用于生物样品快速分离的超短色谱微柱及其制备方法与流程

本发明涉及色谱微柱，尤其是涉及用于生物样品快速分离的超短色谱微柱及其制备方法。

背景技术：

微型化是当今科技发展的一大趋势，这一趋势同样出现在高效液相色谱的演化与发展的过程中。来源于生命体系(局部病变组织、单细胞等)的样品提取过程繁琐且可获得的量及其微小，常规的分析柱以及微径柱较高的体积流量会对微量样品造成严重的稀释效应，降低分析检测的灵敏度。为降低液相色谱流动相对微量样品的稀释效应需要进一步缩小色谱柱径至微米级，毛细管液相色谱柱应运而生。毛细管液相色谱柱多采用内径为20～100μm的弹性石英毛细管填充制备，因其特征的体积流量在几百纳升每分钟也被称为纳流液相色谱柱。对于液相色谱而言，体积流量随着色谱柱径的降低而降低，毛细管液相色谱柱除了具有较高的柱效之外，其极低的体积流量能显著降低液相色谱流动相的消耗，可以称之为一种绿色环保的分析方法；其极低的体积流量能降低对样品的稀释程度，提高分析检测的灵敏度，与微纳尺度的样品具有良好的匹配性；其极低的体积流量还能降低质谱离子源的负担，与质谱检测器有较好的兼容性。现如今在蛋白质组研究中，纳流液相色谱与当代质谱的联用平台已经成为蛋白质组研究中最具代表性的分析鉴定技术。

对于大规模样品分析而言，作为质谱前端的样品处理平台，色谱分离技术正在往着快速、高通量、操作简便等方向发展，因此，发展较短柱长的色谱柱和对应的色谱方法对于快速处理大规模样品而言有着重要意义。同时，对于许多生物样本来说，自身的稀有性导致了样本量往往偏少，在流经色谱柱床时，色谱固定相的多孔特性以及表面化学或多或少会对样品分子有一定程度的非特异性永久吸附，使得在流经色谱柱进入检测器后传感器响应值偏低，影响最终分析结果的灵敏度。由于这种吸附是固定相本身特性决定的，减少填料体积，缩短柱长成为了一种可靠的解决方案。在传统的毛细管液相色谱柱制备过程中，柱塞的制作往往需要通过烧结部分填料来完成，很难精确控制柱床长度，从而无法实现较短柱床色谱柱的制作。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供用于生物样品快速分离的超短色谱微柱及其制备方法。

所述用于生物样品快速分离的超短色谱微柱包含一根中空石英毛细管，毛细管内填充有柱床长度小于1mm的固定相填料颗粒，微柱两端分别设有两个多孔二氧化硅微球作为柱塞。

所述生物样品快速分离的超短色谱微柱的制备方法包括以下步骤：

1)截取中空石英毛细管，将一颗多孔二氧化硅微球压入中空石英毛细管一端作为出口柱塞；

2)称取填充的色谱固定相放入一个移液枪头中，移液枪头尖端部分与中空石英毛细管连接并用胶条密封，将连有中空石英毛细管的移液枪头放入离心机中，通过离心力驱动使得固定相颗粒在空管中堆砌成柱床；

3)在填充完成中空石英毛细管一端压入多孔二氧化硅微球作为入口柱塞，然后在显微镜下用陶瓷刀片沿入口柱塞位置将多余空管截去，从而完成生物样品快速分离的超短色谱微柱的制备。

在步骤1)中，所述中空石英毛细管可采用中空石英弹性毛细管；所述中空石英毛细管的内径可为25～100μm。

在步骤2)中，所述色谱固定相可为但不限于反相c18填料、阴离子交换填料、阳离子交换填料、亲水作用填料(hilic)等中的一种。

所述完成生物样品快速分离的超短色谱微柱的制备过程中填料在干燥状态下直接填充，无需经过溶剂浸润；所述整根色谱柱长为3～5mm。

本发明可以实现柱床长度小于1mm，使用时无需外接高压泵，可直接用注射器进行洗脱，所生成的色谱馏分可直接点板用于基质辅助激光解吸电离(maldi)质谱鉴定，适用于微量珍稀生物样本的快速分离和预处理。

本发明可以在将柱床长度精确控制在1mm以下，有效解决微量生物样品分离中的吸附问题，同时本发明提供了一种无须外接高压泵的色谱洗脱方法，该方法操作简单，使用方便，可以直接与基质辅助激光解吸电离(maldi)质谱耦合，用于生物样品分子结构的深度解析。

附图说明

图1为本发明所述生物样品快速分离的超短色谱微柱的结构示意图。

图2为本发明所述生物样品快速分离的超短色谱微柱的填充过程示意图。

图3为苯系物快速分离色谱图。

图4为本发明所述生物样品快速分离的超短色谱微柱逐滴洗脱点板示意图。

图5为蛋白质ribonucleasea的质谱检测结果。

图6为蛋白质lysozyme的质谱检测结果。

图7为蛋白质myoglobin的质谱检测结果。

图8为蛋白质cytochromec的质谱检测结果。

图9为蛋白质albuminbovine的质谱检测结果。

具体实施方式

下面结合附图详细说明本发明的几种可选实施例。

参见图1～9，所述用于生物样品快速分离的超短色谱微柱包含一根中空石英毛细管2，毛细管内填充有柱床长度小于1mm的固定相填料颗粒，微柱两端分别设有两个多孔二氧化硅微球1作为柱塞。

实施例1：1mm柱床的超短色谱微柱制备

截取中空石英毛细管2的内径100μm，外径365μm的中空石英毛细管5cm(河北永年锐沣色谱器件有限公司)，将中空石英毛细管2一端置于盛有直径110μm的多孔二氧化硅微球1(英国x-tec公司)的离心管中，将单颗多孔二氧化硅微球1压入毛细管一端作为出口柱塞。

取20μl移液枪头7，将上述毛细管开口端插入枪头尖端，连接处及移液枪头7开口处用密封胶条缠绕密封(如图2所示)。称取1mg粒径为5μm的c18反相硅胶键合填料(waters公司)作为色谱固定相3，将所取填料加入到移液枪头7中。将连接有毛细管的移液枪头7置于离心机内，设置离心转速9000rpm，离心时间15min。离心完成后取下毛细管，按上述同样方法在另外一段压入一颗多孔二氧化硅微球1作为入口柱塞。然后使用外径为90μm的石英毛细管(河北永年锐沣色谱器件有限公司)在显微镜下将多孔二氧化硅微球1推至柱床末端。将所得毛细管柱置于显微镜下，用陶瓷刀片沿入口柱塞位置切去多余空管，从而完成整根超短色谱微柱的制作。

实施例2：快速色谱分离效能评价

将实施例1中所得超短色谱微柱连接在纳流液相色谱仪中，出口端连接一段内径20μm的毛细管作为连接管将液流导入紫外检测器中，在214nm紫外光条件下测试该色谱柱对于苯的同系物(硫脲、苯、甲苯、乙苯、丙苯)的分离能力。流动相配比为can/h2o＝60/40，体积流速为200nl/min，分离时间60s，所得色谱图如图3所示，最后一个组分丙苯的分离柱效为33600塔板/m。

实施例3：超短色谱微柱用于基质辅助激光解吸电离(maldi)质谱的点板

如图4所示，取五种蛋白质混合溶液作为待测样品(cytochromec、lysozyme、ribonucleasea、myoglobin、albuminbovine)，使用1ml注射器4吸取平衡溶液(can/h2o＝5/95)待用，将实施例1中所制备的超短色谱微柱入口端柱头沾取少量样品后，通过ptfe套管连接在1ml注射器上，然后缓慢推动注射器活塞，使得柱管内部充分浸润。另取一根1ml注射器4，吸满洗脱溶液(can/h2o＝60/40)，将柱管从第一根注射器上取下后与此注射器4连接，然后缓慢推动注射器活塞，使得洗脱馏分滴液6下落，并使得馏分液滴点落在maldi靶板5上，然后逐点加入辅助基质dhb，从而完成靶板5制备。将靶板5送入质谱中，质谱实验在4700proteomicsanalyzer(美国ab公司)上完成，激光为nd-yag激光，波长355nm，激光脉冲频率200hz，加速电压20kv，正离子模式，反射式tof检测，质谱数据提交mascot搜库检索，所得质谱图如图5所示。

本发明使用单颗粒多孔硅球作为柱塞，可以实现柱床长度低于1mm。色谱填料量大幅度降低，削减了填料表面对样品分子的非特异性吸附，使得样品回收率大幅度提高，适用于微量及痕量珍稀生物样品的色谱分离及预处理。同时，由于超短柱床带来超低背压，该色谱微柱运行时无需外接高压驱动泵，只需连接注射器或手动泵即可完成流动相的输运和色谱洗脱。该色谱微柱使用时可与光学检测器相连或使用手动泵，采用边洗脱边点板的形式与基质辅助激光解吸电离(maldi)质谱相连进行检测鉴定，缩短了实验时间，大幅度节省了仪器成本。