白芍、桃仁、牡丹皮为原料制备的桂枝茯苓药物组合物的标准 高效液相色谱指纹图谱，该图谱中呈现5个主要色谱峰，其中各色谱峰与参照峰(S号峰) 之间的相对保留时间为1号峰为0. 20 0. 35，S号峰为1，2号峰为1. 15 1. 40，3号峰 为1. 25 1. 50，4号峰为2. 10 2. 40，其中S号峰为参照物芍药苷的色谱峰。上述桂枝茯苓药物组合物的高效液相色谱指纹图谱的检测方法如下(1)色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以含0. 磷酸及5%乙腈的 水溶液为流动相A，以含0. 磷酸及50%乙腈的水溶液为流动相B，进行梯度洗脱；流速为 0. 5 1. 5ml/min ；检测波长为220 MOnm ；(2)参照物溶液的制备取芍药苷对照品适量，称定，加甲醇制成Iml含40 60 μ g的溶液；(3)供试品溶液的制备取待测品0.20 0.30g，置锥形瓶中，加入甲醇20 30ml，超声，过滤，取续滤液作为供试品溶液；(4)测定分别取参照物溶液和供试品溶液各5 20μ 1，注入高效液相色谱仪，测定。上述的检测方法的优选技术方案为(1)色谱条件高效液相色谱仪，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以含0. 磷酸及5%乙腈的水溶液为流动相Α，以含0. 磷酸及50%乙腈的水溶液为流动相B，进行
梯度洗脱，洗脱程序为时间(min)A%B%01000700100711000801000检测波长为230nm ；理论板数按参照物(芍药苷)峰计算，应不低于6000 ；(2)参照物溶液的制备取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每Iml含 50 μ g的溶液；(3)供试品溶液的制备取待测品，混勻，研细，取约0. 25g，置具塞锥形瓶中，精密 加入甲醇25ml，超声30min，过滤，取续滤液做为供试品溶液；(4)测定分别取参照物溶液和供试品溶液各10μ 1，注入高效液相色谱仪，测定；上述的指纹图谱及其检测方法可以对桂枝茯苓药物组合物的片剂、硬胶囊剂、软 胶囊剂、丸剂、滴丸剂、颗粒剂的质量进行检测。上述的指纹图谱及其检测方法用于对本发明桂枝茯苓药物组合物质量的检测与 控制，标准要求，待测供试品指纹图谱与标准指纹图谱经相似度软件计算，相似度不应低于 0. 85。相似度软件为国家药典委员会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价系统。以本发明桂枝茯苓药物组合物硬胶囊剂为例，对本发明提供的指纹图谱及其检测 方法进行研究与说明1.仪器与试药(I)Agilent 1100高效液相色谱仪；(2)高速离心机；(3)本发明的桂枝茯苓药物组合物(来源自制)；(4)乙腈(HPLC 级，美国 TEDIA 公司)；(5)甲醇(AR级，南京化学试剂有限公司)；(6)磷酸(南京化学试剂有限公司)；(7)芍药苷(中国药品生物制品检定所，批号110736-200732)；2.方法与结果2. 1色谱条件=Agilent 1100液相色谱仪，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色 谱柱Alltima C18，4. 6X 250謹，5 μ m)；以含0. 1 %磷酸及5%乙腈的水溶液为流动相A，以 含0. 磷酸及50%乙腈的水溶液为流动相B，洗脱程序为时间(min)A%B%01000
700100711000801000流速为lml/min ；检测波长为230nm。理论板数按参照物(芍药苷)峰计算，应不 低于6000。2. 2检测波长选择桂枝茯苓药物组合物硬胶囊剂中主要成分芍药苷最大吸收波 长为230nm。为了能更全面的反映药物中的成分，发明人检测了 203、218、230、M5、275nm五 个波长下的指纹图谱，经比较分析，确定230nm为最佳波长，在该波长下的指纹图谱中，除 已知成分芍药苷能够较好的检测出外，其它成分指纹峰也能被较好地体现，且各峰分离度 好，基线较平稳、重复性好。2. 3提取溶剂与提取方法选择发明人分别考察了甲醇、乙醇作为溶媒的提取效 果，结果发现用甲醇提取的样品，色谱峰较多，能够更全而的反应本品的指纹特征；还考察 了超声提取法、加热回流法、索式提取法三种提取方法及不同提取时间，结果表明，以上三 种提取方法制备的供试品溶液，对检测结果影响不大，考虑节省时间和节约成本的因素，选 用超声提取30分钟的方法。2. 4参照物溶液的制备取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每Iml含 50 μ g的溶液，即得。2. 5供试品溶液的制备取桂枝茯苓药物组合物硬胶囊剂装量差异项下的内容 物，混勻，研细，取约0. 25g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，超声30min，过滤，取续滤 液作为供试品溶液，即得。2. 6精密度试验取同一批桂枝茯苓药物组合物硬胶囊剂，按供试品溶液的制备 方法制备供试品溶液，连续进样6次进行测定。测定结果见表1、2。结果表明，供试品溶液 中各共有峰的保留时间及主要峰(占总峰面积5%以上)的峰面积基本一致(RSD <3%), 又以第1次进样所得指纹图谱做为对照计算后5次进样所得指纹图谱的相似度，结果相似 度结果均不小于0.99。表明该方法精密度良好。表1桂枝茯苓药物组合物硬胶囊剂指纹图谱精密度考察结果
(占总峰面积5 %以上主要峰的保留时间)
sNv次数 峰号123456Aver (平均 值〉RSD% (相对标 准偏差)RtRtRtRtRtRtRtRtS24. 86924. 86924. 87224. 87224. 88324. 89024. 8690. 0316.8166. 8246. 8296. 8266. 8376. 8506. 8160. 172 "Π31. 64631.65131. 66331. 67031. 68931. 70731. 6460. 073 二34.18434.18434. 19234.19634. 21534. 22834. 1840. 05456. 36356.35956. 36456. 37756. 39856. 41956. 3630. 04
5
注Rt为相对保留时间(下同)；Aver为平均值(下同)；RSD%为相对标准偏差 (下同)表2桂枝茯苓药物组合物硬胶囊剂指纹图谱精密度考察结果(古总峰面积5%以上的主要峰的峰面积)
权利要求
1.一种由桂枝、茯苓、白芍、桃仁、牡丹皮为原料制备的桂枝茯苓药物组合物的标准指 纹图谱，其特征在于该指纹图谱为高效液相色谱图谱，该图谱中呈现5个主要色谱峰，其中 各色谱峰与参照峰(S号峰)之间的相对保留时间为1号峰为0. 20 0. 35，S号峰为1，2 号峰为1. 15 1.40，3号峰为1. 25 1. 50，4号峰为2. 10 2. 40，其中S号峰为参照物芍 药苷的色谱峰。
2.如权利要求1所述的桂枝茯苓药物组合物的高效液相色谱指纹图谱，其特征在于该 指纹图谱的检测方法如下(1)色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以含0.1 %磷酸及5%乙腈的水 溶液为流动相A，以含0. 磷酸及50%乙腈的水溶液为流动相B，进行梯度洗脱；流速为 0. 5 1. 5ml/min ；检测波长为220 MOnm ；(2)参照物溶液的制备取芍药苷对照品适量，称定，加甲醇制成Iml含40 60μ g的 溶液；(3)供试品溶液的制备取待测品0.20 0. 30g，置锥形瓶中，加入甲醇20 30ml，超 声，过滤，取续滤液作为供试品溶液；(4)测定分别取参照物溶液和供试品溶液各5 20μ1，注入高效液相色谱仪，测定。
3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于(1)色谱条件高效液相色谱仪，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以含0.磷酸 及5%乙腈的水溶液为流动相Α，以含0. 磷酸及50%乙腈的水溶液为流动相B，进行梯 度洗脱，洗脱程序为起始时，流动相中A的含量为100%，B的含量为0，0min至70min过 程中，流动相中A的含量从100%线性下降至0，B的含量从0线性上升至100%，71min至 80min的过程中，流动相中A的含量保持在100%，B的含量保持在0 ；流速为lml/min ；检测 波长为230nm ；理论板数按参照物(芍药苷)峰计算，应不低于6000 ；(2)参照物溶液的制备取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每Iml含50μg 的溶液；(3)供试品溶液的制备取待测品，混勻，研细，取约0.25g，置具塞锥形瓶中，精密加入 甲醇25ml，超声30min，过滤，取续滤液做为供试品溶液；(4)测定分别取参照物溶液和供试品溶液各10μ1，注入高效液相色谱仪，测定；。
4.如权利要求1 3所述的指纹图谱及其检测方法，其特征在于可以对桂枝茯苓药物 组合物的片剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、丸剂、滴丸剂、颗粒剂的质量进行检测。
5.如权利要求1 3所述的指纹图谱及其检测方法在控制桂枝茯苓药物组合物质量中 的应用，其特征在于待测供试品指纹图谱与标准指纹图谱经相似度软件计算，相似度不应 低于0. 85。
全文摘要
本发明涉及一种桂枝茯苓药物组合物的标准指纹图谱，并提供了该药物组合物标准指纹图谱的测定方法。该指纹图谱为高效液相色谱图谱，该图谱中呈现5个主要色谱峰，其中各色谱峰与参照峰(S号峰)之间的相对保留时间为1号峰为0.20～0.35，S号峰为1，2号峰为1.15～1.40，3号峰为1.25～1.50，4号峰为2.10～2.40，其中S号峰为参照物芍药苷的色谱峰。
文档编号G01N30/02GK102114094SQ20101000371
公开日2011年7月6日 申请日期2010年1月1日 优先权日2010年1月1日
发明者付小环, 刘涛, 孙永城, 尚强, 毕宇安, 王振中, 窦霞, 章晨峰, 萧伟, 陈凤龙 申请人:江苏康缘药业股份有限公司