一种木二糖的气相色谱检测方法
【专利摘要】一种木二糖的气相色谱检测方法，涉及木二糖。取含木二糖的低聚木糖样品、核糖醇内标，加入NaBH4和去离子水，反应后加入乙酸至无气泡产生，再加入甲醇，减压浓缩至干燥，然后加入乙酸酐和吡啶，继续反应后加入乙酸乙酯萃取衍生化产物，水洗得标准样品，用于气相色谱分析；设定仪器工作条件：气相色谱柱的温度为150～400℃，流动相的流速为0.1～10.0mL·min-1，检测器的温度为150～400℃；将待测液进样至进样口内，开始检测并记录色谱图，并用气质联用仪分析其成分；借助分析软件，得到木二糖的校准曲线，用作样品中木二糖的定量分析，根据木二糖峰的出峰面积与内标峰的面积的比值判断木二糖的含量。
【专利说明】一种木二糖的气相色谱检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及木二糖，尤其是涉及一种木二糖的气相色谱检测方法。
【背景技术】
[0002]低聚木糖是一种非消化性低聚糖，是由2~7个D-木糖以β-1，4_木糖苷键结合而成的低聚糖，是新一代功能性低聚糖产品。低聚木糖具有优良的稳定性，能在较宽的PH值、温度范围内保持稳定，能选择性增殖肠道内的双歧杆菌，具有促进双歧杆菌增长以及改善肠道功能的作用。它的甜度比蔗糖和葡萄糖均低，仅为蔗糖的40%，具有抗龋齿性。其独特的生理活性和良好的理化特性使得低聚木糖被认为是目前最有前途、国内外研究最为广泛的功能性低聚糖之一。木二糖是低聚木糖的主要有效成分，也是低聚木糖定性和定量的关键成分。因而如何快速而准确地检测木二糖含量就成了这类研究得以进行的关键问题之一。[0003]常见的木二糖分析方法有纸层析法、薄层层析法、高效液相色谱法。前2种方法属定性方法，定量效果不理想，低于mg量级就难以检测。高效液相色谱法是最常见的木二糖定量分析方法，但当样品中糖类组分较多时，其分离效果往往很差，检测灵敏度差，重现性不好，而且分析时间长，消耗流动相多，天然糖组分往往杂质多，对色谱柱寿命影响很大。采用衍生化法配合气相色谱是分析单糖的常见方法，具有速度快、灵敏度高等优点，但用于分析木二糖尚未见报道。采用气相色谱分析木二糖需要解决两个问题:一是要有合适的衍生化方法，二是合适的操作控制条件，使之具有较高的理论塔板数和良好的柱效。
[0004]中国专利CN102288688A公开一种利用高效液相离子交换色谱测定低聚木糖的方法。该方法包括:高效液相离子交换色谱系统与色谱条件的确定、低聚木糖标准工作方程的测定、木七糖和木八糖的色谱保留时间确定和低聚木糖成分的分析与测定。该发明利用高效液相离子交换色谱测定低聚木糖的方法，建立了高效液相离子交换色谱精确定量测定低聚木糖的方法，采用CarboPacTMPA200 (3X250m)色谱柱，通过醋酸钠和氢氧化钠二元梯度洗脱显著提高了木糖及各种低聚木糖组分之间的分离度及检测效率，实现对低聚木糖样品，尤其是木二糖至木六糖组分的精确定量测定，及对木七糖和木八糖类糖组分的定性分析，对于低聚木糖产品的检测评价和推广应用具有重要的意义。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种木二糖的气相色谱检测方法。
[0006]本发明包括如下步骤:
[0007]I)样品衍生化:
[0008]取含木二糖的低聚木糖样品、核糖醇内标，加入NaBH4和去离子水，反应后，加入乙酸至无气泡产生，再加入甲醇，减压浓缩至干燥，然后加入乙酸酐和吡啶，继续反应后加入乙酸乙酯萃取衍生化产物，水洗，得标准样品，用于气相色谱分析；
[0009]2)设定仪器工作条件:[0010]气相色谱柱的温度为150?400°C，流动相的流速为0.1?10.0mL miiT1,检测器的温度为150?400°C ；
[0011]3)进样:
[0012]将待测液进样至进样口内，开始检测并记录色谱图，并用气质联用仪分析其成分；
[0013]4)结果表征:
[0014]借助分析软件，得到木二糖的校准曲线，用作样品中木二糖的定量分析，根据木二糖峰的出峰面积与内标峰的面积的比值判断木二糖的含量。
[0015]在步骤I)中，所述含木二糖的低聚木糖样品、核糖醇内标、NaBH4、去离子水、甲醇、乙酸酐、批唳、乙酸乙酯的配比可为0.1?IOOmg: 0.1?IOOmg:1?500mg: 0.1?IOmL: 0.1?20.0mL: 0.1?5.0mL: 0.1?5.0mL: lmL，其中，含木二糖的低聚木糖样品、核糖醇内标、NaBH4以质量计算，去离子水、甲醇、乙酸酐、吡啶、乙酸乙酯以体积计算；所述反应的时间可为0.5?5h ;所述减压浓缩的温度可为40?90°C;所述继续反应的温度可为70?120°C，继续反应的时间可为0.1?3.0h。
[0016]在步骤2)中，所述气相色谱柱可采用非极性气相色谱柱、弱极性气相色谱柱、中极性气相色谱柱等中的一种；所述流动相可采用氮气或氦气等；所述检测器可采用TCD检测器或FID检测器等。
[0017]在步骤3)中，所述将待测液进样至进样口内的进样量可为0.1?200 μ L。
[0018]本发明建立了以吡啶为溶剂和催化剂，以乙酸酐为乙酰化试剂，对酶解获得的木二糖进行衍生化，以核糖醇为内标，通过毛细管气相色谱法，对样品中木二糖衍生化产物进行分离定量检测和气质联用定性。以吡啶为溶剂和催化剂对糖醇类物质进行乙酰化具有操作简便、灵敏度高、对糖类物质分析专一性较好、干扰较小、速度快、衍生化产物单一等优点，适用于低聚木糖样品中木二糖的定性、定量分析。在合适的分析条件下，气质联用技术能对其快速定性，用气相色谱能得到糖醇乙酰化衍生物理想的分离和定量结果。对于柱效好的色谱分析来说，这样做可以得到理想的分离结果。本发明应用气相色谱分析软件得到木二糖校准曲线，也可通过这一分析系统直接得到木二糖的定量结果。如果这些条件不具备，根据内标、内标峰面积、木二糖的梯度浓度和不同浓度木二糖对应的峰面积，通过常用的分析软件也一样可以得到理想的校准曲线和定量结果。总之，本发明操作简单，衍生化反应迅速，最低检测量达到了 ng量级，适用于食品营养、医药卫生等行业中木二糖的定性、定量分析。
[0019]本发明采用硼氢化盐为还原剂、吡啶为溶剂和催化剂、乙酸酐为乙酰化试剂，对木二糖进行乙酰化衍生化后的气相色谱分离、质谱鉴定的分析方法。以核糖醇为内标，通过校准曲线对木二糖进行定量分析。此法测定木二糖的最低量可达io_ng，适于样品中微量木二糖的分析测定。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1为总离子流图。
[0021]图2为木二糖乙酯质谱鉴定图谱。
[0022]图3为核糖醇衍生化产物图谱。[0023]图4为内标物标准曲线。
【具体实施方式】
[0024]以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
[0025]1.材料和仪器
[0026]试剂:硼氢化钠、吡啶、乙酸酐、核糖醇、木二糖、甲醇、乙酸乙酯，以上药品均为分析纯。
[0027]仪器:岛津GCMS-QP2010型气相色谱仪、真空浓缩仪等。
[0028]2.检测步骤
[0029](I)样品衍生化
[0030]①取含木二糖的低聚木糖样品0.1?lOOmg，核糖醇内标0.1?lOOmg，加入I?500mgNaBH4和0.1?IOmL去离子水，充分混匀反应0.5?5h，滴入乙酸至无气泡产生；
[0031]②加入0.1?20.0mL甲醇，40?90°C减压浓缩至干燥，；
[0032]③加入0.1?5.0mL乙酸酐和0.1?5.0mL吡啶混匀，70?120°C反应0.1?3.0h后加入ImL乙酸乙酯萃取衍生化产物，以ImL水洗。
[0033]④将制备好的标准样品用于气相色谱分析。
[0034](2)设定仪器工作条件
[0035]①气相色谱柱采用非极性、弱极性或者中极性柱，可恒定温度，也可程序升温，最终柱温控制在150?400°C ；
[0036]②流动相为高纯氮或高纯氦,流速0.1?10.0mL.mirT1 ；
[0037]③采用T⑶或者FID检测器，温度150?400°C。
[0038](3)进样
[0039]以0.1?200 μ L进样量将待测液进样至进样口内，开始检测并记录色谱图，并用气质联用仪分析其成分。
[0040](4)结果表征
[0041]借助分析软件，得到木二糖的校准曲线，用作样品中木二糖的定量分析，根据木二糖峰的出峰面积与内标峰的面积的比值判断木二糖的含量。
[0042]以下给出具体实施例。
[0043]实施例1未知样品中木二糖的分析
[0044]取含木二糖的低聚木糖样品IOmg,核糖醇内标IOmg,加入50mg NaBH4和2mL去离子水，充分混匀反应2h，滴入乙酸至无气泡产生，加入5mL甲醇，60°C减压浓缩至干燥，加入ImL乙酸酐和ImL吡啶混匀，100°C反应Ih后加入ImL乙酸乙酯萃取衍生化产物，以ImL水洗。将制备好的标准样品用于气相色谱分析，并用气质联用仪分析其成分。最后借助分析软件，得到木二糖的校准曲线，用作样品中木二糖的定量分析。设备岛津GCMS-QP2010型气相色谱质谱联用仪，TCD检测器温度为270°C，进样器温度为280°C，BP-15柱(30mX0.25mmX0.25mm),载气He0.8mL.mirT1,进样分流比200:1。柱箱温度条件:初始温度 50。。，20。。.mirT1 升温到 270°C，保留 50min。
[0045]图1给出总离子流图。依据木二糖醇乙酰基衍生物在GC-MS总离子流中的出峰顺序，可以确定核糖醇和木二糖乙酰衍生化产物在气相色谱分离结果中的保留时间。从各标准物的保留时间和对应的质谱图及其结构鉴定结果可知，图1中两峰分别为核糖醇和木二糖的乙酰化产物，核糖醇的保留时间是21.875min，木二糖保留时间为40.415min。
[0046]图2给出木二糖乙酯质谱鉴定图谱，图3给出核糖醇衍生化产物图谱。分析结果表明，木二糖等糖类物质的乙酰化产物能很好地得到分离，应用此法对木二糖进行定性分析是准确可靠的。
[0047]将5个梯度浓度标准样品混合物用于气相色谱分析，调出5个气相色谱图，获取内标物曲线(图4)。所得内标物曲线相关系数为0.9798，可借助下述分析方法和相应的分析软件，依据该曲线对样品中的木二糖进行定量分析。
[0048]f= (As/ms) / (Ar/ mr)
[0049]其中f为校正因子，As和A,分别为内标物和木二糖的峰面积，ms和m,分别为加入内标物和木二糖的量。再根据含内标物的待测组分溶液色谱峰响应值，计算含量(Hli):
[0050]m^f XAi/ (As/ms)
[0051]其中Ai和As分别为木二糖和内标物的峰面积，ms为加入内标物的量。再根据稀释倍数和取样量折算成百分含量。
[0052]实验所用的气相色谱噪音峰高为14mV，系统确认3倍峰高为各物质最小检测量。根据最佳衍生化条件下木二糖所出峰高和样品浓度、进样量和分流比计算出木二糖的最低检测量约为5.0X lQJg。因此，此法可对微量木二糖准确定量。
【权利要求】
1.一种木二糖的气相色谱检测方法，其特征在于包括如下步骤: 1)样品衍生化: 取含木二糖的低聚木糖样品、核糖醇内标，加入NaBH4和去离子水，反应后，加入乙酸至无气泡产生，再加入甲醇，减压浓缩至干燥，然后加入乙酸酐和吡啶，继续反应后加入乙酸乙酯萃取衍生化产物，水洗，得标准样品，用于气相色谱分析； 2)设定仪器工作条件: 气相色谱柱的温度为150~400°C，流动相的流速为0.1~10.0mL.min-1检测器的温度为150~400°C ； 3)进样: 将待测液进样至进样口内，开始检测并记录色谱图，并用气质联用仪分析其成分； 4)结果表征: 借助分析软件，得到木二糖的校准曲线，用作样品中木二糖的定量分析，根据木二糖峰的出峰面积与内标峰的面积的比值判断木二糖的含量。
2.如权利要求1所述一种木二糖的气相色谱检测方法，其特征在于在步骤I)中，所述含木二糖的低聚木糖样品、核糖醇内标、NaBH4、去离子水、甲醇、乙酸酐、吡啶、乙酸乙酯的配比为 0.1 ~IOOmg: 0.1 ~IOOmg: I ~500mg: 0.1 ~IOmL: 0.1 ~20.0mL: 0.1 ~5.0mL: 0.1~5.0mL: lmL，其中，含木二糖的低聚木糖样品、核糖醇内标、NaBH4以质量计算，去离子水、甲醇、乙酸酐、吡啶、乙酸乙酯以体积计算。
3.如权利要求1所述一种木二糖的气相色谱检测方法，其特征在于在步骤I)中，所述反应的时间为0.5~5h。
4.如权利要求1所述一种木二糖的气相色谱检测方法，其特征在于在步骤I)中，所述减压浓缩的温度为40~90°C。
5.如权利要求1所述一种木二糖的气相色谱检测方法，其特征在于在步骤I)中，所述继续反应的温度为70~120°C，继续反应的时间为0.1~3.0h。
6.如权利要求1所述一种木二糖的气相色谱检测方法，其特征在于在步骤2)中，所述气相色谱柱采用非极性气相色谱柱、弱极性气相色谱柱、中极性气相色谱柱中的一种。
7.如权利要求1所述一种木二糖的气相色谱检测方法，其特征在于在步骤2)中，所述流动相采用氮气或氦气。
8.如权利要求1所述一种木二糖的气相色谱检测方法，其特征在于在步骤2)中，所述检测器采用TCD检测器或FID检测器。
9.如权利要求1所述一种木二糖的气相色谱检测方法，其特征在于在步骤2)中，在步骤3)中，所述将待测液进样至进样口内的进样量为0.1~200 μ L。
【文档编号】G01N30/88GK103901150SQ201410156499
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月18日 优先权日:2014年4月18日
【发明者】刘健, 龙敏南, 甘礼惠 申请人:厦门大学